玫瑰AP2/ERF基因家族的整体分析(罗莎对）基因组揭示了角色RcERF099在葡萄孢属阻力

背景

AP2/ERFs属于植物转录因子的一个大家族。AP2/ERF基因家族在植物的生物和非生物胁迫响应中起着关键作用，但目前对玫瑰AP2/ERF基因家族的研究尚不全面(罗莎SP。），全球最重要的观赏作物。

结果

本研究包括对AP2 / ERF家族基因的基因组分析（Rcerfs.)，包括它们的鉴定、基因结构、系统发育关系、染色体定位、共线性分析以及表达模式。通过系统发育分析，共131例AP2 / ERF.玫瑰基因组中的基因分为5个亚组。的Rcerfs.分布在玫瑰的所有7条染色体上，基因组复制可能在它们的复制中起着关键作用。此外，Ka/Ks分析表明重复Rcerf.基因通常经过纯化选择和有限的功能分化。基因表达分析显示23Rcerfs.是由坏死的真菌病原体感染引起的吗葡萄孢菌．据推测,这些Rcerfs.是否有可能对玫瑰的抗性产生反应的候选基因葡萄孢菌感染。通过病毒诱导的基因沉默，我们证实了这一点RcERF099是否有重要的监管机构参与B.Cinerea.玫瑰花瓣中的阻力。

结论

总体而言，我们的结果得出了进一步研究玫瑰AP2 / ERF基因家族的必要性，并促进其在受生物应激时改善玫瑰的潜在应用。

转录因子是植物中各种诱导基因表达的重要调节因子，并在植物生长，发育，应力反应以及病原体防御中发挥不可或缺的作用[1］．转录因子通常包括一个核定位信号、一个DNA结合域、一个反转录域以及一个寡聚化位点。这些结构域决定了亚细胞定位、顺式调节元件的结合以及转录因子的调节功能[2］．

AP2/ERF超家族是植物中最大的转录因子基因家族之一，在拟南芥中共鉴定出147个AP2/ERF家族成员。AP2/ERF基因家族由60 ~ 70个氨基酸组成的AP2/ERF结构域组成，识别调节靶基因反应的顺式调节元件GCC box或DRE元件[3.］．AP2 / ERF基因家族可以进一步分为五个亚壳，实施例ERF，AP2（APETALA2），DREB（脱水响应元件结合），RAV（与ABI3 / VP1相关）和独奏者[4，5，6］．已经检测到在整个工厂生命周期中调节增长和发展的AP2 / ERF。当植物暴露于非生物应力时，AP2 / ERF也起到非常重要的作用，例如脱水，盐度，低温或热应激。例如，过表达的转基因拟南芥AtERF4对干旱胁迫更敏感，对氯化钠的抗性更低[7］．此外，过度表达RAP2.6基因(有关AP2.6(编码一个ERF转录因子)导致拟南芥萌发和生长早期对ABA(脱落酸)和盐/渗透胁迫敏感表型[8］．

更重要的是，AP2 / ERF基因家族是被认为参与植物防御反应的转录因子之一[9，10.，11.，12］．例如，文字记录ERF1是在接种坏死营养真菌后显著诱导的吗葡萄孢菌，过度表达ERF1在拟南芥中增强了对这两种病毒的抵抗力b .灰质和Plectosphaerella cucumerina［13］．过度表达ERF5或者ERF6也增加了对b .灰质在拟南芥和erf5 erf6双突变体的易感性显著增加[14］．

玫瑰是最受欢迎的观赏作物，占全球切花销售额的30%以上[15］．然而，花是一个脆弱的器官，长途运输会导致玫瑰花受到收获后的疾病，如灰霉病造成的b .灰质．AP2/ERF转录因子在抗病中的作用已经在模型植物拟南芥和许多其他植物物种中得到了研究。然而，尚未发现与抗病相关的玫瑰AP2/ERF家族基因。

最近，我们对玫瑰花瓣进行了从头RNA-Seq分析b .灰质．该转录组研究显示大量玫瑰基因，包括AP2 / ERF家族转录因子，显着上调并暗示其抵抗抵抗b .灰质［16］．本研究对月季AP2/ERF基因家族进行了全基因组鉴定和分析。通过病毒诱导基因沉默(VIGS)，我们进一步证实了这一点RcERF099起着重要的作用b .灰质玫瑰花中的抗性。

识别Rcerf.玫瑰基因组中的基因

为了识别潜力AP2 /小块土地的r对，我们从pam数据库下载了AP2/ERF HMM配置文件(PF00847)。利用该图谱作为查询，对玫瑰基因组进行HMM搜索，最终确定了137个候选序列Rcerf.基因。保守域名数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi.)及ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/）被雇用核实所有候选人Rcerfs.包含单个AP2/ERF motif。我们进一步去除了少于150个氨基酸的序列，最终得到131个非冗余的序列Rcerf.基因。所有这些131.小块土地家族基因可以映射到玫瑰染色体上，我们指定了基因RcERF001来RcERF131按照它们的染色体顺序。

编码的蛋白质的长度Rcerf.家族基因由150到832个氨基酸组成，平均长度为298个氨基酸。最长的RcERF052包含832个氨基酸，而最短的只有150个氨基酸(RcERF093和RcERF095)。表格1总结了所有131个的详细信息Rcerf.基因，包括它们的登录号，染色体位置，外显子和内含子的细节，蛋白质大小和分类。

染色体定位与微共时性分析

131Rcerf.基因位于所有7条玫瑰染色体上，如图所示。1．染色体2包含最多的Rcerf.基因（31），其次是染色体7（26）。染色体3和5含有最小数量的染色体（11）。的Rcerf.7条染色体上的基因分布不均匀。8.40%的Rcerf.S分别位于第3号和第5号染色体的长臂上，占23.66%Rcerf.S位于2,15.27％的染色体中Rcerf.S分别位于1号染色体上，占10.69和13.74%Rcerf.S分布在4号和6号染色体上。7号染色体含有19.85%Rcerfs.，它们分布在长短短臂上。

此外，我们研究过Rcerfs.在玫瑰基因组中共发现21对基因对2)．只有一对基因位于同一染色体上(Rcerf021和Rcerf042.），表明它们可能是串联的重复。剩余的20个基因对位于不同的染色体上，并表明在这些区域中可能发生节段重复（图。2)．

探究重复之间的选择约束Rcerf.基因，我们计算了21对重复基因的同义（KS）与同义（KS）核苷酸取代（Ka / Ks比）的比率（表2)．Ka/Ks比值< 1表示基因对的阴性选择或纯化选择，而Ka/Ks > 1表示阳性选择。我们的研究显示，所有的Ka/Ks比率Rcerf.基因对<0.4（表2)．这些数据表明了Rcerf.基因对经历了净化选择，功能分化有限。

系统发育与外显子-内含子结构分析Rcerf.基因

我们对所有人进行了系统发育分析Rcerf.基因使用邻近加入方法并建立了系统发育树。根据他们的进化关系，Rcerf.基因进一步划分为5个支持引导值的亚家族，分别为ERF、DREB、AP2、RAV和Soloist，分别由64个、42个、18个、4个和3个成员组成。

后续分析外显子性结构与系统发育分析结果一致。大多数基因聚集在同一亚家族中具有类似的外显子结构。然而，RAV子家族的成员不包括内含子，然而，相比之下，AP2和Soloist亚家族基因包含4至12个内含子。大多数ERF和DREB子家族成员都没有内含子或只有一个，但是，也观察到一些例外;例如，RcERF011和Rcerf045.有两个内含子和RcERF107有三个(图。3.;表格1)．这些结果表明，这些亚科之间存在高度保守的结构，而不同亚科之间存在多样性。

越来越多的证据表明，AP2/ERF转录因子在各种植物的抗病中发挥着关键作用(表1)3.)．为了评估Rcerfs.研究结果显示，与玫瑰抗病相关的erf和所有的rcerf组成了一个复合系统发育树(图1)。4)．在这棵复合系统发育树中，每个亚家族用不同的颜色标记，所有已知与抗病相关的植物ERFs均以粗体表示。参与调节防御反应的ERF分布在ERF和DREB亚家族中，但不在AP2、RAV或Soloist亚家族中。

的表达Rcerf.基因对葡萄孢菌感染

从研究各种植物物种获得的证据增加了越来越大，这表明植物AP2 / ERF转录因子在病原体反应中发挥着重要作用。为了研究的作用Rcerfs.在b .灰质我们分析了30 hpi和48 hpi时玫瑰花瓣的转录组数据。hpi时间点30表示对感染的早期反应，而hpi时间点48表示对感染的晚期反应[16］．共23个Rcerf.基因（RhERF004、RhERF005、RhERF015、RhERF019、RhERF023、RhERF024、RhERF054、RhERF063、RhERF064、RhERF066、RhERF068、RhERF070、RhERF072、RhERF080、RhERF088、RhERF089、RhERF092、RhERF093、RhERF095、RhERF099、RhERF114、RhERF123、RhERF125）显着上调，表明它们可以是抵抗的关键调节因素b .灰质感染上升。在这些b .灰质全身的Rcerfs.，表示10Rcerf.基因在30 hpi显著增加，表明这些Rcerfs.可能会牵涉到早期的反应b .灰质(表4)．

为了进一步验证来自RNA-seq的表达谱，表达了6个Rcerf.采用qPCR分析。qPCR分析的结果与转录组分析得到的表达谱一致。5)．

RCRF099是玫瑰抗性所必需的b .灰质

为了进一步说明。的潜在作用b .灰质全身的Rcerf.这种病原体抗性的基因，我们用Vigs击倒了表达RcERF099在玫瑰花瓣。RcERF099选择进行本次VIGS研究，原因如下:RcERF099上调后b .灰质感染(图。5;表格4）;2)基于系统发育分析，RcERF099属于DREB亚家族，包括许多抗病的小块土地起源于其他植物物种，如ATERF001.，ATERF004.，ATERF005.，ATERF006.，AtERF014， 和AtERF015（图。4;表格3.)．

为了保持沉默RcERF099在玫瑰花瓣中，我们克隆了一个230bp的片段RcERF099转化为pTRV2载体[27)来生成TRV-RcERF099．农杆菌肿瘤术携带TRV-RcERF099和TRV1.［27]共同渗透到玫瑰花瓣片中生成RcERF099- 玫瑰花瓣。然后接种渗透玫瑰花瓣盘b .灰质．比较控制瓣(TRV-00)接种空株TRV后，接种植株TRV-RcERF099表现出更严重的疾病症状，病变的大小明显增加(图。6A和B）。此外，我们证实了QPCR毒力量的沉默效率（图。6c).这些结果表明RcERF099玫瑰抵抗是必需的吗b .灰质．

植物抗病相关基因往往是由病原菌入侵诱导的，并在转录水平上受到特定转录因子的调控。AP2/ERFs是植物中主要的转录因子家族，在多种植物中已被证明具有重要的抗病功能[28，29，30.，31，32］．在拟南芥和水稻中进行了AP2/ERF基因家族的全基因组分析[4］．到目前为止，尚无关于玫瑰AP2/ERF基因家族的全面分析报道，并对其中大部分的功能进行了研究Rcerfs.基本上是未知的。本研究利用最近获得的玫瑰基因组，对AP2/ERF基因家族进行了全面分析，包括基因结构、系统发育、染色体定位、基因复制以及在真菌坏死病原菌感染灰霉病过程中的表达谱b .灰质．

的数量AP2 / ERF.玫瑰（131）的基因已被证明低于拟南芥（147）和稻米（164）[4这表明AP2/ERF基因家族在不同植物的进化过程中有不同程度的扩展。此外，我们指出，基因复制参与扩大Rcerf.基因家族，共鉴定了21个重复事件。大部分重复基因(20个)参与了片段重复，只有一个参与了串联重复。有趣的是，这21个的Ka/Ks比值Rcerf.复制品是<1，表明Rcerf.基因家族经历的是一种纯化而非正向选择，表明这一重要转录因子在基因家族中具有高度保守的进化。先前已经证实，参与入侵病原体的种特异性识别的植物免疫受体基因经历了正选择压力[15］．它进一步表明Rcerfs.通常涉及对病原体的基础防御，不是种族特异性的阻力。

尽管Rcerfs.在抗病性尚不明确的情况下，越来越多的证据已经证明了植物的抗病性AP2 / ERF.基因是调节植物抗病性的重要角色。它促使我们寻找候选人Rcerfs.这参与了抵抗力b .灰质在玫瑰。根据他们的表达，响应灰色霉菌侵扰，我们确定了23Rcerfs.这很可能参与玫瑰花瓣中的灰色耐刨花。

我们随后在RcERFs系统发育树中添加了已知与抗病相关的植物ERFs。我们发现这些与疾病相关的ERF主要分布在ERF和DREB亚家族中。的RcERF099属于Dreb亚家族，其中包括某些已知的疾病相关植物成员小块土地基因(图。4)．特别是，RCERF099具有拟南芥ATERF014的紧密同源物，这已经证明已经在对细菌病原体的抵抗力中发挥着重要作用两PV。番茄，以及真菌病原体尖孢镰刀菌和b .灰质［22］．更重要的是,RcERF099被显着诱导b .灰质．因此我们认为RcERF099应被认为是参与调控月季抗病性的重要候选基因。的沉默RcERF099在玫瑰花瓣中增加了它的敏感性b .灰质，表明其在抗灰霉病方面具有正向调节作用。

pt？>在本研究中，对基因组的分析Rcerfs.进行了。共131个非冗余AP2 / ERF.家庭成员在玫瑰基因组中识别出来，这些成员Rcerfs.根据系统发育和保守域划分为5个亚科。表达分析表明，一定的转录调控作用Rcerf.家族基因是由b .灰质玫瑰花瓣感染。此外，涉及疾病抗性的植物ERF通常在系统发育树的同一分支上聚集。根据这些分析，使用Vigs，我们进一步证明了这一点RcERF099参与调节抵抗b .灰质在玫瑰花瓣。这些结果随后的信息可能有助于进一步研究Rcerfs.功能和作物改良。

鉴定玫瑰AP2 / ERF家族基因

玫瑰的基因组序列和CDS序列从网站下载（https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/pub/rchiobhm-v2/)建立本地基因组数据库。基于AP2/ERF HMM (Hidden Markov model)的Pfam (PF00847，http://pfam.xfam.org），我们初始鉴定玫瑰基因组中的AP2 / ERF候选基因与E值<1E⁻³．最后，验证了所有候选AP2 / ERF序列，使它们通过CDD（保守的域数据库）包含至少一个AP2 / ERF域;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi.)及ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/)．除去没有相关结构域或保守基质的序列。每个染色体分布AP2 / ERF.使用Mapchart 2.2软件进行基因图谱绘制[33］．

RcERFs的基因结构和系统发育分析

外显子系统结构的地图Rcerf.基因使用TBTOOLS软件进行[34]通过将编码序列(CDS)与其对应的蛋白质序列进行比较。此外，系统发育分析Rcerfs.在MEGA 6.0软件中采用NJ法进行，并进行1000个重复的引导试验。

此外,17小块土地以前报道涉及抗病性。这些小块土地源自各种植物物种，包括番茄（Solanum lycopersicum）， 白饭 （奥雅萨苜蓿），大豆（甘氨酸最大),拟南芥．然后使用CLUSTALW对准这些抗性相关的ERF和玫瑰AP2 / ERF的氨基酸序列。导致导致的蛋白质序列的对准随后用于系统发育分析。使用Mega 6.0软件中的NJ方法进行系统发育分析[35]并使用1000重复进行引导测试。在系统发育树状轴图上，复制树木的百分比，其中在引导测试中聚集在一起的相关分类卡在分支旁边表示。

共线性分析

的共线性Rcerfs.，我们在本地服务器上下载了玫瑰的基因组序列，并下载了多重共线性扫描工具包[36]来确定微同连体之间的关系Rcerf.基因。通过CollineArscan设置在<1e的E值下进一步评估所得微织物的关系⁻¹⁰．

非同义(Ka)到同义(Ks)替代率的计算

TBTOOLS用于计算同义（KS）和非同义（KA）核苷酸替代率。计算重复基因对的Ka / Ks比以确定驱动进化的选择模式Rcerfs.．

的表达Rcerfs.为了应对b .灰质

玫瑰花瓣的RNA-SEQ数据（登录号PRJNA414570）正在进行中b .灰质从国家生物技术信息（NCBI）数据库中下载感染。清洁测序读数被映射到罗莎对“Old Blush”参照基因组。基因表达水平Rcerfs.是根据每百万次读取读取数(RPKM)计算的。以Log2 fold change为基础的差异表达基因由DEseq2执行。为了验证RNA-Seq结果，对6Rcerf.采用定量PCR (qPCR)方法进行基因分析。为此，分别在接种后30 h和48 h提取玫瑰花瓣总RNA (hpi)b .灰质使用如前所述的热硼酸法方法[37］．1微克经dnase处理的RNA用HiScript II Q Select RT SuperMix (Vazyme)在20 μ l的反应体积中合成第一链cDNA。采用SYBR Green Master Mix (Takara)进行qPCR反应，StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)进行检测。RCUBI2.被用作内部控制。表达分析采用delta-delta-Ct法计算方法。用于qPCR的所有引物列于补充表S1．

中收取,b .灰质接种化验

玫瑰植物（Rosa Hybrida）在本研究中使用的是在云南，中国的温室里种植在土壤中。为了获得沉默的构造，A 230bp序列RcERF099采用引物TRV-RcERF099-F (5 ' - GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCTCATTTGGGTCCTATACT−3 ')和TRV-RcERF099-R (5 ' - GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGTAATATCTTCAAGCAATT−3 ')扩增。生成的片段随后被克隆到TRV2.向量(27］．分离的玫瑰花瓣的VIGS已经在以前描述过[38］．简而言之，脱离的花瓣是从玫瑰的最外轮上获得的，并且打孔了15毫米的花瓣盘。组成的土壤杆菌TRV1.［27] 和TRV2.结构物按1:1的比例混合，真空渗入花瓣片。然后接种花瓣片b .灰质在感染TRV后6天。至少进行3次生物重复，每次重复使用至少16个磁盘。在接种后60 h估计疾病的病变，一个学生的t-进行检验以确定其重要性。本研究所用引物见补充表S1．

本研究中使用和/或分析的数据集已包含在补充数据中。玫瑰花瓣RNA-Seq的原始数据b .灰质感染可以在Bioproject数据库中找到（加入NR。Prjna414570）。植物材料可根据要求提供。

HPI：

接种后的小时

NJ：

邻接

嗯:

隐马尔可夫模型

CDD:

保守域数据库

伟大的人：

病毒诱导的基因沉默

不适用。

本研究由国家自然科学基金资助(资助号:31772344和31972444)，资助对象为赵章。陕西省自然科学基金(no . 2019JQ645)，中央高校基本科研业务费专项资金(no . 2452019112)，西北农林科技大学优秀人才科研启动基金(no . 2452019040)资助。资助机构不参与研究设计、数据收集和分析、决定发表或编写稿件。

作者笔记

1. 李丹丹和刘欣桐对这项工作做出了同等的贡献。

隶属关系

1. 北京观赏作物，中国农业大学观赏园艺系的观赏作物开发与质量控制重点实验室，袁明源Xilu 2，北京100193

   丹丹李，新通刘，石亚张赵张

2. 西北A＆F大学农学院，杨凌，陕西712100

   Lizhe Shu＆Yin Song

3. 北京市园林研究所北京市绿化植物育种重点实验室，北京

   华张

贡献

Z.Z.，Y.S.，D.L.和X.L.构思和设计了实验。D.L.，X.L.，L.S.，S.Z.和Y.S.进行实验并分析数据。Z.Z.，Y.S.，H.Z.和D.L.写了这篇论文。所有作者都已读取并批准了稿件的最终版本。

相应的作者

对应于阴的歌或者赵张．

伦理批准并同意参与

不适用。我们的研究没有涉及任何人类或动物科目，材料或数据。本研究中使用的植物材料由中国农业大学提供，并在机构，国家和国际准则之后自由参加研究目的。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明了该研究在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

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