干旱胁迫下气孔导度相关的候选基因和单核苷酸多态性gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

了解葡萄植物对水分亏缺反应的复杂性是可持续葡萄酒种植的主要挑战。用水的调节需要接穗和砧木之间的协调行动，栽培品种通常嫁接在砧木上以应对根瘤蚜的侵袭。在这方面，全基因组关联研究(GWAS)方法应用于“特设”关联映射小组，包括不同的基因gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba为了解剖蒸腾相关性状的遗传基础，并确定与耐旱机制相关的葡萄砧木基因组区域。gydF4y2Ba

利用GrapeReSeq Illumina 20 K SNP阵列和SSR标记进行基因分型，并利用红外热像仪估算渐进式水分亏缺过程中的气孔导度值。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在关联小组中，SNPs位点的遗传多样性水平(0.32)明显低于SSR位点的遗传多样性水平(0.87)。在干旱胁迫试验的各个阶段，GWAS检测到24个显著的标记-性状关联，并鉴定出13个在干旱响应中具有可能作用的候选基因。gydF4y2Ba

基因表达分析证明，其中三个基因(gydF4y2BaVIT_gydF4y2Ba13 s0019g03040维特gydF4y2Ba_17s0000g08960gydF4y2Ba，gydF4y2BaVIT_18s0001g15390gydF4y2Ba)实际上是由干旱胁迫引起的。gydF4y2Ba

通过对85个个体的基因重测序，进一步研究了棉子糖合成酶编码VIT_17s0000g08960的遗传变异，因为位于该区域的一个SNP (chr17_10,497,222_C_T)与气孔导度显著相关。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的研究结果在研究葡萄砧木对水分剥夺反应的遗传基础方面迈出了一步。从本研究中获得的知识可能有助于在实际应用中开发基因型和表型多样性，并协助进一步的研究。gydF4y2Ba

气候变化正在强烈影响人类生活和自然系统[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，这对全球农业产生了巨大的影响，因此葡萄栽培也必须面对这些新的环境条件。在非生物胁迫源中，干旱是影响植物生理的主要因素[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．因此，了解植物对缺水反应的复杂性对研究人员来说是一个重大挑战。gydF4y2Ba

葡萄被认为是一种相对耐旱的植物，因此气候变化对葡萄栽培可持续性的影响是一个激烈辩论的主题[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．然而，减少水消耗和提高葡萄树水分利用效率(WUE)的策略对未来至关重要[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．水分亏缺严重影响果实品质，造成作物产量的重大损失。特别是，长期干旱可能会对即将到来的生长季节产生影响[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]并可增强对生物害虫或病原体的敏感性[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

干旱胁迫响应是细胞和系统水平复杂的动态生理、生化和分子过程的结果。水分亏缺导致植物生长[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，气孔导度[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]和木质部的水导率[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba减少)。同样地，干旱诱发了抵消ROS有害影响的机制[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，以调节细胞内稳态[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]和提高水分的吸收[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．抗根瘤蚜砧木对植物水分平衡的调节也有很强的影响[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]，它们的耐旱性有很大的变化[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，对气孔导度的调节作用显著[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．然而，人们对砧木干旱响应的遗传基础了解甚少，关于砧木是否会改变接穗的基因表达的研究很少[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]或它们之间是否有遗传物质的交换[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

以前的研究旨在确定葡萄干旱响应的遗传基础[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]并在双亲人群中进行。目前在葡萄中报道的全基因组关联研究(GWAS)还很少，但在果实品质性状中发现了有趣的关联[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]，叶形态[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]和与驯化相关的性状[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．然而，迄今为止尚无关于葡萄干旱响应的遗传控制的GWAS研究报道。此外，正确和准确的表型在分析与耐旱性有关的基因组区域中起着关键作用[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．在这方面，近年来，叶绿素荧光、近红外(NIR)和高光谱成像技术在评估葡萄表型方面的应用越来越普遍[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．在本研究中，红外热成像技术的应用可以评估“特别”葡萄核心收集中砧木对水分亏缺的反应，减少了表型数据收集的时间，从而可以筛选多种基因型。采用GWAS方法分析了蒸腾相关性状的基因组基础，旨在确定与作物抗旱性遗传改良可能相关的遗传区域。gydF4y2Ba

葡萄砧木的遗传核心集合gydF4y2Ba

该研究对100人组成的遗传核心集进行了研究gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Basp . accessions，列于表SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba．为了将这组基因高度多样化的葡萄品系定义为“特设”协会小组，采用了两步程序。首先，创建一个核心集合gydF4y2Banon-vinifera葡萄gydF4y2Ba用于果实生产的种间杂交品种，保存在埃德蒙·马赫基金会的葡萄种质资源收集处[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]，以增加野生葡萄、砧木和杂交种之间的等位基因多样性为基础，基于21个微卫星。因此，根据m -方法，98个加入足以捕获分析的231个样本中存在的总等位基因多样性(412个等位基因)。随后，来自米兰大学育种计划的41个砧木和另外6个附加的商业砧木(Paulsen 1103、Kober 5BB、Selection Oppenheim 4、Millardet et de Grasset 41B、Millardet et de Grasset 101.14和140 Ruggeri)被包括在内，获得145个个体。为了使关联组易于管理，以最小的重复性充分捕获尽可能多的遗传多样性，再次基于m方法进一步减少到100个样本。在这一步中，6个商业砧木和41个从育种计划中获得的砧木中的4个(M1, M2, M3, M4)被任意强制包括在内。在最终的关联面板中，SSRs保留的不同等位基因数量为425个。gydF4y2Ba

核心种质的遗传多样性gydF4y2Ba

利用SSR (gydF4y2BangydF4y2Ba= 21)和SNP (GrapeReseq 20 K SNPs数组)标记(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。对于snp，在去除低质量位点后，过滤后的数据集由16,562个snp组成。此外，作为缺失基因型鉴定的结果，小等位基因频率(MAF)低于0.1的snp被额外去除，最终保留7133个筛选的snp。平均有效等位基因数为1.51。SSR标记共获得425个不同的等位基因(A)，平均每个位点20.24个，等位基因频率在2.66 ~ 17.42之间，平均10.07。观测值(HgydF4y2Ba_OgydF4y2Ba= 0.77)和预期(HgydF4y2Ba_EgydF4y2Ba= 0.87)杂合度几乎是SNP标记估计杂合度的3倍(分别为0.26和0.32)。SNPs的F指数(近交系数)为0.19，高于SSR标记(0.12)。gydF4y2Ba

如果分别考虑杂交种、砧木/野生和砧木育种组，多样性参数会发生变化。SSR位点的等位基因数在砧木育种组为195个，在砧木/野生组为341个;SNP位点的等位基因数在砧木育种组为13467个，在砧木/野生组为14197个。SSR位点的平均有效等位基因数在砧木育种中为5.47，在野生砧木育种中为8.40，而SNP位点的平均有效等位基因数在砧木育种中为1.32，在杂交中为1.71。对SSRs的预期杂合度估计在0.78(砧木育种)到0.84(砧木/野生)之间，snp的杂合度估计在0.20(砧木育种)到0.40(杂交)之间。与此相反，Rootstocks/Wild亚群的SSR(0.74)和SNP(0.19)杂合度最低。最终，在SSR位点和SNP位点上，砧木组和野生组的F指数最高(分别为0.12和0.17)，杂种组的F指数最低(SSR位点为−0.01,SNP位点为−0.03)。gydF4y2Ba

核心集合的种群结构gydF4y2Ba

利用DAPC和structure对所分析群体的遗传结构进行了研究。基于SSR标记，DAPC分析确定了三个聚类(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).集群1主要包括砧木和其他gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba类群2和类群3分别以育种砧木(81%)和杂交种(100%)为主。STRUCTURE软件在SSR数据集上基于模型的贝叶斯聚类方法gydF4y2Ba1gydF4y2BaB)在不同的可能的亚种群数量方面给出了相似的结果。ΔK方法[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]在K = 3时赋值最高，导致砧木/野生砧木、杂交种砧木和育种砧木在3个截然不同的类群中分离。另一方面，对于SNP数据集，同样的分析显示在K = 2时ΔK值最高，将hybrid与其他进行了区分gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba虽然在K = 4时也发现了较小的种群分层信号(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaD)，在这种情况下，杂交表现出高水平的遗传混合物。基于SNP标记的DAPC分析也确定了四个聚类(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac):聚类1和聚类2主要由杂交砧木组成(分别为40%和60%)，聚类3主要由育种砧木组成(95%)，聚类4包括大部分的野生砧木(55%)。gydF4y2Ba

干旱胁迫下关联系的表型特征gydF4y2Ba

将100个品系的葡萄进行亏灌(T2-T7)或在充足水分条件下维持30 d，在2年内反复评价干旱胁迫下的群落蒸腾速率。在施加水分亏缺(T1)之前，在充足的水分条件下监测水分紧张的葡萄藤一周。干旱胁迫处理导致气孔导度显著降低(IgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba)，但只有在第二年试验水分胁迫植株在恢复期后才达到与对照植株相当的蒸腾值(T8-T9)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。IgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba在对照组(WW)和水分胁迫(WS)植株间，分别观察了作物水分胁迫指数(CWSI)和作物水分胁迫指数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

全基因组关联分析gydF4y2Ba

采用GLM和MLM方法对与气孔导度相关的蒸腾特性进行了GWAS分析。GLM + Q被选为基于分位数-分位数图比较的最佳模型，用于调查中发现的大多数性状的关联。在第一年的T4和T9试验中，首选MLM + K模型。表格gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba报告了24个显著的snpgydF4y2BapgydF4y2Ba-在多次测试修正后的值。在第一年试验中，水分胁迫植株T3、T4、T5和T9时间点的气孔导度(Ig)值与标记-性状显著相关(图SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。在第一年的实验中发现的24个SNPs中的5个标记在Bonferroni校正后也是显著的。SNP chr17_10,497,222_C_T在重度水分胁迫(T5)下表现出显著相关性，两个SNP (chr13_11,950,617_C_T, chr18_13,519,938_C_T)在中度水分胁迫(T4)下表现出显著相关性，两个SNP (chr3_7,009,222_A_G和chr16_21,122,534_A_G)在恢复期(T9)后与蒸腾作用显著相关。24个snp中有19个仅在错误发现率校正(FDR)后被发现显著相关，因此，在这里被确定为提示性关联;第一年实验在中度胁迫(T3、T4)和恢复(T9)期间检测到13个，第二年实验在T1和T9，即(恢复)水胁迫前后分别检测到6个。GWAS与第二年实验中收集的表型数据在Bonferroni校正后没有发现任何显著的相关性(图SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。圆形曼哈顿地块(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)总结了两个实验的所有关联结果。gydF4y2Ba

通过检测相关的snp来鉴定潜在的候选基因。首先，考虑多态性是否局限于基因区域。在24个显著的snp中(表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba) 15个位于基因内，其余snp位于基因间区。对于那些位于基因区域外或功能上未注释的基因中的标记，扫描了它们周围的20千碱基，因为据报道，连锁不平衡(LD)在葡萄藤中迅速衰减[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．表中列出了13个候选基因，根据其与水分胁迫反应相关的生物学功能或其位置选择gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

GWAS结果的验证gydF4y2Ba

验证基因内snp的标记-性状关联gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba，gydF4y2BaVIT_16s0098g00780, VIT_13s0106g00790gydF4y2Ba而且gydF4y2BaVIT_13s0019g03040,gydF4y2Ba选择16个砧木品种进行进一步的水分胁迫研究。在整个实验过程中，用稳态孔隙计测量了WW和WS植物的蒸腾速率。在基因编码区，杂合植物和纯合植物的SNPs存在显著差异gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba而且gydF4y2BaVIT_13s0019g03040gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，而携带不同基因变异的植物气孔导度无差异gydF4y2BaVIT_16s0098g00780gydF4y2Ba而且gydF4y2BaVIT_13s0106g00790gydF4y2Ba(数据未显示)。就目前而言gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba在WW植物中，该SNP杂合的砧木在胁迫开始(T1)和WS植物中中等水分胁迫(T3)时蒸腾速率明显低于其他品种(表SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，但重度胁迫(T4、T5)时气孔导度值也较低。关于突变gydF4y2BaVIT_13s0019g03040,gydF4y2Ba在水分胁迫植物的中度胁迫(T3)和重度胁迫(T5)以及对照植物的试验开始和结束(T1, T8)，纯合子组和杂合子组之间存在显著差异(图5)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba表SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

干旱胁迫下候选基因的表达分析gydF4y2Ba

候选基因的表达gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba，gydF4y2BaVIT_18s0001g15390gydF4y2Ba，gydF4y2BaVIT_16s0098g00780, VIT_13s0106g00790gydF4y2Ba而且gydF4y2BaVIT_13s0019g03040gydF4y2Ba进一步研究了水分胁迫。4个砧木基因型(Richter 110、Riparia Gloire de Montpellier、101.14 Millardet et de Grasset和SO4 Selection Oppenheim)在胁迫条件下进行了14天的水分剥夺。根据候选基因的SNP chr17_10,497,222_C_T，选择这些基因型来代表对水胁迫的不同响应类别gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba(表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在整个实验过程中测定了土壤含水量和气孔导度，以监测应力演化(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。WS植物(水分胁迫)土壤含水量持续下降，从实验开始的第4天开始显著下降。有趣的是，从停止灌溉后8天开始，SO4的含水量明显高于其他基因型。另一方面，在整个试验期间，WW对照植株的土壤水分保持在30%左右。气孔导度被认为是植物对干旱响应的参考参数，从第4天开始，所有砧木水分亏缺显著降低了气孔导度。植物在缺水两周后表现出不同程度的耐受性。SO4的叶子几乎保持绿色和肿胀，而110R和101.14显示出一些植物胁迫的迹象，RGM藤蔓受到了严重的破坏(图S .14)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

研究了四种基因型叶片组织中候选基因在渐进式干旱胁迫下的表达情况。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。mRNA水平gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba在缺水4天后，当植物出现第一次胁迫迹象和蒸腾显著减少时，SO4含量显著升高(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，而其表达在实验后期有所下降。的相对表达式gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2BaRGM、110R和101.14对干旱响应不显著。关于gydF4y2BaVIT_18s0001g15390gydF4y2BaRGM和101.14在6天后，110R和SO4在11天后达到表达峰值，水分亏缺也会提高其转录水平。观察到类似的时间-过程剖面gydF4y2BaVIT_13s0019g03040gydF4y2BamRNA在四种基因型中被显著调节。gydF4y2BaVIT_13s0106g00790gydF4y2Ba仅在RGM植株中表达上调，且在第6天时表达量较高。的相对表达式gydF4y2BaVIT_16s0098g00780gydF4y2Ba在实验过程中基本保持不变。gydF4y2Ba

候选基因重测序gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba在协会人群中gydF4y2Ba

的编码区，以检测潜在的致病变异gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba在85个核心样本中进行了测序(表SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。对编码序列2343 bp进行分析所观察到的关键遗传多样性参数汇总见表gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

VIT_17s0000g08960gydF4y2Ba包含4个外显子，在葡萄基因组数据库v2.1的基因注释中报道。重测序允许鉴定134个SNP，揭示多态性位点的频率等于每17 bp一个SNP。外显子区仅发现1例INDEL。核苷酸多样性(π = 0,007)和分离位点数(θ = 0,011)提供了核苷酸水平遗传变异的估计。另一方面，同义位点的核苷酸多样性值(0.015)远高于非同义位点(0.005)。此外，通过分裂估计遗传变异水平gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba表S报告了两个亚群(砧木和杂交种)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．与杂交种亚组(每33 bp 1个，π = 0,007， θ = 0,007)相比，Rootstocks亚组表现出更高的多态性率(每21 bp 1个)和更低的核苷酸多样性(π = 0,006， θ = 0,011)。中性检验使用Tajima的D值和Fu和Li的F值来估计。这两项试验均表明，无论是在整个数据集还是在砧木和杂交种的子集中，多态性均未表现出任何显著的中性偏离。对于所有检测到的69个突变，预测了非同义替换对蛋白质生物学功能的影响。17个显示PROVEAN评分低于- 2.5，这表明蛋白质可能发生了结构改变(表SgydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。此外，这些有害突变中的一些发生在很大比例的砧木种群中。gydF4y2Ba

葡萄砧木的遗传核心集合gydF4y2Ba

现有的葡萄种质资源是有价值的遗传资源，可用于研究葡萄抗旱机制的表型变异。构建遗传核心库已被证明是获得最佳数量的砧木基因型的适当策略，它可以捕获大型种质资源中所有最常见的等位基因，这与以往的研究一致[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．此外，利用遗传核心集进行标记-性状关联研究已应用于几个植物物种，并取得了很好的结果[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．我们的结果表明，在冗余度最小的情况下，需要相对较少的资源来代表整个遗传多样性，这可能是由于高杂合度gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba物种(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．类似的结果在gydF4y2Ba马吕斯gydF4y2Ba［gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]，也表现出高水平的杂合性，而在gydF4y2Bam . truncatulagydF4y2Ba［gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]其特征是等位基因杂合度较低。gydF4y2Ba

利用微卫星和SNP标记进行的分析已经证实了核心收集中相当程度的遗传多样性，这两者都被证明具有很高的信息量。相反，正如预期的那样，由于双等位基因性质的标记具有较低的辨别能力，并且在人群中检测较少比例的稀有等位基因，因此snp估计的杂合度水平与SSRs相比大大降低[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．Ho相对于H略有减少gydF4y2Ba_EgydF4y2Ba可能是受调查种群发生近亲繁殖的结果，如以往研究所述[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]，低F值也归因于葡萄的高杂合度。此外，与砧木/野生砧木和杂交砧木组相比，育种砧木组的遗传多样性总体上有所降低，因为它们是通过基于少数祖细胞的育种选择获得的。gydF4y2Ba

从核心种质的遗传结构上看，杂交种明显分为育种砧木和野生砧木。这一结果是可以预测的，因为杂交得到了杂种gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba栽培的葡萄种既携带有根瘤蚜抗性，又有相当比例的根瘤蚜gydF4y2Ba诉酿酒用葡萄gydF4y2Ba在他们的血统中[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

干旱胁迫响应的表型分析gydF4y2Ba

干旱条件下葡萄的水分利用效率受植物蒸腾速率的影响很大，因此可以认为蒸腾速率是葡萄水分利用效率改进的潜在目标[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．热红外成像被证实是估算气孔导度和研究蒸腾作用相关基因型变异的一种非常合适的工具。在试验的3年里，经受水分胁迫时，砧木表现出明显高于对照的冠层温度，反映了它们的水分状况。此外，从热图像中得到的Ig和CWSI参数与水分胁迫指标，如叶片水势(ΨL)、非光化学猝灭(NPQ)或光系统II的光能利用效率(PSII)显著相关[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．测量的时机对于确保满意的表型结果至关重要，这种方法允许在同一天和特定时间窗口内快速评估整个砧木种群(600株葡萄)的蒸腾速率，以限制环境影响，这是用孔隙计无法做到的。事实上，自从Blum等人最初开发热成像方法以来。[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]，不同种类作物的水分状况在各种研究工作中得到了广泛的研究，并取得了良好的成果，其中包括葡萄藤[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．该实验证明了热成像在检测基因组宽关联方面的有效性。此外，利用直接气孔导度测量对一个种群亚群的干旱响应进行分析，证明了这些结果的一致性。然而，为了全面了解植物的生理反应，必须在盆栽和大田实验中研究其他形态特征，如营养发育或根结构，并评估砧木-接穗相互作用的生理方面。gydF4y2Ba

全基因组关联分析gydF4y2Ba

GWAS研究目前是了解复杂性状遗传基础的一种有价值的方法[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]，特别是对那些具有多基因遗传的葡萄，如耐旱性，尽管这些分析在葡萄中没有广泛进行[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．根据尼古拉斯等人。[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]葡萄GWAS的理想关联面板应结合有限的亲缘性和最小的结构。为本研究设计的研究小组由杂交、野生和非杂交组成gydF4y2Ba酿酒用葡萄gydF4y2Ba(表S .gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)他们的血统中包括主要的美国人gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba物种，比如gydF4y2Ba诉锐利gydF4y2Ba，gydF4y2Ba诉? ?gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba诉rupestrisgydF4y2Ba．因此，它确保了很大的遗传变异性，此外，还表现出生物和非生物应力恢复力的未开发变异[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．然而，GWAS分析仅鉴定出5个snp通过了与所研究表型性状相关的Bonferroni显著性阈值。另一方面，使用FDR的不太保守的方法，发现了19个标记-特征关联。统计力的下降可能是由于葡萄中LD的快速衰减[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba这可能需要大量的snp才能均匀地覆盖基因组区域。在本研究中，GrapeReseq 20 K SNPs阵列被证明是检测显著基因型-表型关联的适当工具。该芯片包括针对47种野生和栽培基因型中发现的变异的探针gydF4y2Ba诉酿酒用葡萄gydF4y2Ba在其他6个样本的18个样本中，也鉴定出4978个snpgydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba物种。因此，它是合适的基因分型的核心集合，其中包含几个不同的gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba基因型。此外，阵列上的SNP标记根据其杂合度水平进行选择，并沿染色体均匀分布。事实上，该阵列已允许检测营养和生殖性状的qtl [Houel等人2015]，并对葡萄种质的遗传多样性进行了大量估计[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．另一方面，通过限制性位点相关DNA测序(RADSeq)或测序基因分型(GBS)方法，可以获得更多的SNP标记。最大限度地增加snp的数量可能确实会增加发现与表型显著相关的可能性。然而，这种策略需要对所发现的snp进行更准确的过滤，并且需要针对所研究的不同基因型进行预先优化。在本研究中，所调查的植物要么是杂交种，要么是来自不同品种的亲本gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba它们可能在高度重复的DNA区域存在限制性内切酶位点方面有所不同。此外，耐旱性是一种具有复杂多基因决定论的性状，具有很强的环境相互作用，因此，标记-性状关联分析可能需要高度精确的表型数据，以及包括更多个体和重复的实验小组，以检测轻微影响qtl。gydF4y2Ba

不同的研究表明，在水分亏缺条件下，砧木在调节接穗气孔导度方面的突出作用[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]，尽管气孔调节中的遗传决定论很少被研究。玛格丽特等。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]通过QTL分析，鉴定了与接穗蒸腾控制相关的砧木遗传区域，并对138个接穗个体的干旱响应进行了评价gydF4y2Ba诉酿酒用葡萄gydF4y2Ba简历。赤霞珠gydF4y2Ba诉锐利gydF4y2Ba简历。荣誉赞不绝口。后来，Coupel-Ledru等人。gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]分析了异水和异水葡萄子代气孔敏感性的遗传基础(gydF4y2Ba葡萄gydF4y2Bal . cvs。Grenache × Syrah)再次采用QTL方法。到目前为止，这些仍然是唯一专注于确定水分胁迫下气孔控制的遗传区域的研究。gydF4y2Ba

本研究采用的关联作图方法在干旱胁迫实验的各个阶段检测了显著的基因型-表型关联。然而，第二年的GWAS结果与第一年的结果并不一致。这一事实强调了应对植物耐旱性表型挑战的必要性，这可能受到多种非生物胁迫条件的影响，如过热[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．事实上，尽管实验是在隧道温室中进行的，外部条件的轻微不同可能会对内部温度产生影响。蒸腾响应也有差异。环境条件降低了对照植物第一年的气孔导度，水分胁迫植物在30% FC条件下蒸腾速率接近于零，复水后仅部分恢复。然而，在第三年用气孔计收集的种群子集的表型数据证实了一些关联，气孔计可以更准确地测量气孔导度。gydF4y2Ba

干旱条件下葡萄蒸腾作用的遗传研究[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]报告了在水处理过程中种群的全面特征，尽管低密度标记限制了QTL置信区间的分辨率，其中包括大的染色体区域。然而，在本研究中发现的大量显著相关的snp共同定位于这些QTL区域，甚至表明更多的限制位置。因此，QTL作图和GWAS分析相结合的综合策略的应用似乎是分析干旱胁迫响应等复杂性状的有效方法。gydF4y2Ba

潜在的耐旱性候选基因gydF4y2Ba

显著相关的SNP chr17_10,497,222_C_T (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)在第一年实验的严重水分亏缺条件下被确定。此外，其他关联信号为同一标记，这没有表现出显著性gydF4y2BapgydF4y2Ba-值经过多次测试修正后，分别在第一年(FC的50%)和第二年(恢复阶段)发现。此外，在第三年的实验中，在一小群砧木品种中验证了SNP与干旱条件下不同蒸腾速率的关系。事实上，在50%的FC条件下，具有杂合SNP的基因型(CT)与具有纯合SNP的基因型(CC或TT)相比，气孔导度显著降低。SNP chr17_10,497,222_C_T位于的编码区gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba，它编码棉子糖合成酶。棉子糖寡糖家族(RFOs)在保护植物抵御非生物胁迫方面起着重要作用[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba］．这些蛋白质通过韧皮部作为信号化合物，并作为额外能量资源的存储，赋予对干旱胁迫的耐受性。此外，它们还具有清除ROS的功能，稳定细胞膜和光合作用机制。这些碳水化合物的积累也提高了一些植物对水分胁迫的耐受性，如gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba紫花苜蓿gydF4y2Ba［gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]，gydF4y2BaXerophyta人造丝gydF4y2Ba［gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba［gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]，gydF4y2BaCoffeagydF4y2Ba［gydF4y2Ba80gydF4y2Ba),gydF4y2Ba马吕斯有明显gydF4y2Ba［gydF4y2Ba81gydF4y2Ba］．受干旱影响的葡萄的糖含量一般会整体减少[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]，可能是由于碳固定减少，但半乳糖醇和棉子糖除外，它们在水分亏缺条件下积聚[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，因此，这表明它们的生物合成与压力严格相关。此外，保护细胞中棉子糖等渗透性物质的浓度在气孔孔径调节中发挥作用[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba，gydF4y2Ba84gydF4y2Ba］．的参与gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba在干旱响应机制中，包括aba介导的信号传递，已被葡萄转录组研究证实。在水分亏缺条件下，等水和各向异性品种的叶片对其有差异调节[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba]在干旱条件下，梅洛葡萄叶中其含量升高[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，在转基因葡萄细胞中过度表达gydF4y2BaVvABF2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba86gydF4y2Ba]和ABA处理后的浆果[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba］．编码蛋白的系统发育分析gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba与拟南芥的胁迫诱导蛋白棉子糖合成酶5 (RS5)密切相关，RS5是水分胁迫下叶片中棉子糖积累的唯一原因[gydF4y2Ba88gydF4y2Ba］．的作用gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba其启动子的硅晶分析也支持了干旱胁迫响应，该启动子表现出主要aba响应元件(ABRE)和脱水响应元件结合(DREB)基序(ACGTG, RYACGTGGYR, YACGTGGC, ACGTGKC, ACCGAC)的一致富集[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba，gydF4y2Ba90gydF4y2Ba，gydF4y2Ba91gydF4y2Ba，gydF4y2Ba92gydF4y2Ba，gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．因此,gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba对85个砧木基因型的编码区进行了测序，以检测潜在的致病变异。其核苷酸多样性(π = 0,007)高于文献报道的葡萄基因区域的平均值(π = 0,0040-0,0051) [gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba94gydF4y2Ba，gydF4y2Ba95gydF4y2Ba，gydF4y2Ba96gydF4y2Ba]，这与高度多样化的关联小组的复杂性是一致的，其中包括不同的gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba物种和杂交种，从而呈现出较大的遗传变异性。种间杂交，包括gydF4y2Ba诉酿酒用葡萄gydF4y2Ba在其谱系中，与其他砧木基因型相比，显示出较低的多态位点频率。另一方面，如果考虑基因组非编码部分的突变，葡萄的遗传多样性在野生和栽培品种中分别为π = 0.015和π = 0.014， [gydF4y2Ba97gydF4y2Ba］．尽管最近发表了472人的全基因组重测序gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba据报道，野生品种的核苷酸多样性值为π = 0.0035，驯化品种的核苷酸多样性值为π = 0,0055 [gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．不幸的是，没有一个非同义的变化gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba编码区被证实位于LD，并在GWAS中鉴定出相关变异。因此，LD中具有显著同义SNP的假定致病突变可能位于尚未测序的基因组区域;顺式调控序列可以定位于基因内(内含子)或基因间(启动子和增强子)紧密围绕的区域，需要进一步研究。gydF4y2Ba

在GWAS实验中，SNP chr17_10,497,222_C_T与干旱胁迫条件下的气孔关闭显著相关，且具有显性效应，杂合(CT)基因型的气孔导度低于纯合(CC或TT)基因型。在这方面，在盆栽胁迫试验中，商品化砧木(代表三个基因型类)在干旱条件下进行了深入的表征。有趣的是，随着土壤含水量的降低，SO4葡萄被证明更能保持土壤水分。根据我们的结果，Tramontini等人[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]报道了在小盆限水条件下种植的不同基因型嫁接在SO4上的葡萄，与嫁接在高耐SO4砧木140 Ruggeri上的相同品种相比，能更有效地保持土壤水分。分析gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba水分亏缺期间的转录本表明，该基因仅在SO4葡萄中被调节。四天后，当植物开始感知压力的症状时，检测到明显更高的表达，这表明它可能与干旱胁迫的早期反应有关。因此，潜在的致病突变可能在转录调控中起作用。gydF4y2Ba

在其他显著相关的标记中，SNP chr18_13,519,938_C_T位于另一个干旱响应基因的启动子区域，gydF4y2BaVIT_18s0001g15390gydF4y2Ba它编码过氧化物酶蛋白。过氧化物酶是一种抗氧化酶，可防止ROS积累引起的过度损害，其浓度在非生物胁迫下高度调节[gydF4y2Ba98gydF4y2Ba，gydF4y2Ba99gydF4y2Ba］．此外，在干旱胁迫下，四种砧木基因型的转录本在整个实验过程中都呈逐渐增加的趋势，这表明其在胁迫响应中起着突出的作用。Bonferroni校正后的另外三个具有统计学意义的多态性，chr3_7,009,222_A_G, chr16_21,122,534_A_G和chr13_11,950,617_C_T分别位于参与转录起始的一个TF附近，在一个氨基酸水解酶的内含子区和一个非注释基因预测中。由于这些基因不能被认为与水胁迫反应直接相关，因此扫描了周围的基因组区域，但没有找到可靠的候选基因。然而，这些区域值得进行更深入的分析，因为候选基因方法可能会限制并排除与表型实际相关的非编码区域(启动子、增强子、沉默子等)[gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba］．Bonferroni校正检验是最常用的评估关联阈值的方法。然而，它往往过于保守，一些信号可能无法通过其严格的标准。因此，基于FDR建议的snp也被认为可以检测其他标记-性状关联。除chr13_4,177,522_C_T外，所有鉴定的标记只在一个胁迫阶段中发现。该SNP位于葡萄糖基转移酶蛋白(VIT_13s0019g03040)的编码区，在适度水分亏缺和充足水分条件下均显著。最近对模式植物的一些研究也表明糖基转移酶参与了非生物胁迫适应[gydF4y2Ba101gydF4y2Ba，gydF4y2Ba102gydF4y2Ba，gydF4y2Ba103gydF4y2Ba］．此外，我们观察到gydF4y2BaVIT_13s0019g03040gydF4y2Ba随着干旱试验的进行，其表达量不断增加，可能在干旱响应机制中起关键作用。最后，在中等干旱胁迫下的植物中发现了相关标记chr13_10,652,062_A_G，该标记位于甲丙酸二磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase, MVD)的编码区(VIT_13s0106g00790)。这是甲戊酸类异戊二烯途径的一种限制性酶[gydF4y2Ba104gydF4y2Ba]负责甾醇的形成，甾醇在维持细胞膜结构和防止氧化应激损伤方面发挥重要作用[gydF4y2Ba105gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

了解葡萄干旱胁迫反应的遗传基础对于葡萄园的管理和在不断变化的气候下培育新品种至关重要。在本研究中，利用GWAS方法检测了一些与蒸腾控制相关的遗传区域，这些区域可能与干旱恢复有关，并与作物改良有关。红外热成像技术的应用可以评估葡萄砧木对水分亏缺的反应，减少了收集表型数据的时间，从而可以筛选多种基因型。尽管所研究的性状及其多基因遗传的复杂性，但仍检测到显著的标记-性状关联。对商业砧木的进一步研究使我们能够指出几个候选基因(gydF4y2BaVIT_gydF4y2Ba13 s0019g03040维特gydF4y2Ba_17s0000g08960gydF4y2Ba，gydF4y2BaVIT_18s0001g15390gydF4y2Ba)可能与水分亏缺反应有关，为重要的耐受性性状提供了有价值的信息。这些结果强调了棉子糖合酶的相关作用，它属于寡糖家族，以保护植物免受非生物胁迫而闻名。gydF4y2Ba

植物材料与遗传核心库的构建gydF4y2Ba

该协会的人口由100个非gydF4y2Ba酿酒用葡萄gydF4y2Ba基因型(gydF4y2Ba葡萄属gydF4y2Ba仕达屋优先计划gydF4y2Ba．）gydF4y2Ba代表埃德蒙·马赫基金会(ITA362)保存的两个更广泛的种质收藏的遗传多样性[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba和米兰大学(ITA427)。材料包括用于水果生产的种间杂交(杂交)，包括野生砧木品种gydF4y2Banon-vinifera葡萄gydF4y2Ba种属(砧木/野生)和在育种计划中选择的砧木(砧木育种)。MSTRAT软件，它实现了最大化(M)方法[gydF4y2Ba106gydF4y2Ba，gydF4y2Ba107gydF4y2Ba]，通过每次MSTRAT运行200次迭代和100次重复的核心采样来构建该核心集合。根据Nei’s多样性指数对等位基因丰富度相等的假定核心集合进行排序[gydF4y2Ba108gydF4y2Ba］．最终的核心收集包括在100个重复中出现频率较高的样本。gydF4y2Ba

SNP基因分型、群体遗传多样性和遗传结构gydF4y2Ba

用DNeasy®Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)从砧木基因型的叶片中分离DNA。DNA质量使用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop ND-8000分光光度计(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)进行评估。gydF4y2Ba

按照生产商的说明(Illumina, Inc.， San Diego, CA, USA)，使用商用GrapeReseq 20 K SNPs阵列用Infinium技术对核心藏品进行基因分型。根据Marrano等人对生成的原始SNP数据进行评分和过滤。[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在组内和组间检测SSR和SNP位点的遗传变异性。每个基因座的平均等位基因数(A)，有效等位基因数(AgydF4y2Ba_EgydF4y2Ba, (gydF4y2Ba109gydF4y2Ba])，观察到的水平(HgydF4y2Ba_OgydF4y2Ba)和预期(HgydF4y2Ba_EgydF4y2Ba)杂合度[gydF4y2Ba110gydF4y2Ba]，固结指数(F，近交系数[gydF4y2Ba111gydF4y2Ba])使用GenAlex 6.502计算[gydF4y2Ba112gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

采用structure软件v2.3.2分析关联群体的遗传结构[gydF4y2Ba113gydF4y2Ba]，该方法使用变分贝叶斯框架对亚总体进行近似推断[gydF4y2Ba114gydF4y2Ba］．对K值从1到7进行10次独立试验，设置如下参数(老化长度/迭代次数)，SSR和SNP数据分别为50万/75万和10,000/10万。混合模型在没有先验种群信息的情况下被应用。对最可能的K值进行估计，运行K的多个选择的算法，并可视化边际似然和ΔK [gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]使用STRUCTURE HARVESTER运行十次以上的数据[gydF4y2Ba115gydF4y2Ba］．利用cluplp v1.1.2分析了最优的运行路线[gydF4y2Ba116gydF4y2Ba］．最终结果用软件disstruct v1.1进行可视化[gydF4y2Ba117gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

主成分的判别分析[gydF4y2Ba118gydF4y2Ba]，以使用该包识别遗传簇gydF4y2BaadegenetgydF4y2BaR软件。主成分分析(PCA)中考虑的轴数是通过在p中实现的交叉验证(CV)函数确定的gydF4y2BaopprgydF4y2BaR软件包[gydF4y2Ba119gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

水分胁迫实验条件gydF4y2Ba

在部分控制的气候条件下，在一个5升的花盆中种植每种葡萄基因型的6个重复，基质由砂壤土和泥炭(体积为4:1)组成。土壤含水量(SWC)由湿土和干土的重量差通过重量法确定[gydF4y2Ba120gydF4y2Ba］．建立了两个灌溉处理。3个重复(水分胁迫植株，WS)进行逐渐干旱胁迫:中度稳定亏水(SWC的50%，持续7天)，随后是严重稳定亏水(SWC的30%，持续7天)和恢复期(90%，持续5天)。该实验重复了三年:2012年(1°年)、2013年(2°年)和2014年(3°年)。gydF4y2Ba

选用3个砧木品种(101.14、SO4、RGM) 1年盆栽(9 L)生根插条，在隧道温室中进一步生长和评价。每个基因型砧木12个重复完全暂停灌溉15 d (WS)， 6个重复维持在最大水分利用率(WW)的90%左右。生长介质为沙土与泥炭的混合物(体积1:1)，场地容量为35% [(vol water/vol soil) × 100]。使用ML3 ThetaProbe土壤水分传感器(Delta-T设备，伦敦，英国)监测每个花盆的体积土壤水分含量。花盆表面覆盖一层塑料膜，以避免土壤水分蒸发。实验方案完全随机化。gydF4y2Ba

热指数和气孔导度估算gydF4y2Ba

对干旱的生理反应进行了超过30天的评估。为了评价水分胁迫对葡萄冠层热成像的影响，采用InfReC分析仪(NS9500LT)软件(日本横滨航空电子株式会社)进行了详细阐述。气孔导度由两个不同的热指数估算:作物水分胁迫指数(CSWI) (Eq。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba121gydF4y2Ba]和热指数(Ig)(式。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba122gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

其中TgydF4y2Ba_{树冠gydF4y2Ba}(°C)为每株葡萄6片晒熟叶片的热像图得出的温度gydF4y2Ba_干gydF4y2Ba(°C)和TgydF4y2Ba_湿gydF4y2Ba(°C)为纸板“参考表面”上检测到的温度。气孔导度(ggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba})和蒸腾在试验第三年用稳态孔隙计(Licor Li-1600)测定。gydF4y2Ba

GWAS分析gydF4y2Ba

基因型-表型相关性分别考虑每个性状每年的平均值进行测试。当表型得分非正态分布时，使用对数函数进行转换。使用TASSEL v.5.2测试了三种不同的模型[gydF4y2Ba123gydF4y2Ba］．第一个应用的模型是一般线性模型(GLM)，该模型将用主成分分析(PCA)计算的人口结构作为辅助因子。下面的矩阵符号描述了GLM模型:gydF4y2Ba

在ygydF4y2Ba_我gydF4y2BaI的表型值是多少gydF4y2Ba^thgydF4y2Baμ是模型截距，β是SNP效应的向量，ν是总体效应的向量，ε是剩余效应的向量，Q是来自STRUCTURE的矩阵，它考虑了与亚总体相关的个体概率。采用的第二个模型是混合线性模型(MLM)，它扩展了eq. (gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，同时考虑亲缘矩阵(K)，以估计个体对之间的遗传协方差程度[gydF4y2Ba124gydF4y2Ba］．Endelman和Jannink的方法[gydF4y2Ba125gydF4y2Ba第三个模型(Q + K模型)包括固定效应作为群体结构矩阵(Q)和随机效应作为亲属矩阵(K)。标记性状关联通过绘制分位数-分位数(Q-Q)图进行评估。gydF4y2BaPgydF4y2Ba-values调整用于多次测试:除bonferroni校正临界外gydF4y2BapgydF4y2Ba-值，q值也根据它们对应的p值计算，以确定性状和snp之间的显著关联。q值是衡量错误发现率(FDR)的显著性[gydF4y2Ba126gydF4y2Ba]限制了假阳性结果，同时提供了比Bonferroni校正因子更自由的标准。q值为0.1作为显著关联阈值[gydF4y2Ba127gydF4y2Ba］．GWAS结果与曼哈顿地块进行了可视化gydF4y2BaqqmangydF4y2Ba而且gydF4y2BaCMplotgydF4y2BaR软件软件包[gydF4y2Ba128gydF4y2Ba］．研究了与表型显著相关的标记最接近的基因组区域，以确定候选基因。考虑到连锁不平衡(LD)的程度，在葡萄基因组组装v.2.1上，相关位点的上下行窗口为10 kbgydF4y2Bahttp://genomes.cribi.unipd.it/grapegydF4y2Ba［gydF4y2Ba129gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

VIT_17s0000g08960gydF4y2Ba基因重测序和遗传变异分析gydF4y2Ba

基因特异性引物采用Primer 3软件设计[gydF4y2Ba130gydF4y2Ba的基因组序列gydF4y2Ba诉酿酒用葡萄gydF4y2Ba基因注释v2.1。一组3678 bp的连续层序gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba用表S中所列引物对基因座进行重测序gydF4y2Ba5gydF4y2Ba根据上述方法[gydF4y2Ba131gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

使用DnaSP软件定义多态性的估计和频率[gydF4y2Ba132gydF4y2Ba中检测到的snp和INDELsgydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba编码区。核苷酸的多样性估计为π [gydF4y2Ba133gydF4y2Ba］．中性突变参数θ [gydF4y2Ba134gydF4y2Ba]是从突变总量中估计出来的。中性多态性的假设是用Tajima的D [gydF4y2Ba135gydF4y2Ba傅和李的D [gydF4y2Ba136gydF4y2Ba)测试。使用PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer，蛋白质变异效应分析仪)软件工具预测氨基酸替代在所有位置的耐受性[gydF4y2Ba137gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

实时qPCRgydF4y2Ba

使用Spectrum™植物总RNA试剂盒(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)从葡萄叶片中分离总RNA。在RNA提取过程中使用DNase I (Qiagen, Valencia, CA, USA)进行DNase处理。RNA样品用NanoDrop ND-8000分光光度计(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)定量，琼脂糖凝胶电泳检查其完整性。cDNA用SuperScript®III逆转录酶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)合成。候选基因表达分析使用LightCycler®仪器和相关LightCycler®软件(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)进行。所有Real-Time PCR反应均按照制造商说明，使用表S中所列引物，用LightCycler®480 SYBR Green I Master Mix (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)在20 μl反应中进行gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．对每个时间点进行三个独立的生物学重复分析。基因表达水平用qbasePLUS软件评估(Biogazelle, Zwijnaarde，比利时[gydF4y2Ba138gydF4y2Ba])，由内参基因肌动蛋白(Actin)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)归一化。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

使用R包“stats”，“agricolae”和“companion”v3.5.1 (R Core Team, 2013)进行统计分析。采用不同的测试进行平均比较。采用参数学生t检验或单因素方差分析比较方差相等的正态分布数据。当不符合正态性或方差齐性假设时，采用非参数Mann-Whitney U检验和单向Kruskal-Wallis检验。gydF4y2Ba

在本研究过程中产生的所有数据均包含在文章中及其补充信息文件中，或根据合理要求可从通讯作者处获得。核苷酸序列gydF4y2BaVIT_17s0000g08960gydF4y2Ba可在GenBank数据库中根据登录号找到:Mw066760, mw066761, mw066762, mw066763, mw066765, mw066766, mw066767, mw066769, mw066770, mw066771, mw066772, mw066774, mw066776, mw066777, mw066778, mw066779, mw066778, mw066781, mw066782, mw066782, mw066783, mw066784, mw066785, mw066787, mw066788, mw066789, mw066790, mw066791, mw066792, mw066793, mw066795, mw066797, mw066798, mw066799, mw066800, mw066801, mw066802, mw066807, mw066808, mw066809, mw066805, mw066806, mw066807, mw066808, mw066809, mw066806, mw066806, mw066808, mw066808, mw066809，Mw066810、mw066811、mw066812、mw066813、mw066814、mw066815、mw066816、mw066817、mw066818、mw066819、mw066820、mw066821、mw066822、mw066824、mw066825、mw066826、mw066827、mw066829、mw066830、mw066831、mw066832、mw066833、mw066834、mw066835、mw066836、mw066837、mw066838、mw066840、mw066841、mw066842、mw066843、mw066844。gydF4y2Ba

GWAS:gydF4y2Ba

全基因组关联研究gydF4y2Ba

WUE:gydF4y2Ba

中水回用效率gydF4y2Ba

近红外光谱:gydF4y2Ba

近红外gydF4y2Ba

加:gydF4y2Ba

小等位基因频率gydF4y2Ba

苏维埃社会主义共和国:gydF4y2Ba

简单序列重复gydF4y2Ba

SNP:gydF4y2Ba

单核苷酸多态性gydF4y2Ba

CSWI:gydF4y2Ba

作物水分胁迫指数gydF4y2Ba

WS:gydF4y2Ba

水的压力gydF4y2Ba

罗斯福:gydF4y2Ba

错误发现率gydF4y2Ba

LD:gydF4y2Ba

连锁不平衡gydF4y2Ba

110 r:gydF4y2Ba

110级gydF4y2Ba

SO4:gydF4y2Ba

奥本海姆选集gydF4y2Ba

RGM:gydF4y2Ba

蒙彼利埃光荣河岸gydF4y2Ba

101.14:gydF4y2Ba

101.14 Millardet et de GrassetgydF4y2Ba

WW:gydF4y2Ba

有实力的gydF4y2Ba

NPQ:gydF4y2Ba

Non-photochemical淬火gydF4y2Ba

QTL:gydF4y2Ba

数量性状位点gydF4y2Ba

舰队指挥官:gydF4y2Ba

田间持水量gydF4y2Ba

RFO:gydF4y2Ba

棉子糖家族低聚糖gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

ABRE:gydF4y2Ba

ABA-responsive元素gydF4y2Ba

含有DREB:gydF4y2Ba

脱水响应元件结合gydF4y2Ba

MVD:gydF4y2Ba

甲羟戊酸二磷酸脱羧酶gydF4y2Ba

DAPC:gydF4y2Ba

主成分判别分析gydF4y2Ba

SWC:gydF4y2Ba

土壤含水量gydF4y2Ba

全球语言监测机构:gydF4y2Ba

一般线性模型gydF4y2Ba

传销:gydF4y2Ba

混合线性模型gydF4y2Ba

作者感谢Giovanni Battista Tornielli教授和Anita Zamboni教授(维罗纳大学)的有益讨论和建议，Paula Moreno-Sanz博士对手稿的批判性阅读和语言修订，以及Attilio Scienza教授(米兰大学)的支持。gydF4y2Ba

F.E.和MT感谢AGER SERRES (Project N. 2010-2105)和WINEGRAFT的资助。gydF4y2Ba

这项工作是由CAVIT s.c.(特伦托)和埃德蒙·马赫基金会(圣米歇尔阿迪杰，特伦托)共同资助的。资助机构在研究设计、数据收集、分析和解释以及撰写手稿方面没有任何作用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 研究和创新中心，埃德蒙·马赫基金会，经由E.马赫1,38010，圣米歇尔阿迪杰，意大利gydF4y2Ba

   Massimiliano Trenti, Silvia Lorenzi, Maria Stella Grando和Francesco EmanuelligydF4y2Ba

2. 技术转移中心，埃德蒙·马赫基金会，经E.马赫1,38010，圣米歇尔阿迪杰，意大利gydF4y2Ba

   路易吉·比安切迪gydF4y2Ba

3. 米兰大学农业与环境科学系，via Celoria 2, 20133，意大利米兰gydF4y2Ba

   丹尼尔·格罗西，奥斯瓦尔多·法伊拉和弗朗西斯科·伊曼纽尔利gydF4y2Ba

4. 特伦托大学农业食品环境中心(C3A)， via E. Mach 1,38010，圣米凯莱奥阿迪杰，意大利gydF4y2Ba

   玛丽亚·斯特拉·格兰朵gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

FE和MSG构思并设计了研究工作;MSG获得资金支持并监督研究活动;MT、FE、SL、PLB、DG、OF参与实验工作;MT和FE进行统计分析并参与数据解释;MT写了手稿。所有作者审阅、编辑并批准了最终版本的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaTrenti竞争gydF4y2Ba或gydF4y2Ba玛丽亚·斯特拉·格兰朵gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba