辣椒蛋白质组的变化(一年生辣椒绿桃蚜诱导的叶片(桃蚜苏尔寿公司)

背景

蚜虫攻击诱导植物产生防御反应，激活多种信号级联，导致有毒、排斥或抗营养化合物的产生，进而重组植物的初级代谢。胡椒粉(一年生辣椒L.）叶片蛋白质组学反应桃蚜（Sulzer）已经通过LC-MS / MS与生物信息学工具进行了研究和分析。

结果

利用夹笼侵染一片单叶的低密度蚜虫（20个蚜虫/株）导致6个与对照叶相关的差异表达蛋白（2个位置3个蛋白） 感染后4天和3种蛋白质 感染后天数）。相反，当植株受到高密度的侵染（200蚜虫/株）时，140个蛋白质相对于对照叶片（97个蛋白质在2 感染后第4天，112个蛋白质 感染后7天和105个蛋白质 感染后天数）。蚜虫攻击改变的蛋白质主要参与光合作用和光呼吸、氧化应激、翻译、蛋白质折叠和降解以及氨基酸代谢。其他蛋白质涉及脂质、碳水化合物和激素代谢、转录、转运、能量产生和细胞组织。然而，直接参与防御的蛋白质却很少，并且在蚜虫的反应中大部分被下调。

结论

在低蚜虫密度的实验中，发现了数量出人意料的极低的调节蛋白，这表明蚜虫主动减轻了植物的防御反应，或者是蚜虫保持不被植物发现的策略。

在高蚜虫密度下，辣椒叶片蛋白质组发生了显著的变化，表明植物初级代谢的几乎所有途径都发生了改变。光合作用是迄今为止受蚜虫调控的蛋白质数量最多的过程。

一般来说，侵染时间较短(2天)，大部分蛋白表达上调。但侵染时间较长时(7天)，蛋白质水平下降占优势。

涉及植物防御和激素信号转导的蛋白质是稀缺的，大多是下调的。

蚜虫（半翅目：蚜科）由于其巨大的繁殖潜力和独特的韧皮部取食策略，是对作物生产危害最大的害虫之一。在已知的4000多种蚜虫中，约有250种对全世界农业构成重大威胁[1，2］．它们可以通过消耗光同化物和注射可能具有植物毒性的唾液腺分泌物，直接造成损害和降低农业产量，还可以影响植物激素平衡，改变对它们有利的宿主代谢，干扰植物的生理功能[1，3.，4，5］．蚜虫攻击的迹象和症状可以是多种多样的(褪绿、坏死、枯萎、发育迟缓和新生长畸形)，因此，宿主的分子反应可能是特定于某种植物-蚜虫相互作用的[6，7］．此外，他们的直接效果，蚜虫蜜露排泄物可以在植物损害光合作用和促进真菌疾病的发展中进行足够的影响[4，5]蚜虫也是植物病毒的载体，传输迄今描述的所有植物病毒物种的近30％[8]. 所有蚜虫种类之间桃蚜(苏尔泽)，绿桃蚜虫，特别突出的是高度多食性。它以超过400种植物为食，属于近50个植物科，影响几个重要的农业和园艺作物。此外,M. persicae.是100多种病毒疾病的载体[9是一种发展了更多抗药性机制(至少六种)的蚜虫[2］．因此，鉴定调节植物抗性或耐受性和限制蚜虫侵扰的因素是重要的。

植物已经进化出了复杂的防御系统来保护自己免受昆虫食草动物的攻击，其中一些是构成性表达，而另一些只有在食草动物攻击后才诱导产生。食草动物诱导的防御是通过识别昆虫的口腔分泌物和来自受伤植物细胞的信号而开始的，然后由复杂的信号网络介导，其中包括受体/传感器、钙(Ca^２＋)、激酶级联、活性氧(ROS)和植物激素信号通路。植物防御通常被归类为直接防御，如果它们对食草动物有影响，或被归类为间接防御，如果它们增强了食草动物天敌的吸引力。在直接防御之间，极其重要的是具有毒性、排斥或抗营养特性的植物代谢物的巨大多样性，如硫代葡萄糖苷、生物碱、萜类、酚类或蛋白酶抑制剂，这里只提一些[10，11，12］．这种防御化合物的积累通常与昆虫攻击后的初级代谢的重大改变有关，这可能提供能量，减少当量，和支持防御反应的碳骨架[13，14]. 此外，初级代谢的重新配置可以支持植物耐受草食的生理调整，减少草食攻击的负面影响，一些初级代谢产物本身也可能具有防御作用[13］．然而，由于昆虫也可能为了自己的利益而操纵植物的初级代谢，因此很难确定观察到的变化是否是植物的适应性反应[14］．

植物与蚜虫的相互作用在转录水平上得到了广泛的研究，揭示了蚜虫诱导宿主植物的转录重编程。它们调节涉及信号转导、蛋白质合成、修饰和降解、维持细胞结构和稳态、光合作用和次级代谢的植物序列[15，16，17］．然而，现有数据显示，转录本水平与其各自功能产物(蛋白)之间的相关性较差，因此质疑使用mRNA谱图数据来阐明植物表型的相关性[7，18］．蛋白质的表达水平不仅取决于基因的转录速率，还取决于其他的控制机制，如mRNA的稳定性、剪接、翻译调节、翻译后处理、蛋白质周转控制、蛋白质降解或这些的组合[19，20.］．在这种情况下，蛋白质组学最近成为转录组学在植物-食草动物相互作用研究中的补充工具[20.，21，22，23］．然而，植物对蚜虫的蛋白质防御机制还知之甚少，一些研究仅限于植物与蚜虫的相互作用。

Solanaceae是Poaceae和Fabaceae后植物王国最具经济重要的家庭。在茄科岛，蛋白质组学研究一直专注于番茄（42％），然后是土豆（28％）和烟草（20％）[18］．最近的一些研究针对辣椒叶片蛋白质组在非生物胁迫下的变化进行了研究[24]，病原体[25，26，27),激素(28]幼虫口腔分泌物[29]. 然而，据我们所知，迄今为止还没有对辣椒植物对昆虫取食的反应进行蛋白质组学研究。本文利用无标记蛋白质组学技术，结合生物信息学工具，对甜椒叶片蛋白质组反应进行了研究(一年生辣椒L.）至M. persicae.侵犯．了解植物如何在蛋白质组学水平对蚜虫进行响应，将提供更好地管理农业害虫的工具。

我们研究了胡椒叶蛋白质组反应M. persicae.虫害遵循两种不同的方法。当植物受到蚜虫侵染的初始低密度（20个蚜虫/株）的侵染，并利用夹子笼在局部水平上研究反应时，相对于对照叶片，只有6个蛋白质产生差异表达（3个在2 dpi处，3个在4 dpi处）（表1）1). 相反，当植物受到高密度蚜虫（200个蚜虫/株）侵染时，在整个试验过程中（2 dpi时为97个，4 dpi时为112个，7 dpi时为105个），140个蛋白质相对于对照叶片产生差异表达（表1）2,无花果。1)．附加文件中提供了具有蛋白质鉴定，蛋白质丰度和其功能注释参数的调节蛋白质的完整列表1一些特征谱在附加文件中显示2．

在本研究中发现了一种普遍的模式，在低密度和高密度蚜虫侵染下，大多数蛋白质在短时间内上调，但随着侵染的进展下调(表)1和2)．此外，在侵染的各个时间点，受调控的蛋白之间重叠较差(图。2). 在叶盘的情况下，任何调节蛋白在实验的不同时间点之间共享（图。2a） 而在高密度蚜虫侵染的情况下，不到一半的蛋白质（48.6%）在整个实验过程中受到显著影响（图。2b).中心时间点(4dpi)是调控蛋白数量较多的时间点(图5)。2b） 它也代表了蛋白质组反应的一种中间状态，在蚜虫侵染的较短（2dpi）和较长（7dpi）时间内，蛋白质的数量或多或少相等。大多数受调控的蛋白质与光合作用、应激和防御、翻译、蛋白质折叠和降解以及氨基酸和碳水化合物代谢等功能类别相匹配（表1）1和2). 蚜虫侵染后诱导/抑制代谢途径的时间过程的示意图如图所示。3.．

本研究中两种不同的方法对蚜虫侵染的测定结果有很大的不同。使用夹笼的蚜虫密度低，局限在特定的叶子区域，引起了这些植物细胞蛋白质组的微小局部变化。这种明显的植物反应的缺失与先前的蚜虫局部降低植物抗性的行为证据是一致的[30，31]可能是植物防御反应积极缓解的结果。例如，一种免疫抑制的蚜虫唾液蛋白在靠近蚜虫花柱的叶肉细胞中表达，但在远离蚜虫取食点的细胞中不表达[32]. 此外，蚜虫不断向植物组织分泌唾液，唾液中含有多种蛋白质，有助于花柱穿透，转移或抑制植物的防御，以维持其成功取食[1，3.，33，34］．另一种选择是，蚜虫可能不会被植物注意到，因为它们的“隐秘”取食模式只涉及有限的植物组织损伤，因为它们通过外质体路径穿透植物组织，在韧皮部筛元素中建立取食点。

相反，高密度的侵扰引发了辣椒叶的大蛋白质组改变。然而，值得注意的是，在这种情况下，植物的所有叶片被侵染并收集，以进行分析，因此在全身水平中研究了蛋白质组变化。这一因素可能导致两种实验中观察到的差异。

在我们的研究中，大多数蛋白质只是瞬时调控。这突出了在蛋白质组水平上研究植物-昆虫相互作用时，包括时间过程实验的相关性。观察到的动态蛋白表达模式可以归因于昆虫攻击后的一连串事件，这涉及信号分子之间的整合串音，如Ca^２＋、ROS、蛋白激酶和植物激素[35，36]. 此外，它还可能反映植物防御反应的调整，以处理成功侵染的进展和/或蚜虫在长期取食期间抑制某些植物防御反应的能力[7，37］．

在下面的章节中，我们将根据辣椒叶蛋白质组在植物-蚜虫相互作用中的可能作用，总结观察到的变化。对蚜虫侵染后不同代谢途径的诱导或抑制的讨论是基于属于这种代谢途径的一组蛋白质的丰度。然而，进一步的功能分析将是必要的，以确认特定的蛋白质在植物防御蚜虫的作用。

光合作用和光呼吸

虽然有一些良好的文档记录异常,减少光合作用的一般模式对昆虫饲养观察,由实际测量光合作用速率的变化,photosynthesis-related基因表达,或生产的蛋白质部分光合仪(14]. 此外，鉴于没有必要去除叶片物质，并且茉莉酸（JA）信号通路是光合活性降低所必需的，这似乎是昆虫取食期间的一种活跃的植物反应，而不仅仅是代谢限制的副作用[15，38］．在本研究中，几乎半（47.9％）的调节蛋白质是叶片（表2；额外的文件1). 电子传递链（Prot。5-9、11-15）在蚜虫取食2-7dpi时上调。有趣的是，通过光系统成分的上调维持或上调光合能力与小麦对俄罗斯麦蚜的耐性有关(Diuraphis NoxiaMordvilko) [39，40]. 然而，我们检测到析氧复合物或水分解复合物（Prot。和光系统II反应中心的一个亚单位。4） 在蚜虫侵染的植物中，尤其是在4-7dpi之间，叶绿体ATP合酶（Prot。104、105）被下调。此外，叶盘（Prot。A） 是的。总的来说，虽然需要更多的功能研究来揭示这些光合速率变化的影响，结果表明水的光氧化过程，蚜虫侵染可能会损害能量和电子的转移以及光合磷酸化（发生在光合作用的光反应过程中）。

气体交换测量与荧光技术相结合表明，蚜虫取食降低了大麦的光合速率，主要是通过碳链/暗反应，特别是核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧合酶（rubisco）活性和核酮糖-1,5-二磷酸再生[41］．Rubisco是通过Calvin-Benson循环或光呼吸介导碳利用的主要蛋白质。与其他研究相比，响应于蚜虫饲料的催化或下调的其他研究[42，43，44]在整个实验过程中，我们没有检测到rubisco含量的变化。然而，与rubisco组装有关的蛋白质（Prot。17，18）在7dpi下调，表明长时间蚜虫侵染后rubisco活性可能降低。光呼吸传统上被认为是一种浪费的过程，它是一种用来解毒rubisco反应失败产生的2-磷酸，并循环利用碳来推动Calvin-Benson循环的方法。然而，越来越多的证据表明，光呼吸途径在植物生长发育和对非生物和生物胁迫的反应中起着重要作用，因为它与多种初级代谢途径相互作用[45，46］．在本研究中，我们检测到一些参与光呼吸的蛋白(Prot. 24 - 26,35)在蚜虫侵染的植物中表达上调。相反，一个CP12蛋白(Prot. 19)显著下调，特别是在侵染时间较长时。CP12是调节卡尔文-本森循环的关键蛋白，因为它通过形成超分子复合物GAPDH/CP12/PRK协调酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和磷酸核苷激酶(PRK)的可逆失活[47］．综上所述，植物的光合作用和光呼吸作用在蚜虫取食过程中受到动态而复杂的调控，这可能与植物的代谢产物从正常生长和繁殖过程中向防御功能的重新分配有关。

氨基酸和碳水化合物代谢

蚜虫需要摄取大量的韧皮部汁液来满足它们的饮食需求，这反过来可能会改变植物的源库关系和水分关系[4，17］．此外，蚜虫可能通过诱导参与碳(C)和氮(N)同化和动员的酶来改变植物的新陈代谢，使韧皮部汁液组成适应于它们自己的利益[17，48，49]. 因此，在本研究中，与氨基酸和碳水化合物代谢相关的酶在蚜虫攻击时调节的蛋白质中高度表达（表1）2). 氨基酸在植物-蚜虫相互作用中起着双重作用，是昆虫生长的主要限制性营养物质，也是许多植物防御化合物产生的前体[14]. 在以前的研究中，我们发现在高蚜虫密度的侵扰下，辣椒叶片中的游离氨基酸含量显著增加[50］．因此，涉及丝氨酸，甘氨酸，甲硫氨酸，赖氨酸，赖氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苏氨酸和谷氨酸（Prot。24-30,32）的生物合成中的几种酶在本研究中的蚜虫侵染植物中上调。

蚜虫取食导致叶片过早衰老，表现为衰老相关基因的表达、失绿和细胞死亡[51]. 诱导衰老被认为是蚜虫刺激游离氨基酸释放到韧皮部和/或操纵库-源关系以允许更多的氮转运到受侵染叶片的一种策略[3.，14]. 然而，这也可能是植物参与的一个过程，以对抗蚜虫改变资源分配的能力，从而控制蚜虫侵染的严重程度[9]. 与Carrillo等人[48]在蚜虫侵染的植物中，我们没有检测到衰老相关蛋白的诱导。然而，我们发现了一些可能与这个过程有关的表型变化。衰老过程中发生了一系列协调的连续事件，包括大分子的降解、蛋白质合成代谢的减少、营养物质的重新分配和叶绿体的解体[52]. 由于叶绿体是叶片中含氮分子的主要来源，因此在这些细胞器中观察到最早的结构、生化和代谢变化也就不足为奇了[52］．在本研究中，膜相关蛋白VIPP1 (Prot. 99)从4 dpi开始被强烈下调，这可能表明叶绿体的解体，因为它在叶绿体膜的生物发生和维持中起着关键作用[53］．此外，57.1％的调节蛋白在7dpi下调，几乎一半（46.3％）是叶片（表2；额外的文件1). 有趣的是，所有参与转录的蛋白质（Prot。47–51）和转录后控制（Prot。132）和一些核糖体蛋白（Prot。53, 55, 58, 59, 62, 63). 三种蛋白酶（Prot。72–74）和蛋白酶体系统的一个亚单位在2和4 dpi时上调。然而，所有检测到的蛋白酶体系统（Prot。75–77）与S期激酶相关蛋白1（Skp1，Prot。78），这是泛素介导的蛋白质分解代谢过程所必需的。此外，丝氨酸蛋白酶抑制剂在4dpi（Prot 79）上调。因此，似乎内源蛋白的水解在蚜虫侵染时受到密切的调控，这被认为有助于植物的多层次防御[42］．

作为蛋白质分解代谢的结果，有毒的铵被释放，必须立即通过谷氨酰胺合成酶(GS) /谷氨酰胺氧戊二酸转氨酶(GOGAT)途径重新同化为有机分子[52，54］．由于三羧酸(TCA)循环的早期阶段是GOGAT碳骨架的主要来源，氮同化速率的增加很可能需要通过呼吸途径增强通量[54]. 因此，参与TCA循环的NADP依赖性苹果酸酶在蚜虫侵染的植物中上调。35）以及线粒体二羧酸/三羧酸转运体DTC（Prot。112），在光呼吸和铵同化过程中也参与甘油酯的产生[55］．广泛接受GS / Gogat系统作为占据叶N新陈代谢的中心位置，然而，其在转录后水平的调节较差[56］．有趣的是，我们发现ACR11和ACR12 (Prot. 33和34)在4 dpi之后被下调。这些蛋白已被证明可以提高GS2的活性拟南芥并相互作用并稳定铁氧还蛋白(Fd)-GOGAT1，可能调节其活性[56，57］．此外，ACR11已被证明可以调节ROS和SA的积累拟南芥并在病原体抵抗中发挥作用[58］．

脂质和激素代谢

植物脂类除了作为细胞膜的主要结构成分外，还是抗生素化合物和信号分子的前体[9，59］．在拟南芥。桃蚜系统，抗血糖和抗凸透塞需要缺乏4（编码脂肪酶样蛋白）的植物肺素4（pAD4）MYZUS PERSICAE-诱导型脂肪酶1（MPL1，具有脂肪酶活性）仅用于抗菌[9，60]. 有趣的是，一个GDSL酯酶/脂肪酶（prot43）在蚜虫侵染的植物中从2dpi开始强烈上调。一些GDSL脂肪酶对植物免疫有调节作用[61，62]，特别是在辣椒中，gdsl -脂肪酶1通过调控发病相关蛋白4 (PR-4)表达，参与茉莉酸甲酯(MeJA)和/或伤口反应的信号通路[63]. 此外，一种与脂肪酸生物合成有关的酶（Prot C）在2 dpi时在叶盘中上调。ω-3脂肪酸去饱和酶7（FAD7）功能的破坏增强了植物对蚜虫的防御[64]而是通过α-双加氧酶1的表达[65]，强调了脂肪酸代谢在植物对蚜虫的防御反应中的相关性。相反，与类异戊二烯生物合成过程相关的酶(Prot. 41)在4和7 dpi时被强烈下调。

植物对蚜虫的反应似乎受到JA、水杨酸(SA)、乙烯(ET)、脱落酸(ABA)和赤霉素(GAs)等信号通路的调控[9，66］．然而，“诱饵”假说认为，蚜虫通过路径串扰来操纵植物的防御反应，以抑制可能更具有生物学效应的ja信号通路[17］．茉莉酸是通过脂肪加氧酶(LOX)在叶绿体中氧化脂肪酸亚油酸，通过十八烷途径合成的。在我们的研究中，13-LOX (Prot. 129)从2 dpi上调至7 dpi，但参与JA生物合成进一步步骤的过氧化物酶体3-酮酰基辅酶a硫代酶2 (Prot. 73)从2 dpi开始强烈下调。根据我们的结果，丙烯氧化物合酶(也作用于LOX的下游)在蚜虫感染的小麦植株中导致了下调[42］．此外，还在2 dpi向上下调了涉及气体生物合成途径（Prot.46）的蛋白质。气体由在2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸盐途径中合成的等异细胞结构块形成[67]我们还检测到该途径的一种酶（Prot。41）在蚜虫侵染的植物中表达下调。

压力和国防

抗氧化解毒系统

活性氧在调节植物适应和防御反应的信号通路中起着重要作用。由活性氧生成引起的“氧化爆发”是植物对许多非生物和生物胁迫的一种快速而常见的反应，包括蚜虫的食草性[36，38，66，68］．然而，由于ROS的积累通常对细胞有害，植物必须在产生ROS以防御和产生ROS清除者以稳定植物组织之间找到平衡[17]. 近年来的研究表明，ROS清除酶和非酶抗氧化剂不仅具有维持ROS稳态的功能，而且在植物对环境胁迫的适应过程中也参与ROS依赖性信号转导[68]. 因此，观察到蚜虫取食可以诱导某些抗氧化酶的表达，同时抑制单个植物物种内其他抗氧化酶的表达并不奇怪[17，42，69］．在本研究中，我们在蚜虫调控蛋白中获得了一个较强的氧化应激相关蛋白表达(Prot. 81-88)。但在2 dpi时，只有2种(Prot. 82和84)积累，其余的含量在较长时间(4和/或7 dpi)中保持不变或低于对照水平。这些酶的合成减少被认为是植物提高活性氧水平的一种防御策略，活性氧对昆虫是直接有毒的[49］．然而，考虑到辣椒使用的时间较晚，ros清除酶的下调似乎与辣椒的敏感性有关，而不是与对蚜虫的防御有关。因此，小麦对蚜虫侵害的抗性与其通过提高抗氧化酶的水平和活性来控制ROS水平的能力密切相关[70，71］．另一种应对蚜虫侵袭的蛋白质是乳酰谷胱甘肽裂解酶(Prot. 89)，它通过催化各种芳香和脂肪族α-酮醛(如甲乙二醛)转化为α-羟基硫酯，在细胞中发挥关键的解毒作用[72］．乳酰谷胱甘肽裂解酶在2 dpi时上调，但在4 dpi后明显降低。这种降低作用可以解释为植物试图维持对蚜虫的有毒环境[48］．

陪伴

分子伴侣是细胞内稳态的关键组成部分，在一些正常的细胞过程中负责蛋白质折叠、组装、易位和降解。由于大量的应激会导致蛋白质功能障碍，伴侣蛋白通过协助蛋白质重新折叠和防止非天然蛋白质的聚集在细胞存活中发挥着关键作用[73］．在本研究中，一系列具有伴侣活性的蛋白(Prot. 66-70, 72, 90-92)在蚜虫侵染过程中受到调控。这些蛋白在侵染时间较短(2 dpi)时表达上调，但在侵染7 dpi时表达下调或不变。这些蛋白质在长时间的感染后不会上调，这一事实可能是蚜虫操纵植物代谢的一部分，以促进蛋白质中氨基酸的释放，以改善其摄食[48］．

直接和间接防御

一种过氧化氢裂解酶(HPL, Prot. 94)在2 ~ 7 dpi范围内显著上调，可能在辣椒防御中起重要作用。HPL能裂解LOX产生的13-氢过氧化物，产生绿叶挥发物(GLVs)和创伤激素(12-氧化十二烯酸)，这是参与损伤组织愈合的创伤激素[74]. 在转基因马铃薯植株中，HPL的缺失大大降低了GLVs-己醛和3-己烯醛的含量，并与蚜虫行为的增加相关[75］．相反，我们检测到两种与防御相关的蛋白在2 dpi时表达上调或不变，但在侵染时间较长时(4 dpi和7 dpi)表达强烈下调，即基洛拉蛋白(kirola protein, Prot. 93)和含有CBS结构域的蛋白(CDCP, Prot. 95)。Kirole与主要乳胶/成熟相关(MLP/RRP)家族成员具有最高的序列特征[76]它的折叠与发病机制相关（PR）-10蛋白的折叠非常相似[77］．有趣的是，辣椒植物中的一种类似基罗拉的蛋白质也在白蝇的反应中上调Bemisia Tabaci.［78),在烟草被感染的sp植物B烟粉虱［79]和病毒[78，80］．另一方面，CDCPs可能在植物的胁迫响应/耐受和发育中发挥关键作用[81，82，83］．具体来说，一个编码CDCP的基因(OsBi1)与水稻对吸食性褐飞虱的抗性有关(褐飞虱圣约翰[84］．我们的研究结果与其他研究的结果一致，这些研究表明一些在植物对蚜虫侵害的防御中起直接作用的蛋白表达下调，如受体样蛋白激酶和富含羟基脯氨酸的糖蛋白拟南芥［44]或者小麦中的昆虫特异性防御蛋白Hfr-2[42］．

其他流程

信号网络

在植物中,^２＋作为细胞内的第二信使，通过与各种钙离子的结合，对维持细胞内稳态和信号转导途径尤为重要^２＋传感器的蛋白质。其中包括钙调素，钙调素结合蛋白，钙依赖蛋白激酶(CDPKs)和其他钙^２＋结合蛋白(12，36]. 在本研究中，两个Ca^２＋-结合蛋白在蚜虫侵染时受到调控。Calnexin同源物1（Prot。66），在2 dpi和4 dpi时强烈上调，在7 dpi时恢复控制水平，而钙调素-7样（Prot。130）在2 dpi时表达上调，但在4和7 dpi时含量显著降低，这可能是蚜虫影响植物反应的结果[7，49]. 虽然我们没有检测到任何由蚜虫侵染调控的CDPK，但是一种类似于14–3-3蛋白6（Prot。131）在2 dpi时上调。最近的研究表明，CDPKs与14-3-3蛋白之间存在复杂的调控网络，它们在植物信号转导途径中起着协同作用[85］．14-3-3蛋白与靶蛋白结合并调节其活性、稳定性、亚细胞定位或参与蛋白复合体，在植物的许多生理过程中发挥关键作用，包括细胞生长和分裂、初级代谢、对光的反应、非生物和生物的应激反应，并参与几乎任何植物激素介导的过程[85，86，87］．有趣的是，14-3-3蛋白6在4和7 dpi时被强烈下调，正如钙调蛋白7所注意到的那样。最后值得一提的是，在2 ~ 7 dpi的蚜虫侵染植物中，remorin (Prot. 114)也被下调。Remorin蛋白可能作为调控信号转导的分子支架，已被提出参与植物-微生物细胞信号转导[88］．

运输

蚜虫对蚜虫攻击的防御反应伴随着细胞运输和胞吐相关序列的激活[16]考虑到产生的许多防御相关蛋白是合成的，然后由高尔基体分泌到细胞内的各个目的地[20.］．越来越多的证据也表明，分泌途径在植物防御反应中起着更直接的作用。在拟南芥，蛋白质分泌途径的诱导是系统获得性抗性所必需的[89]. 此外，最近的一项研究拟南芥-M. persicae.系统显示蚜虫效应Mp1与宿主空泡蛋白分选相关蛋白52 (VPS52)，一个运输途径蛋白，促进侵染[90］．在本研究中，参与囊泡介导的转运和细胞内蛋白转运的辅原子亚基γ (Prot. 100)在蚜虫侵染的植物中在2和4 dpi时显著上调。此外，信号识别粒子43 kDa蛋白(Prot. 101)和TIC110蛋白(Prot. 102)在2 dpi时表达上调或不变，但在4和7 dpi时表达下调。而patellin 3-like protein -结合磷脂并在植物中多种信号通路中发挥作用[91]-在7 dpi时上调。

成长与发展

当植物的生长和防御对环境和发育线索做出适当的优先反应时，植物的适应性就会得到优化[92，93］．在本研究中，一种早期结节样蛋白(ENODL;Prot 101)在2dpi时上调。类根瘤蛋白调节植物的生长发育，参与不同营养物质、氨基酸、激素和溶质的运输[94］．有趣的是，Enodl基因的等位基因变异影响昆虫群落种类的多样性和互动基础物种的丰富性：蚜虫和趋势蚂蚁[95]. 另外，三种烯醇化物蛋白可能增加了Bt水稻对褐飞虱侵染的抗性[96］．这表明ENODL蛋白可能影响不同的植物-昆虫相互作用。

LC-MS/MS分析结合生物信息学技术，是研究辣椒叶片蛋白质组响应的有力手段M. persicae.侵犯。发现意外地非常低的蛋白质（6）蛋白被发现在叶片椎间盘的实验中调节，即使在局部水平研究了响应，导致我们假设蚜虫是防止植物防御反应的激活至少在该工作中研究的特定植物蚜虫系统中，植物未被发现。相反，辣椒植物中的系统性高密度的蚜虫侵染引起了一组140蛋白，由于蚜虫存在而在叶中差异调节。这些蛋白质属于几乎所有的植物初级代谢途径，包括光合作用，光素，氨基酸和碳水化合物代谢，翻译，蛋白质折叠和降解，能量产生，并表明在蚜虫虫叶片中发生的大代谢重编程。到目前为止，光合作用是通过存在蚜虫的存在调节较多蛋白质的代谢过程。实际上，大量（48％）的调节蛋白质是叶绿体，其突出了该细胞器在植物对蚜虫的反应中的相关性。其他方法如氨基酸和碳水化合物代谢或蛋白质折叠和降解同样受到蚜虫存在的影响。考虑到受管制蛋白的变化及其行为的程度，我们还可以得出结论，在短时间内的侵扰（2天），大多数变化的蛋白质被上调。在4 dpi下，在更长的时间（7dpi）下，上调和下调蛋白质中的比例几乎平衡，大多数蛋白质被下调。 It is worth noting that proteins directly involved in defense were scarce and mostly downregulated in response to aphid infestation, just as proteins involved in hormone signalling pathways. This slight defensive response elicited in pepper plants may be ascribed to the susceptibility of this species to aphids. Collectively considered, the results outline a significant metabolic drift in the pepper plant in favour of the feeding requirements of the aphids. Whether this metabolic drift is directed by elicitors derived from the aphid is a matter for further research. Furthermore, the leaf proteomic information obtained in the present study will help to the understanding of the defense response of an important agricultural crop to aphids.

植物材料

辣椒植物（C一年生植物来自西班牙穆尔西亚Ramiro Arnedo S.A的加利福尼亚奇迹种子在塑料盆中发芽，泥炭(Prohumin盆栽土，Projar S.A, Valencia，西班牙)和蛭石1:1的混合物。在24°C和70%相对湿度的生长室内，在16:8小时的光周期(白天/晚上)下保存。植物每周浇水三次。

蚜虫侵袭

一个M. persicae.如前所述，菌落维持在辣椒植株上[50］．已经进行了两种独立的试验:一种是在夹笼的帮助下，将蚜虫密度低(每株20只)限制在单叶上(见下文描述)。在第二个试验中，蚜虫密度高(每株200只)，不受移动限制。两种试验均在播种后5周开始，无翅成蚜侵染辣椒植株。

夹笼单叶蚜虫

将20只蚜虫放在第二片真正的叶子的背面，然后将它们关在一个夹笼中(BioQuip产品公司。美国)，从而阻止它们在整个工厂自由移动。蚜虫的侵袭是交错发生的[97]，使所有组织样品同时被收获，以避免衍生自昼夜循环和/或环境条件变化的偏差。在侵扰后3小时（HPI），侵染后2天（DPI）和4 dpi，收集样品。还包括在未收集的植物上由未被捕获的植物组成，该植物接受与蚜虫侵染植物相同的时间段。在实验结束时，切断笼子下的叶面积，蚜虫刷掉。然后将所得叶片在液氮中冷冻并在冷冻干燥之前储存在-80℃。将组织最终接地并在4℃下储存到气密小瓶中直至提取。每个时间点包括四个生物重复，每一点都包括在两种植物的合并样品上。

没有运动限制的高密度蚜虫侵扰

200只蚜虫均匀地分布在整个植株上，它们的活动没有任何额外的限制。这种高密度的蚜虫被用来确保对所有植物的叶子的侵害。侵染的植物被围网，以避免蚜虫在处理间的转移。注定要作为实验对照的植物也在同一时期被封闭在一个网中，但没有蚜虫。如上所述，在2 dpi、4 dpi和7 dpi采收植株叶片组织。实验结束时，将蚜虫掸去，收集植株全部充分展开的叶片。同时采集所有植物材料，速冻液氮，冷冻干燥，接地。每个时间点包括四个生物重复，每一点都包括在两种植物的合并样品上。

蛋白质提取与定量

根据TCA（三氯乙酸） - 苯酚方法制备总蛋白质提取物[98］．干燥的颗粒在6 M尿素中溶解，用RC/DC法(BioRad，美国)测定蛋白质浓度。用牛血清白蛋白(BSA)建立标准曲线。

胰蛋白酶的消化在溶液中

50微克蛋白质样品用5 0.2μL M-二硫苏糖醇，然后孵育1小时 h 37岁 °C和S-烷基化 0.2μL 间碘乙酰胺，然后孵育1小时 在室温的黑暗中。然后，25 加入mM碳酸氢铵缓冲液，使尿素浓度降至0.6 M对于溶液消化，将胰蛋白酶添加到蛋白质混合物中（酶与底物的比例为1:30 w/w）并在37℃下培养 16°C H为了确保完全消化，向样品中添加额外的胰蛋白酶（1:60，w/w），并将其培养5天 h更多。然后用高速真空离心机干燥胰蛋白酶肽，然后在5%乙腈和0.5%三氟乙酸中再悬浮。得到的肽被脱盐，一批30个 μg蛋白质，通过PepClean C-18旋转柱，符合制造商建议（安捷伦科技）。最后，将洗脱的肽干燥并在10分钟内再悬浮 μL第一液相色谱流动相（5%乙腈和0.1%甲酸）。

LC-MS/MS分析

对处理组和未处理组的样品进行4个技术重复的分析，以实现无标记相对定量。肽分离使用Agilent 1290 Infinity LC系统，耦合到6550 Accurate-Mass QTOF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)，带有电喷雾接口(Jet Stream Technology)，在正离子模式(3500 V)和高灵敏度模式下进行。电喷雾界面的最佳条件为:气体温度250℃，干燥气体14 L/min，雾化器35 psi，护套气体温度250℃，护套气体流量11 L/min。样品在Agilent Advance Bio Peptide mapping柱(2.1 × 250 mm, 2.7 μm)上(Agilent Technologies)进样(10 μL)，溶剂B(0.1%甲酸在90%乙腈中)梯度为3-40%，流速为0.4 mL/min, 50℃，140 min。数据采集采用安捷伦海量猎人工作站软件。LC/MS Data Acquisition B.08.00 (Build 8.00.8058.0)采用Auto MS/MS，选取300-1700 m/z质量范围内(超过1000次阈值)强度最大的20个离子(电荷态，2-5)进行MS/MS分析。将四极杆设置为“窄”分辨率，获得MS/MS光谱(50-1700 m/z)，直到总数达到25,000次或最大积累时间为333 MS。为了确保所记录离子所需的质量精度，在分析过程中使用信号m/z 322.0481(检测到的m/z [C6H18N3O6P3−H])进行了连续的内部校准。⁺)和m/z 1221.9906(检测到m/z [C24H18O6N3P3F36 -H]⁺)．

质/ MS数据分析

蛋白质识别

光谱的提取工具机工作台蛋白质组学启B.04.01.141(安捷伦科技)是用于处理MS / MS谱数据和确定单一同位素的质量和电荷状态,合并MS / MS谱具有相同前体(Δm / z < 1.4 Da和色谱Δt < 60年代),选择高质量的光谱。对象搜索缩减后的数据集一年生辣椒使用MS/MS Search工具在鉴别模式下使用NCBInr数据库，设置如下:胰蛋白酶，最多2个错过的裂解，半胱氨酸氨基甲基化作为固定修饰，甲硫氨酸氧化作为变量，前体的质量耐受性为±20ppm，产品离子的质量耐受性为±50ppm。前驱体的质量位移设定在−18 Da到177 Da之间，以考虑钠和钾加合物的存在等可变修饰。肽命中值在肽模式下进行验证，以达到< 1.2%的假发现率(FDR)，然后在蛋白质模式下根据制造商推荐的评分设置进行验证。只有当两个或两个以上的肽段匹配时，才考虑阳性识别，它们的总评值为> 20。

统计分析

对于无标记相对定量，差异表达蛋白的评估基于肽调节。用Perseus软件从正态分布(宽度:0.3，下移:1.8)计算蛋白质强度的缺失值[99］．蛋白质列表导出到Mass Profiler Professional (MPP)软件v. 14.9.1 (Agilent Technologies)进行统计数据分析。根据MPP中作为实体的蛋白质的总光谱强度进行数据分析。根据它们的频率筛选实体，选择那些在至少一个处理的所有重复中始终存在的实体。

在使用夹子笼的实验中，比较不同样本的蛋白质表达水平涉及缓和T检验(p ≤ 0.05），每个时间点（3hpi、2dpi和4dpi）分别进行分析。另一方面，在高密度蚜虫自由移动的情况下，方差分析和Tukey-HSD事后检验（p ≤ 0.05）来比较不同治疗组之间的蛋白质表达水平（对照组vs 2 dpi vs 4 dpi vs 7 dpi）。在所有的案例中，Benjamini-Hochberg程序被用来克服多重测试分析（错误发现）的问题。蛋白质≥对照组的2.0倍变化，阳性或阴性，分别定义为上调或下调。

功能分类

Blast2GO v2.4.0（BioBam，西班牙瓦伦西亚）应用程序用于根据Martínez-Esteso等人详细说明的指示，自动分配蛋白质描述并从公共数据库的同源序列中提取注释[One hundred.]. 此外，注释扩展程序（annotation Expander，附件）对注释进行了扩充，它使用了一个额外的基因本体结构来建议新的生物过程和细胞成分注释。由Blast2GO执行的生物过程（P）、分子功能（F）和细胞成分（C）的注释被写下来并手动修改以保证准确的分配。然后，将蛋白质手动分配到以下14个功能类别之一：光合作用、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢、蛋白质折叠和降解、转录相关、翻译相关、能量产生、应激和防御、细胞组织、运输相关、激素代谢，其他未知函数。

通过骄傲将质谱蛋白质组学数据沉积在Proteomexchange联盟中[101]数据集标识符为PXD022459的伙伴存储库。https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/pxd022459.．

阿坝:

脱落酸

Ca^２＋：

钙

疾病预防控制中心：

含CBS结构域的蛋白质

CDPKS：

钙依赖性蛋白激酶

dpi:

天post-infestation

hpi公司：

小时post-infestation

ENODL:

早期结节样

电子技师：

乙烯

气体:

赤霉素

杰:

绿叶挥发物

GOGAT:

谷氨酰胺氧谷氨酸转氨酶

g:

谷氨酰胺合成酶

HPL:

过氧化氢裂解酶

热休克蛋白：

热休克蛋白的

是:

茉莉酸

液氧：

脂氧合酶

延时/ RRP蛋白质:

主要乳胶/催熟相关蛋白

惩罚:

茉莉酸甲酯

配对1：

纤溶酶原激活物抑制剂1 rna结合蛋白

PAMP时:

病原相关分子模式

PR蛋白:

Pathogenesis-related蛋白质

活性氧：

活性氧物种

二磷酸核酮糖羧化酶:

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶

南非：

水杨酸

TCA：

三羧酸

不适用。

本研究得到了Ministerio de Economía y Competitividad (Project CGL2016-79054-R)和阿利坎特大学(University of Alicante)对VFO的资助(UAFPU2013-5793)。本工作是VFO博士论文的一部分。资助机构没有参与研究的设计、收集、分析和解释数据，也没有参与手稿的撰写。

从属关系

1. uniidad Asociada CSIC-UA IPAB。阿利坎特大学生物多样性大学研究所Investigación CIBIO (Iberoamericano de la Biodiversidad)，西班牙阿利坎特圣维森特拉斯佩格分校e /n, E-03690

   Victoria Florencio-Ortiz & José L. Casas

2. 基因组学和蛋白质组学单位，ServiciosTécnicosDeintorigación，阿利卡特大学，Carretera de San Vicente del Raspeig，S / N，E-03690 San Vicente del Raspeig，阿利坎特，西班牙

   苏珊娜Selles-Marchart

贡献

vF-O和JL。C构思并设计了实验。V-F-O进行了实验。vF-O和S。S-M。分析了数据。vF-O起草了手稿。JL。C和S。S-M。批判性地修改了手稿。作者审阅并批准了最后的手稿。

相应的作者

对应到维多利亚·弗洛伦西奥·奥尔蒂斯．

伦理批准并同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

出版商说明

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