在火灾同时的挥发物和转录组分析下，将液态趋势的微尺度反应解释为双食草症攻击GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

atansy植物（GydF4y2BaTanacetum vulgare.GydF4y2BaL.）众所周知，其具有高抗内化的化学变异，尤其是来自萜类化合物组的挥发性有机化合物（VOC）。这些VOCS密切参与植物 - 昆虫相互作用，并且在分析时，可用于将植物分类为称为趋化型的群体。已经显示出来的植物嗜疗型相互作用，然而，迄今为止，没有任何信息可以通过多种昆虫物种同时同时草食性的响应。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

我们使用多杯系统来调查五种液体化学物质的反应来喂食和/或咀嚼食草动物（蚜虫和毛毛虫;GydF4y2BaMetopeurum fuscovirideGydF4y2Ba斯特罗扬和GydF4y2BaSpodoptera littoralis.GydF4y2BaBoisduval)。蚜虫侵染后，毛毛虫的食草性导致了植物中储存在毛状毛和挥发性有机化合物中的萜类化合物模式的化学类型特异性变化。植物化学型的转录组分析代表了在唐茜中转录组的第一次从头组装，并证明了蚜虫对后续草食植物的启动效应。总的来说，我们发现这五种化学类型对两种食草动物的反应并不相同。正如预期的那样，我们发现毛毛虫的摄食增加了VOC的排放，然而，先验的蚜虫侵害只导致某些化学类型的VOC排放进一步增加。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们能够以不同的方式表明不同的嗜胞型对两种食草动物攻击反应，并且当它们随后暴露于口服食草动物时，用蚜虫预处理对植物进行了启动效果。如果野外人口中的邻近化学物质与草食物/双重草食病不同，这可能会产生从个体层面到群体水平的影响。一些化学物质的个体可能比其他嗜热压力更有效地响应，并且在一个群体环境中，这些“更响亮”的嗜胞外群可能影响当地的昆虫群体，包括食草动物的天敌和其他邻近的植物。GydF4y2Ba

自然是由复杂的社区形成，其中植物发挥着核心作用。植物和植物拮抗剂如食草动物或病原体之间的相互作用会导致不断发展的防御机制和相应的努力来克服它们[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]. 植物是固着的有机体，因此已经发展出一种化学防御的武库来代替逃跑。这些植物次生代谢物由多种化合物组成，这些化合物在不同的物种和家族中差异很大[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]. 不同的防御化合物以不同的方式挑战植物拮抗剂：直接防御包括对食草动物有害的化合物（例如消化率降低剂和毒素）[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]），而间接防御可以作为吸引食草动物敌人的招聘驱动器[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］.参与间接植物防御的一组重要组化合物是挥发性有机化合物（VOC）。植物的VOCS排放通常是由食草攻击对植物的诱导的，但排放也可以是本构。VOCS在植物种类中也是化学高度多样化的，这可能导致植物群中和植物群中的化学型材（即趋化物）的大变化[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.萜类化合物，特别是单萜类和倍半萜类化合物，是植物界中发现的最大和结构最多样化的VOCs类化合物。萜类化合物是由萜类化合物衍生而来的天然有机化合物。大多数萜类化合物是含氧官能团的多环结构。虽然它们有时被称为“萜烯”，但萜烯还含有额外的官能团，其中大部分含有氧[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.萜烯合酶（TPS）基因家族负责这种大样的化合物，因为单个TPS酶可以催化多达10个不同的结构[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]. 挥发性有机化合物可在食草动物造成损害后立即排放，也可在数小时后诱发并排放[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］.用于评估植物 - 食草动物相互作用挥发排放的传统方法继续改善，具有更敏感的仪器来市场[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

许多研究已经研究了单一物种拮抗剂对植物挥发性排放的影响[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba]并发现植物的响应取决于造成的损坏的类型。例如，咀嚼食草动物，如毛毛虫通常诱导茉莉酸（JA）途径（用挥发性植物激素乙烯在协同作用中工作），而吸吮草食虫等蚜虫通常诱导水杨酸（SA）途径，这是最常见的生物养殖病原体[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］.咀嚼食草动物可以对植物组织造成重大损害，导致新陈代谢的大变化[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］.口香草食草导致对植物造成的损害程度取决于若干因素，包括幼虫阶段，植物 - 食草动物相互作用，侵扰阈值和物种的特殊/通风[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba］.相比之下，吸吮蚜虫等食草动物，导致造成不太明显的损伤，因为它们吸吮植物液体，并耗尽营养成分而不是破坏叶组织。然而，还观察到局部和全身叶子中防御途径的广泛诱导[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]咀嚼和吸吮食草动物。有趣的是，SA和JA途径之间的相互作用通常是拮抗性的，尽管也已经报告了添加剂或协同反应[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba］.这些植物激素介导的防御途径导致代谢物，转录组和蛋白质组的综合变化。本质上，植物往往受到几种不同的拮抗剂的攻击，越来越多的信息在攻击多种攻击食草动物或其他拮抗剂的植物的VOC响应中可以获得[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

越来越多的研究表明，一种食草动物或病原体的攻击可以诱导植物进入一种防御能力增强的状态[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］.转录，生理学和代谢水平可能发生变化，其有效地使植物能够更快或强烈地反应生物和非生物胁迫。这种防御灌注由一系列化学品介导，例如水杨酸和吡酸酸[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]、茉莉酸及乙烯[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]，杜鹃花酸[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]和各种挥发性化合物，包括甲基水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]绿叶挥发物[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]，和单调思[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］.VOCS越来越多地显示对防御引发和系统性反应很重要。例如，植物对伤害的快速反应包括脂氧合酶途径（LOX）产物的排放，称为绿叶挥发物，其包含不同的C6化合物，例如己酮和其他醛[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］.这些化合物在伤害压力的几秒钟内产生和释放，通常是短暂的，但在重复伤害或食草后，释放可以维持较长时间。VOCs还参与了植物诱导的系统免疫(称为系统获得性抗性，或SAR)，这是在植物暴露于局部病原体感染后，在整个植物中触发的。SAR的特点是在整个植物中积累大量的SA，而诱导的挥发性单萜是植物内SAR所必需的[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]，但最近有人提出，这些化合物也可以作为植物之间长距离SAR诱导的信号分子[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba］.由于不同类型的拮抗剂如咀嚼和吮吸食草动物可拮抗或协同的诱导防御途径，产生的问题是双方饲养行会攻击如何影响化学防御的诱导。虽然研究已经描述复杂的相互作用包括国防启动，我们还远远没有理解植物的复杂响应由多个草食动物攻击。GydF4y2Ba

Tanacetum vulgare.GydF4y2BaL.（Asteraceae），通常称为型型型材，是一种高度芳香的草药，其具有在叶面上储存在腺体中的三萜含量的广泛变化[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］.肉体植物可以根据萜类内容进行分组，形成化学物质[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba］.艾菊是否已被证明显著影响专业蚜虫物种在赛季早期的殖民统治期间(主要传播事件产生时翅膀的变种),然而未能影响蚜虫殖民在季节后期,当蚜虫unwinged和传播是通过步行只有[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.其中一种特殊的蚜虫是GydF4y2BaMetopeurum fuscovirideGydF4y2Ba斯特兰（蚜虫）。虽然GydF4y2Bam . fuscovirideGydF4y2Ba是专为唐茜而生的，对唐茜造成的伤害最小，可诱发水杨酸防御反应[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba］.虽然atansy趋化物影响蚜虫偏好[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]和现场的性能[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]，目前尚不清楚不同趋化物的植物对蚜虫攻击的反应不同。由于泰西不仅通过吸吮食草动物而且咀嚼食草侵害，所以嗜症型可能会在蚜虫引发如何影响植物对后续攻击的反应时差异。GydF4y2Ba

在本研究中，我们调查了在植物或未通过吸吮蚜虫的攻击时通过咀嚼食草动物来促进食草动物的疾病趋于攻击。可以立即发出损坏食草动物造成的损坏，或者可以在几个小时后诱导和发出[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.在这里，我们研究了两种来自不同食虫会的草食昆虫对挥发性有机化合物排放的影响;吮吸蚜虫和咀嚼幼虫。为了测量实时VOC排放，我们使用了Jud等人推出的平台，2018年[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]，我们将气相色谱 - 质谱（GC-MS）和飞行质谱（PTR-TOF-MS）的质子转移反应时间相结合（PTR-TOF-MS，[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba])。我们表明，在嗜胞外杂散的草食病中的VOC排放存在强烈差异。Furthermore, using RNA-Seq and de novo assembly of transcriptomes we examined transcriptional changes, i.e. induced/suppressed gene expression following aphid and caterpillar herbivory, with a view to simultaneously analyse metabolomic and transcriptomic changes to observe any inducible response of the plants to both sucking and chewing herbivores.

在工作的中央实验中（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab)，五种萜类化合物在一个多试管系统中培养(系统的方案在附加的图S中描述GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）超过七天，不断测量VOC排放。在某些时间点（第4天和第7天）叶样品中也从所有植物中取出化学分析，以及转录组研究（仅由植物趋化型3）。为了选择含有各种化合物的植物，我们使用[中含铅的己烷提取方法评估了八种液氮植物的VOC轮廓。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.鉴定了共48种化合物，根据化合物的相对优势分配了五种趋化物（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一种）。所有植物化学型通过将植物分成九个子克隆，将其分成九个子克隆，作为生物重复作为生物学重复，因为核肉在克隆中稳定[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

蚜虫和毛毛虫引起的液氮化学型储存池中的Terpenoid模式的变化（己烷提取）GydF4y2Ba

使用己烷提取物的GC-MS分析，在所有趋化合物中鉴定了总共64种化合物，将己烷提取物分为六个复合类（见表S.GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.检测到的化合物主要是单次和筛选;与初始趋化分型相比，所鉴定的化合物的数量增加是由于较高的总排放和草本诱导的应激化合物。植物化学型1和5部分地由（GydF4y2BaZ.GydF4y2Ba）-dihydrocarvone（> 30％），而植物化学型2的特征在于Myrtenol（〜25％），然后是醋酸钠（> 10％）的轻微优势。植物化学型3强烈地由L-Camphor（> 70％）主导，而植物嗜疗法4略微由Sabinene（〜20％）略微主导，桉树（〜15％）和（e） - 草烯水合物（> 10％）也发现在混合物中（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一种）。数字GydF4y2Ba2GydF4y2Ba显示出五种化学类型之间的明显差异。GydF4y2Ba

通过双尾t检验分析表明，除N组和B组(包括蚜虫和毛虫;T-value =−3.659,df = 4，GydF4y2BaP.GydF4y2Ba = 0.022; 无花果GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.虽然有在排放总量差异不大，有他们两个不同物种的取食反应化学型之间的差异显著。GydF4y2Ba

N处理组(无蚜虫、无毛虫)的萜类分布规律。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba与其他处理相比，表示未经关注的趋化型，在己烷萃取物中检测到在己烷萃取物中检测到的百分脂素（复合浓度列出表S.GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.处理A组植物(蚜虫，无毛虫)显示蚜虫取食对贮藏(正己烷提取萜类化合物)化学型的影响。蚜虫对贮藏萜类化合物的形态和浓度影响最小;在化学型1、3、4和5中，萜类化合物的浓度略有增加，而在化学型2中，萜类化合物的浓度降低。GydF4y2Ba

虽然蚜虫是微创的phloem吸盘，因此在植物上不会对植物产生巨大的身体上表观胁迫，毛虫正在咀嚼食草动物并且会导致严重的组织丧失，导致植物巨大的物理创伤。治疗组C植物（无蚜虫，毛虫）显示对毛虫损伤的不同反应;植物化学型2和3表现出萜类浓度的强烈增加。在植物化学型1和5中，在治疗组C中可以观察到VOC浓度的增加，而植物化学型4似乎显示出除桉树的所有化合物中的萜类积累的减少，其浓度略微增加。除植物化学物质2和3外，治疗组B植物（蚜虫和爪子和毛虫）显示出在所有嗜胞内型的百分比浓度增加。GydF4y2Ba

植物化学型3应用毛毛虫(处理C组)后检测到的高浓度萜类(特别是l -樟脑)反映在该化学型的VOC排放模式上(图)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.虽然正己烷萃取法给出了在叶子结构中合成和存储的所有化合物的概述，但从试管出口空气中Tenax/ Carbopack盒上收集的VOCs只包含从植物中实际释放到试管顶部空间的化合物。顶空样品中检测到的高含量VOCs的确认(见下一节)与从己烷提取物中获得的结果一致。这表明这些化合物是在草食动物摄食后合成和储存/释放的。GydF4y2Ba

以蚜虫和毛虫为食的萜类物质的排放模式(通过过滤器测量挥发性)GydF4y2Ba

为了获得每个植物化学类型在特定时间内释放的化合物的概述，我们在Tenax/ Carbopack盒上收集释放的VOCs，时间为2-3小时(见方法)。气相色谱-质谱联用鉴定出40个化合物，列于补充表SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba．顶空分析中发现的化合物主要分为单萜和筛氏萜类化合物。通过趋化型分组清楚地定义发射模式（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba，补充表SGydF4y2Ba2GydF4y2Ba)，其成分与使用液体提取法进行初始化学分型时的成分相似。结果表明，植物对草食动物攻击的反应依赖于植物的化学类型。GydF4y2Ba

植物化学型1的排放主要由(GydF4y2BaZ.GydF4y2Ba）-dihydrocarvone。用毛毛虫治疗的植物（治疗组C;没有蚜虫，毛毛虫）表现出MyRTenol和P-Cymene排放的增加。植物化学型2略微由Sabinene和醋酸氨酸略微主导。植物化学型3强烈地由L-Camphor主导。植物化学物质1,2和3属于治疗组C（无蚜虫，毛毛虫），所有VOC水平略高于用蚜虫预处理的植物。植物趋化型4甚至均匀地混合了Sabinene的轻微优势和桉树。（GydF4y2BaZ.GydF4y2Ba） - 植物趋化型5强烈地发出的Dihydrocarvone，具有各种其他化合物，包括P-Cymene和SabineNe。相反，用蚜虫预处理的植物化学型4和5显示比未处理的植物更高的VOC排放（治疗组C）。在Tenax / Carbopack测量中观察到的发射图案（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)也反映在两种正己烷提取物中(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）和PTR-TOF-MS分析（参见下一部分）。GydF4y2Ba

蚜虫和毛毛虫喂养过程中液氮挥发物的动态排放（连续挥发排放测量）GydF4y2Ba

在使用蚜虫和毛虫之前和之后，使用PTR ToF MS在线连续测量Tansy VOC排放量。排放的时间过程显示了所有五种化学类型的食草动物损害效应，并再次指出了对食草动物攻击的化学类型特异性反应。GydF4y2Ba

在所有植物化学物质上观察到昼夜萜件排放的昼夜变异（例如单口百合的总和GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba137.133和倍半萜GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba205.196;见图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaB和G分别）。当植物置于比色皿中时，在实验开始时看到了高水平的排放。除了海甲之外（质量GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba99.081)，所有可探测质量特征的发射率在测量开始时升高，在前24小时内下降。这表明当植物被放置在试管中时，没有发生机械损伤。任何数据分析都不包括前24小时的排放，因为它们是分散的，不代表非应激植物的基线挥发性排放。GydF4y2Ba

蚜虫的应用对PTR-TOF-MS检测到的不同化合物的总排放率没有显着影响。除了单调位的总和（MTS;）之外，除了昼夜变化之外，发射的发射不会明显增加（MTS;GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba137.133;无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab）和三种含氧单调（O-MTS;GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba135.116,GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba151.112，GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba153.128;见图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaA，C和E分别;补充表S.GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.添加卡特彼勒幼虫立即改变了凝思声排放，所有排放率立即增加，而在某些质量特征中可以看到昼夜变化。从曲线中尚不清楚，排放量是否仅仅是伤口效果或施用咀嚼食草动物后排放的快速诱导。瞬时增加二甲基丙烯（DMNT，GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba151.149;无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad），MTS，观察到O-MTS。相比之下，Sesquiterpenes（SQTS;GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba205.196）随着时间的推移急剧增加而降低，而绿叶挥发物的发射，通过M / Z 99.081的肝肾信号示例。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bah）显示初始增加，其次是强劲的昼夜波动，随着时间的推移不会增加。接受蚜虫治疗的植物首先显示出与不受吸吮昆虫未预先治疗的植物相比的MTS和O-MTS的较高排放率的总体趋势（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

热映射分析（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba，补充表SGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba平均在线质谱数据目视确认通过己烷提取物的GC-MS分析完成的植物化学品的分类（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.与离线GC-MS分析在吸附剂墨盒上收集的VOCs (0.1 L minGydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}；Collection period of 3 h around noon), PTR-ToF-MS data from the same time intervals were averaged. Treatment group N is the average of data collected from days 1 to 4 of plants that were not infested with aphids, while treatment group A is the average of the same time but of plants that were infested with aphids. Treatment group C is the average of data collected from days 4 to 7 of plants that were subjected to caterpillar feeding but not aphid infestation, while treatment group B is the average of the same time but of plants that were subjected to feeding by both aphids and caterpillars. Chemotypic profiles of the five plants are highlighted by the differences in signal strength between MTs (m / z.GydF4y2Ba137.133;例如Sabinene和γ-萜烯）和O-MTS（GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba153.128;l -樟脑和(GydF4y2BaZ.GydF4y2Ba）-dihydrocarvone）。在添加蚜虫以植物化学型1和2之后，可以检测到Mt和O-Mt水平的降低，而植物化学型3,4和5显示这些单萜类化合物的增加。每个趋化型对蚜虫治疗响应不同。虽然毛毛虫喂养一般增加植物VOC排放，但通过蚜虫之前的饲料进一步增加了植物化学物质3,4和5的饲料，但为化学型1和2减少了它。GydF4y2Ba

在蚜虫和毛毛虫喂养以下嗜型3的转录组变化GydF4y2Ba

在从植物化学型3中提取的RNA分析RNA的RNA-SEQ分析后，De Novo组件总共产生了52,765个植物基因，用于调查由蚜虫和毛虫治疗的组合产生的转录变化。治疗对比度组之间的差异如下概述：A-N =蚜虫效应，没有毛虫（GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba），c-n =毛虫效果，没有蚜虫（GydF4y2BaCGydF4y2Ba)， B-A =毛虫效应，与蚜虫(GydF4y2Ba加利福尼亚州GydF4y2Ba），（b-a） - （c-n）=蚜虫效应，毛毛虫（GydF4y2BaD.GydF4y2Ba）（见图.. sGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

共发现502个差异表达基因（DEG），无论是上调还是下调，其倍数变化均大于2倍(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05; supplemental Table S5.GydF4y2Ba）.与各种防御响应相关的DEG在补充表S中详述GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba并在图中的热图中显示。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba．与上述代谢组学数据一致，蚜虫处理对比(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba）仅引发轻微的转录反应。编码推定的NAC转录因子56（Tanvuegr019790，Ortholog到AT2G41890.1的DEGS，GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba；E值为：2.39E-17;8.5倍数变化）和烟草花叶病毒（TMV）抗性蛋白N（TanvuEGr041015，直系同源物，以OIT35319，GydF4y2Ba烟草attenuataGydF4y2Ba；E值：2.6E-10;7.3折变化）上调。对于用毛虫的植物侵染植物的侵袭，观察到大量效果。在治疗组涉及毛虫治疗的对比中，一系列胰蛋白酶/胰凝乳素抑制剂Orthologs Tanvuegr038583（直际到AT1G73325，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；TanvuEGr040924(与AT1G73325同源，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；TanvuEGr035344(与AT1G73325同源，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；e值:2.1e-3))和推测的相思子蛋白和nigrin样基因(阻碍蛋白质生物合成)上调。一些基因仅在毛虫进食后受到差异调节;一种脂肪酶(TanvuEGr016806，与AT3G04290.1同源，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；受体样蛋白激酶FERONIA基因(TanvuEGr013486 (orlog to AT3G51550.1，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；E-value: 1.19e-2)下调(−8.5倍变化)。用毛虫和蚜虫同时处理的植物(处理对比组(GydF4y2Ba加利福尼亚州GydF4y2Ba））在四个分析的治疗对比度群体中的次数最多。与细胞壁工艺相关的Degs，包括推定的内科酶EP3（Tanvuegr02756，Orthologog至At3G54420.1，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；E值：1.12E-11）和LACCASE-7（TANVUEGR007097，ORTHOLOG到AT3G09220.1，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；E值：1.28E-03）基因强烈上调（分别为10和11.2倍变化）。相同的Feronia基因仅通过毛毛虫处理下调，在高度上调（8.5倍）的组合治疗下。Ortholog到AT4G27260（GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；E值：〜0），吲哚-3-乙酸 - amido合成酶GH3.5（Tanvuegr005980）强烈下调（ - 7.1倍变化），如两种推定的G型凝集素S-受体样丝氨酸/苏氨酸-Protein激酶，SD2-5（Tanvuegr003778，Ortholog到AT4G32300.1，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；e-值:2.64e-02)和SD3-1 (TanvuEGr002669，与AT2G41890.1，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；E值：2.39E-17）（分别为6.5和 - 9.6分别发生）。用蚜虫和毛毛虫治疗的植物，相对于仅接受毛虫（治疗对比度群体（GydF4y2BaD.GydF4y2Ba））没有表现出许多次数，然而再次提到的Feronia基因非常强烈上调（16.9倍变化）。GydF4y2Ba

从艾菊和其他植物物种中的TPS系统发育分析GydF4y2Ba

由于单次和筛分萜烯是胎儿中精油的基本组分，并且它们也占据了果树的挥发性排放，因此研究基因家族对萜烯合成酶的表达是有趣的。序列GydF4y2BaTPS.GydF4y2Ba来自密切相关植物物种的基因如GydF4y2Ba向日葵GydF4y2Ba和GydF4y2Ba青蒿GydF4y2Ba，从在线数据库中检索并与推注注释的序列对齐GydF4y2BaTPS.GydF4y2Ba来自atansy的基因。系统发育分析表明TANSYGydF4y2BaTPSS.GydF4y2Ba属于GydF4y2BaTPS.GydF4y2Ba预测的亚家族(图SGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）;例如，一个推定的（GydF4y2BaE.GydF4y2Ba）-β-脑膜合酶（Tanvuegr006575，Ortholog到PWA70010.1，GydF4y2BaA. Annua.GydF4y2Ba；e-值:4e-147)和一个假定的倍半萜环化酶(TanvuEGr007220，与AAG24640.2同源，GydF4y2BaA. Annua.GydF4y2Ba价值:1 e - 124)。然而，RNA-Seq数据显示，推测的基因转录本GydF4y2BaTPSS.GydF4y2Ba存在，但只有很少显示它们的基因表达的变化（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba，补充表SGydF4y2Ba5.GydF4y2Ba），例如两个假定柠檬苦素UDP-葡糖（TanvuEGr011661，（直系同源物AT4G15480.1，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；E值：1.26E-04）和TanvueGr028241（Ortholog到AT4G15480.1，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；e值:3.49e-03))和3GydF4y2BaSQT.GydF4y2Ba基因：推定（ - ） - Germacrene D合酶（Tanvuegr017925，Orthologog至AT3G14490.1，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；E-value: 2.73 -08)和两个基因TanvuEGr029614和TanvuEGr007220与(GydF4y2BaE.GydF4y2Ba）-β-法呢烯合成酶（AT5G23960.1，GydF4y2Ba答:芥GydF4y2Ba；E值：1.02E-03和2.37E-03）。虽然Tanvuegr029614在蚜虫治疗下上调（5.7倍），但另一个推定（GydF4y2BaE.GydF4y2Ba-β-法尼烯合成酶仅在蚜虫取食和毛虫攻击后转录水平升高2.8倍。GydF4y2Ba

我们结合了多种方法，铅提取，累积顶空取样和使用多比管系统的实时顶空取样[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]，调查五种不同的液体趋化型以攻击的攻击和咀嚼食草食草和灌注效应。蚜虫饲养没有导致强烈的化学变化，这可能与饲养蚜虫的最小侵扰阈值有关[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]，而毛虫进料在每种植物嗜型中增加储存和发射的挥发物。重要的是，对食草动物攻击有嗜型特异性反应。我们还发现了启动的证据，但强度依赖于趋化型。通过蚜虫喂养，随后是毛细胞导致对每个植物嗜型中的储存和发射的挥发性化合物的效果比如果在引入毛虫之前未在植物上喂食蚜虫。具体地，先前的蚜虫进料进一步增加了植物化学物质1,4和5的储存挥发性化合物的浓度，并增加了植物化学物质3,4和5中的顶部空间的化合物的浓度增加。我们还证明了测量时间点影响获得的结果，特别是关于植物处理和昆虫饲养模式。植物趋化型3的转录组分析代表了液氮转录组的第一德诺族组装。GydF4y2Ba

对蚜虫和毛虫的反应差异：蚜虫GydF4y2Ba

在这项研究中，食草动物的不同饲养机制引起的艾菊植物非常不同的防御反应。蚜虫馈送已被证明表现出对植物VOC排放单独和与其它食草动物结合可变效果。施瓦茨贝里和同事报告说，暴露在豌豆蚜虫（GydF4y2Ba豌豆蚜GydF4y2Ba）在其宿主工厂中没有诱导VOC排放的任何可检测变化GydF4y2Ba蚕豆根尖GydF4y2Ba[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba，然而，与之形成鲜明对比的是，杜教授和他的同事们发现GydF4y2Ba答:pisumGydF4y2Ba在GydF4y2Ba诉较好GydF4y2Ba导致几种化合物的诱导和/或发射[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba］.有趣的是，Staudt和他的同事[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba在桃品种VOC排放]发现的定量和定性的差异（GydF4y2Ba李古鲁乌斯GydF4y2Baspp)暴露于GydF4y2Bamyzus persicae.GydF4y2Ba，这些差异是基因型依赖性。GydF4y2BaMetopeurum fuscovirideGydF4y2Ba是专为唐茜而生的，可能已经与植物共同进化，以将对彼此的负面影响最小化，或者蚜虫可能已经进化，以避免唐茜的防御，这可以解释观察到的挥发性有机化合物排放量的最小变化。必须牢记的是，蚜虫的攻击强度也是蚜虫诱导挥发物的一个关键因素;必须达到喂食蚜虫侵害的最低阈值。前期研究表明，蚜虫对寄主植物的选择是非随机的;在这个季节的早期，蚜虫积极地选择了它们的宿主植物，并将它们首选的化学类型殖民化[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]，本赛季晚期几乎完全殖民化植物属于优选的术语（无论趋化型）[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba］.虽然蚜虫可能会根据挥发性化学类型选择寄主植物，但在某些代谢类型上，它们成功建立和维持一个群体的概率更高，而且与群体大小和照料蚂蚁的存在等其他因素有关。GydF4y2Ba

对蚜虫和毛毛虫的反应差异：毛虫和灌注GydF4y2Ba

如预期的那样，植物对毛虫攻击非常强烈反应，并且在第四天应用毛虫后，每种趋化型都会观察到单萜排放的增加。我们还发现了初步的证据：整体趋势表明，植物中的单口培养最高用蚜虫和毛毛虫治疗，表明蚜虫对萜类化合物生物合成的影响。在脂质己烷提取物中测量，在施用蚜虫之后，单萜的合成/储存的单选/储存的变化（未在蚜虫喂养后经常释放的所有已知化合物）最小化，相对于对照（治疗组N.）在植物嗜型2中，植物化学型1,4和5的略微增加，并且在植物化学物质中看似不变3.因此，趋化型显示出更高或较低的排放，这取决于它们是否已预先用蚜虫预处理。在植物化学型2和3中，植物中挥发性反应较高，蚜虫未治疗，而植物化学物质1,4和5在用蚜虫预处理时显示出更强的挥发性响应。，当所有挥发物（测量在己烷提取物中，在每个治疗的所有植物上进行总结，除了治疗组（任何草食虫的攻击）和B（两种草食物的攻击）之间没有观察到显着差异，表明它不是挥发物的绝对量不同但相当变化的组成。GydF4y2Ba

在其他研究中也观察到蚜虫喂养后的不同启动效果。Schwarzberg和同事[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]发现，当植物与蚜虫共寄生时，由毛虫引起的挥发性有机化合物的排放减少。相反，其他研究发现，当蚜虫随后受到不同食虫会物种的攻击时，挥发性萜类化合物的总排放量增加[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42GydF4y2Ba］.尽管在实验系统和蚜虫物种的特异性上存在差异，但我们观察到每种化学类型对植食性处理的反应不同，这强调了植物对多种植食性攻击存在化学−/基因型反应。GydF4y2Ba

PTR-TOF-MS和其他方法指出毛状体的破坏GydF4y2Ba

PTR-TOF-MS的使用使我们能够实时观察VOC排放的变化。在白天和夜晚的随机时间观察到在暴露于毛虫后的萜类化合物的排放量增加，可能反映了饲养毛虫的活性模式。毛毛虫通常消耗叶组织的所有部分，从而在喂食时破坏腺体滴毛。由于这是不可能区分化合物是否从粒状物中释放，即储存，或源于衍生植物的De Novo生物合成。然而，排放和明显峰的强烈波动表明，毛状体的破坏和导致VOC的立即蒸发是发射的主要原因。没有毛状体的植物的排放课程通常显示出在食草动物喂养攻击时稳定，均匀排放的萜类化合物[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

两种草食动物的应用并没有彻底改变不同化学类型的挥发性化合物的排放模式，而是增加了优势化合物和其他密切相关化合物的排放水平。这表明，节肢动物运动对毛状体的破坏或机械/物理应力对VOC排放量的增加有显著贡献。紧密相关的化合物，如桃金娘烯醇和桃金娘烯酯，或二氢香芹酮和新二氢香芹醇，都有同时增加的趋势。这也意味着食草动物以不同的化学类型为食会导致不同的挥发特征，而不是总是相同的。GydF4y2Ba

本地与整体反应GydF4y2Ba

通过GC-MS分析两种采集方法，研究了两种草食动物的局部和整体(系统)挥发性反应。正己烷萃取，使用对照叶和高度受损部位的叶，提供了当地对草食反应的信息，而顶空分析提供了植物整体反应的观点。化学型3植物亲脂提取物中萜类化合物(特别是l -樟脑)的浓度较高，这反映在植物的排放模式和速率上。储存的萜类化合物浓度的增加表明化合物合成和储存的增加，这也有助于增加排放。为了能够清楚地识别挥发性有机化合物的来源——来自储存池或从头生物合成——aGydF4y2Ba^13.GydF4y2BaC标签实验必须进行(例如Ghirardo等人2020年[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]），然而这超出了本研究的范围。GydF4y2Ba

基因表达，基因的鉴定，鉴别响应食草动物GydF4y2Ba

我们对植物化学型3的转录组分析证实，参与萜类合成和防御的几个基因受到不同处理的不同调控。在转录组分析中，治疗对照组(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba），细节用蚜虫与未处理的植物处理的植物，上调编码NAC56转录因子的衍生直肠和TMV抗性蛋白N的DEGS。已知NAC56转录因子（TF）在植物对非生物胁迫和病原体挑战中发挥作用[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］.陈和同事们展示了GydF4y2Ba芸苔栗鸟GydF4y2Ba（油菜），GydF4y2BaBnNAC56GydF4y2Ba在JA、SA和ABA的诱导下，其表达量显著增加，表明它可能在植物耐生物胁迫中起核心作用。虽然有限的证据表明NAC TFs调节超敏反应(HR)，但这项研究表明，BnaNAC56诱导HR样细胞死亡，因此是一种诱导性防御形式。TMV抗性蛋白N是一种疾病抗性蛋白，当触发时可诱发超敏反应[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba］.有趣的是，通常与病原体感染有关的可在蚜虫喂养时上调，因为它已知植物对蚜虫和生物营养病原体的类似防御[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba］.治疗对照组(GydF4y2BaCGydF4y2Ba），细节与未处理的植物相关的毛虫治疗的植物，推定的受体样蛋白激酶GydF4y2BaTvFERONIAGydF4y2Ba是强烈表达下调。在对咀嚼草食动物的反应中，JA防御通路被诱导。由于FERONIA以拮抗的方式调节JA信号[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba]但它不成富的是，它在仅接受毛虫治疗的味道植物中下调。GydF4y2Ba

经历过这两种食草动物的植物(治疗对比组(GydF4y2Ba加利福尼亚州GydF4y2Ba)，详细描述了处理过蚜虫和毛虫的植物与只处理过蚜虫的植物之间的关系)，在所有四组处理中，deg的数量最高。几丁质内酯酶的Tansy同源物GydF4y2BaEP3GydF4y2Ba和GydF4y2BaLACCASE-7.GydF4y2Ba在这些植物中均强烈上调。先前已经表明，棉花漆基因的过表达导致对真菌植物病原体的耐高兴（GydF4y2Ba黄萎病大丽花）GydF4y2Ba以及草食害虫(棉铃虫)GydF4y2Ba棉铃虫和棉蚜GydF4y2Ba在棉花植物中[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba］.吲哚-3-乙酸 - 氨基合成酶GydF4y2BaGH3.5GydF4y2Ba属于一种毒素响应基因家族，并负责催化吲哚-3-乙酸（IAA）的合成。IAA帮助植物处理过量的养羊酸和过度表达GydF4y2BaGH3.5GydF4y2Ba结果增强了水稻对真菌病原体的抗性[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba]通过抑制细胞壁松动和细胞生长的机制。已经证明，蚜虫饲养导致与细胞壁代谢相关的显着改变的转录物[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

我们的转录组学分析也显示了个体生物复制之间的高度可变性，这使得评估变得困难，并限制了显著DEG的数量。原因可能是不同实验中食草动物与植物的相互作用不同，这可能导致基因表达的不同时间过程。此外，由于植物冠层内不同的光照和温度梯度，用于分析的叶片可能没有处于完全相同的生理状态。在毛虫取食后，首先受到蚜虫攻击的tansy植物与未受到蚜虫攻击的tansy植物之间的DEGs差异极小。由于基因表达的波动，我们不能排除我们已经观察到蚜虫和毛虫攻击之间可能的协同作用的可能性。GydF4y2Ba

转录组:合成酶GydF4y2Ba

果酱具有大型化学多样性的萜类化合物。因此，我们能够检测到植物趋化型转录组的De Novo组装转录组中具有高相似性的许多转录物的许多转录物。推定的萜烯合酶基因的系统发育分析表明，液氮基因属于已知的GydF4y2BaTPS.GydF4y2Ba双子叶植物的亚群。一组7个基因GydF4y2BaTPS-BGydF4y2Ba其中包含单萜合成酶，16组GydF4y2BaTPS-A.GydF4y2Ba，这是倍半萜合酶的特性。此外，我们可以发现在一个假定基因GydF4y2BaTPS-F.GydF4y2Ba基团，其中包括芳樟醇合酶。个体的高度同源性GydF4y2BaTPS.GydF4y2Ba以已知和酶促表征的基因GydF4y2BaTPS.GydF4y2Ba并不意味着在唐茜中标注的酶具有相同的生物合成产物[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba52GydF4y2Ba那GydF4y2Ba53GydF4y2Ba那GydF4y2Ba54GydF4y2Ba］.为了做出关于推定酶活性的结论性声明GydF4y2BaTPS.GydF4y2Ba，我们知道每种基因必须异常表达并进行生物化学功能分析[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba那GydF4y2Ba56GydF4y2Ba那GydF4y2Ba57GydF4y2Ba那GydF4y2Ba58GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

总之，我们的研究表明，植物对食草动物的攻击有一种化学类型特异性的反应，而且这种反应还延伸到启动，即植物对另一个物种的第二次食草动物攻击的反应。这对研究该领域植物化学通讯的研究人员具有重要意义。如果野外种群中邻近的化学类型对食草性/双食草性有不同的反应(即某些化学类型的反应比其他类型释放更高水平的挥发性有机化合物)，这可能会对个体水平和群体水平产生潜在的影响。某些化学类型的个体对草食胁迫的反应可能比其他的更有效，在一个群体中，这些“更响亮”的化学类型可能会影响当地的昆虫群落，包括食草动物的天敌和其他邻近的植物。GydF4y2Ba

植物和昆虫材料GydF4y2Ba

在德国南部的一个田地现场的房地产所有人同意（n 48°25'1.51“; e 11°46'1.19”）的田间现场收集了atansy种子。[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]在“濒危野生动物群和植物群”贸易公约之后。父母植物被S. Zytynska正式鉴定为GydF4y2BaTanacetum vulgare.GydF4y2Ba（L.）。从种子中生长五种不同的液体基因型，在2015年的温室中的扦插（同年进行实验）。植物生长至大约30厘米的尺寸，以适应玻璃比杯系统的尺寸限制。使用如[中的叶己烷萃取方法评估所述每个基因型的挥发性Terpenoid模式。如[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.每个基因型的9个无性系子基因被产生(通过分裂)，其中6个最健康的植物被选择用于实验，作为生物复制。GydF4y2Ba

所有蚜虫(GydF4y2BaMetopeurum fuscovirideGydF4y2Ba在德国Freising慕尼黑技术大学Dürnast实验站的温室条件下(21.7°C, 70%相对湿度，16:8 h光照:黑暗)饲养，并在试验中未使用的化学类型上饲养。(详情请参阅[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba])。作为一种咀嚼草食动物，我们选择了GydF4y2BaSpodoptera littoralis.GydF4y2BaBoisduval是非洲棉绒，因为它是一般的毛虫，可能导致植物造成巨大的创伤，完全剥离其叶子的植物。已经表明，特定的VOC被释放回应GydF4y2BaS. Littoralis.GydF4y2Ba以tansy为食，在应用时释放出类似的VOCGydF4y2BaS. Littoralis.GydF4y2Ba口腔分泌物(GydF4y2Ba59GydF4y2Ba］.的一龄幼虫GydF4y2BaS. Littoralis.GydF4y2Ba在室温下被饲养在商业莴苣叶上。在植物上施用之前，所有幼虫均为24小时，以确保立即喂养。GydF4y2Ba

Terpenoid Chemotypes的初始选择GydF4y2Ba

为了选择含有各种化合物的植物，我们使用[中含铅的己烷提取方法评估了八种液氮植物的VOC轮廓。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.鉴定了共48种化合物，根据化合物的相对优势分配了五种趋化物（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一种）。所有植物化学型通过将植物分成九个子克隆，将其分成九个子克隆，作为生物重复作为生物学重复，因为核肉在克隆中稳定[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

实验设计GydF4y2Ba

在中央实验中，五个液体“化学物质”（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa)在幼虫被蚜虫攻击或未被蚜虫攻击后暴露于幼虫，每个生物重复6个。GydF4y2Ba1GydF4y2BaB，每个化学类型有6个植物复制，3个重复没有处理过蚜虫，3个重复处理过蚜虫，之后所有重复处理过毛虫)。在试验的第一天，在如图S所示的系统中，将5株大约30厘米高的随机的唐杉植物放入试管基座中GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，一个比色皿保持空，为统计标准化提供空背景。重要的是要注意，在处理芳香植物时，必须采取极端注意，避免叶子开始，以尽量减少储油腔（毛粒）的破坏。在申请食草动物和将工厂放置在系统中，必须通过适当的时间为工厂“安顿下来”。然后小心地放置在每个植物上的大型玻璃灯泡。在大约200μmol光子M的光强度下培养植物16/8小时的夜间变化GydF4y2Ba^{−2GydF4y2Ba} s^{−1GydF4y2Ba}（Agro Son-T 400 W，Philips，汉堡，德国）在植物上方。温度在光相期间从23℃变化至> 30°C。所有植物都被允许24小时平衡。在午间的实验第1天，将100个未举起的成人蚜虫仔细应用于蚜虫治疗厂。在实验的第4天，两个第二龄量GydF4y2BaS. Littoralis.GydF4y2Ba然后仔仔撒在每一株植物上。试验第7天结束。所有GydF4y2BaS. Littoralis.GydF4y2Ba根据理事会指令2000/29 / EC收集和破坏幼虫。GydF4y2Ba

我们在两个采样时间（第4天，第7天）进行了两次两阶段实验，以查看蚜虫侵扰的影响。在实验的前半部分中，植物未被蚜虫攻击（无蚜虫，无毛毛虫）被标记为“n”;而且只有蚜虫治疗的植物（蚜虫，没有毛毛虫）被标记为“a”。在实验的下半部分，以前未被蚜虫攻击但接受毛毛虫（无蚜虫，毛毛虫）的植物标记为“C”，并且接受毛毛虫（蚜虫和蚜虫和毛虫）的蚜虫处理的植物被标记为“B”“。数字GydF4y2Ba1GydF4y2BaA显示治疗组N的植物的VOC模式，即当不被食草动物攻击时不同趋化型的VOC排放。GydF4y2Ba

在第4天首先从所有植物收集叶样品。我们仔细避免了用蚜虫侵染的区域，并在液氮中冻结叶片，然后在-80℃下储存直至进一步使用。在第7天，收获所有植物的剩余叶片并立即在液氮中冷冻。使用混合的Tenax / carbopack管，每天收集顶空挥发物（见图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab）。另外，通过PTR-TOF-MS连续监测所有比色皿。在来自植物趋化型3的叶片上进行转录体分析3。GydF4y2Ba

排放VOCs的实时分析GydF4y2Ba

使用多功能系统进行发射挥发物的在线分析[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]Ionicon Analytik GmbH（奥地利因斯布鲁克）由六个与商用PTR ToF MS耦合的全厂反应杯组成。反应杯由位于气密圆柱形不锈钢底座顶部的玻璃球组成，使用惰性氟橡胶环密封接头（详情见Jud等人[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba])。基座含有气体和灌溉管的连接，以及电气连接。用旋转叶片压缩机（DLT 40，Gardner Denver Schopfheim GmbH，Schopfheim，Germany），用从实验厅汲取的空气冲洗。空气流量设定为18米GydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}从第一到三个并减少到10 l minGydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}从第四天的开始，剩下的实验持续时间。气流（〜120毫升分钟GydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba})到PTR-ToF-MS之间交替试管，切换时间设置为5分钟。仪器的E/N为115 Td (E =电场强度，N =气体数密度;1 Td = 10GydF4y2Ba^{- 17.GydF4y2Ba} V cm^2GydF4y2Ba；漂移管压力= 2.2毫巴;漂移电压= 500 V，漂移管温度= 60°C）。在整个实验中，离子hGydF4y2Ba_3.GydF4y2BaO·HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba阿,GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba， 和不GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba保持在10,3和0.2％的主要离子以下。质谱范围设定为记录GydF4y2Ba中区318GydF4y2Ba. 使用中描述的例程分析PTR ToF MS原始数据[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba60GydF4y2Ba］.如[描述的数据进行分析GydF4y2Ba61GydF4y2Ba］.简而言之，每秒计数的计算信号被标准化以考虑每个比色皿的绝对湿度的差异，使信号在每秒标准化计数（NCPS）中。GydF4y2Ba

气相色谱-质谱联用分析吸收管和正己烷萃取GydF4y2Ba

通过比色管测量的GC-MS分析VOC排放，一系列吸收管包含40 mg Tenax TA /10 mg Carbopack(两者均从Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany [GydF4y2Ba43GydF4y2Ba];）加上空气流（0.1升分钟GydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}；中午围绕中午3小时的收集时间从每个比色皿的出口空气在第四天和七天（图）GydF4y2Ba1GydF4y2Ba). 取样后，在气密条件下关闭Tenax/Carbopack管，并储存至4℃进行分析 摄氏度。对于GC-MS分析，使用热脱附装置（TDU；Gerstel GmbH，德国穆尔海姆-德鲁尔），与气相色谱-质谱仪（GC-MS；GC:7890A，MS:5975C惰性XL MSD，带三轴探测器，均为安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托市）。CIS汽化入口（冷却喷射系统；格斯特尔）被设置为− 50 摄氏度。TDU被加热到290 摄氏37度 摄氏度，速率为280 摄氏度 闵GydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}．在1mL min的氦的恒定流速下分析样品以恒定的流速分析GydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}．After 0.2 min the CIS was heated to 290 °C at a rate of 12 °C min^{−1GydF4y2Ba}并持有2分钟（从Ghirardo等人改编的方法2012 [GydF4y2Ba43GydF4y2Ba])。GydF4y2Ba

为了分析叶片中的储存的萜类化合物，己烷提取物由在第四天和七天收集的冷冻叶粉制备，并通过GC-MS分析。使用如[中所述的方法和GC-MS方法制备并分析所述提取物并分析。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

通过与NIST 05和Wiley图书馆谱的比较，商业标准（Sigma-Aldrich，Taufkirchen，Germany）和Kovats保留指数图书馆的比较来进行所有VOC的鉴定和定量所有VOC的鉴定和定量。GydF4y2Ba62GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

RNA提取GydF4y2Ba

在第4天和第7天，叶片组织被严重破坏GydF4y2BaS. Littoralis.GydF4y2Ba或上爬满了GydF4y2Bam . fuscovirideGydF4y2Ba，（但是不包含任何昆虫材料）以及对照植物，被选择用于分析，与被照顾以避免任何蚜虫（GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 3 for each treatment group, with 12 replicates in total). Leaf material was ground under liquid nitrogen. Total RNA extraction was performed using the innuPREP Plant RNA Kit from Analytik Jena AG (Jena, Germany) according to the manufacturer’s instructions. RNA quality was confirmed using the Agilent 2100 Bioanalyzer with the RNA6000 Nano Lab Chip Kit (both Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA); the RNA Integrity Number (RIN) was between 7.5–8.

转录物施工和转录物的下一代测序由Vertis Biotechnologie AG（德国弗赖森）进行。首先，将所有样品用DNase处理，以除去任何基因组DNA，然后使用Shimadzu Multima Microchip电泳系统（Shimadzu，Japan）检查。然后从总RNA样品中分离聚（a）+ RNA。使用N6随机底漆合成第一链cDNA。在碎片之后，以股线特异性方式将Illumina Truseq测序适配器连接到CDNA片段的5'和3'末端。最后，使用验证酶用PCR（14-15次循环）扩增cDNA。然后将cDNA合并为大致等摩尔量，从制备琼脂糖凝胶中洗脱，在350-500bp的尺寸范围内。用毛细管电泳分析尺寸分级的cDNA池的等分试样。使用150bp（读取1）和150bp（读取2）读取长度和'高300'测序套件，NGS库池是用Illumina NextSeq 500系统测序的配对端。GydF4y2Ba

将RNA-SEQ数据组装成应用两个汇编器的转录序列，三一平台[GydF4y2Ba63GydF4y2Ba]使用缺省参数和整个读集和布里杰[GydF4y2Ba64GydF4y2Ba]仅为每一个样本中的每一个的组合复制来应用KMER系列（K = 25,27,31）。将所得转录物合并为使用evigene管道的共有转录组组件（GydF4y2Bahttp://arthropods.eugenes.org/EvidentialGene/GydF4y2Ba）默认设置。随后，过滤报告的转录物用于通过转晶仪V2.0.1进行编码电位[GydF4y2Ba65GydF4y2Ba包括pfam搜索和同源性结果。共获得110,253个转录本/基因位点，由180,353个可变剪接变异体组成。将所有转录本与NCBI的无脊椎动物蛋白数据集进行比较。在最终的tansy转录组中，他们的最高评分与植物蛋白匹配的序列被保留下来。该方法去除了69,613个无蛋白同源转录本和16,578个昆虫相关转录本，产生了52,765个唐茜转录本位点和94162个剪接变体。应用AHRD管道注释转录本的orf编码(GydF4y2Bahttps://github.com/groupschoof/AHRDGydF4y2Ba）使用Interpro和PFAM搜索的默认设置，以及对的同源性比较GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba， Swissprot和Trembl数据库。GydF4y2Ba

使用R包进行差异基因表达（DEG）分析GydF4y2Ba'edger.GydF4y2Ba'v3.26 [GydF4y2Ba66GydF4y2Ba应用标准协议。简单地说，在准映射模式下对每个样本的tansy转录组进行复制，获得数字计数矩阵。为了降低数据的复杂性，避免过于严格的多重假设校正，我们继续对每个转录位点的可变剪接变异进行平均计数。低计数的转录本会被功能过滤"GydF4y2BafilterByExprGydF4y2Ba'和DEGS由如下所示的GLM（广义线性模型）方法来源的GydF4y2Baedger.GydF4y2Ba包裹。过滤后，选择用于DEG分析的基因座总计31,928个基因座。分析了四个对比：A-N（有蚜虫治疗，GydF4y2Ba（a）GydF4y2Ba“蚜虫效应”）、B-A和C-N（有蚜虫预接种和无蚜虫预接种的毛虫处理，GydF4y2Ba(ca)GydF4y2Ba和GydF4y2Ba（c）GydF4y2Ba分别为）和组合对比[（b-a） - （c-n）]，GydF4y2Ba（d）GydF4y2Ba，响应毛虫在存在或不存在蚜虫前治疗的响应差异;见图。sGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

相关的TPS蛋白质序列是从NCBI获得的，E值截止为1×10GydF4y2Ba^{−5GydF4y2Ba}. 蛋白质序列用肌肉组织排列[GydF4y2Ba67GydF4y2Ba];使用gblocks去除不良的位置[GydF4y2Ba68GydF4y2Ba]和maxalign [GydF4y2Ba69GydF4y2Ba］.使用RAxML生成最大似然系统发生树[GydF4y2Ba70GydF4y2Ba]使用1000个引导复制，并在Dendroscuck中绘制[GydF4y2Ba71GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

加入数据GydF4y2Ba

使用Bioproject Number PRJNA646340，在NCBI序列读取存档（SRA）上沉积了原始和加工的RNA-SEQ数据。GydF4y2Ba

统计数据GydF4y2Ba

使用MetaboAnalyst 3.0分析所有植物化学型和不同治疗的代谢谱[GydF4y2Ba72GydF4y2Ba］.使用MetaboAnalyst 3.0和Sigmaplot版本14进行统计分析[GydF4y2Ba73GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

支持本文结论的原始和处理过的转录组数据集已保存在NCBI序列读取档案(SRA)中，生物工程编号PRJNA646340，可访问地址为GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/prjna646340.GydF4y2Ba或者GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA646340GydF4y2Ba。支持本文结束的其他数据集包含在文章（及其附加文件）中。GydF4y2Ba

VOCS：GydF4y2Ba

挥发性有机化合物GydF4y2Ba

GC-MS：GydF4y2Ba

气相色谱-质谱法GydF4y2Ba

PTR-TOF-MS：GydF4y2Ba

质子转移反应飞行时间质谱法GydF4y2Ba

TPS：GydF4y2Ba

萜烯合酶GydF4y2Ba

可见：GydF4y2Ba

差异表达基因GydF4y2Ba

SAR：GydF4y2Ba

系统获得性耐药GydF4y2Ba

DMNT：GydF4y2Ba

DimethylnonatrieneGydF4y2Ba

RNA-seq:GydF4y2Ba

RNA下一代测序GydF4y2Ba

作者希望感谢Robin Heinen对稿件的评论。GydF4y2Ba

这项工作是由德国科学基金会资助的（DFG资助SSCN 653/7 - 1和我们3080/25 - 1）。DFG没有参与研究设计、数据分析和写作。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. Helmholtz Zentrum München，环境模拟研究单位(EUS)，生化植物病理学研究所，纽赫伯格，德国GydF4y2Ba

   Mary V. Clancy, Werner Jud, Bishu Niederbacher, Simon Niederbacher & Jörg-Peter SchnitzlerGydF4y2Ba

2. 化学生态学基础与应用研究(FARCE实验室)，Neuchâtel大学生物研究所，Neuchâtel，瑞士GydF4y2Ba

   玛丽V. Clancy.GydF4y2Ba

3. HelmholtzZentrumMünchen，植物基因组和系统生物学，Neuherberg，德国GydF4y2Ba

   Georg Haberer＆Sharon E.ZytynskaGydF4y2Ba

4. 陆地生态研究集团，慕尼黑技术大学生态与生态系统管理系，生命科学学院Weihentephan，德国GydF4y2Ba

   Matthias Senft & Wolfgang W. WeisserGydF4y2Ba

5. 利物浦大学生态系，感染研究所，兽医与生态学研究所，英国利物浦GydF4y2Ba

   沙龙E。兹廷斯卡GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

M.V.C S.E.Z。,W.W.W, J.P.S.设计研究。M.V.C.进行了实验。M.S.提供了无脊椎动物群落。w.j.， b.n.， s.n.和M.V.C.运行和分析PTR-ToF-MS测量，而M.V.C.执行所有GC-MS鉴定和定量。G.H.处理和分析转录组数据。M.V.C.写了手稿的初稿，M.V.C.和W.J.准备了数字。所有作者都参与了原稿的起草，并批准了原稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba约尔格 - 彼得·施尼茨勒GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

在“濒危野生动物群和植物群”贸易公约之后，在该领域收集了果树的种子。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba．Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。GydF4y2Ba

重印和权限GydF4y2Ba