大豆转基因基因GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4涉及阻力响应GydF4y2Ba爪哇根结线虫GydF4y2Ba在里面GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

小分子热激蛋白（sHSPs）是一类响应植物生物和非生物胁迫的分子伴侣。先前的一项研究表明，Gm基因有很强的诱导作用GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4对线虫的反应GydF4y2Ba爪哇根结线虫GydF4y2Ba在耐药大豆基因型中，而易受影响的大豆基因型。本研究旨在调查这种小伴侣的功能涉及GydF4y2Bam是GydF4y2Ba在里面GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba. 首先，研究了接种线虫后启动子区的激活情况，以及抗性大豆和感病大豆重测序材料间多态性的发生情况。然后使用GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba过度表达大豆转基因的株系GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4基因的突变株和被敲除的突变体受到GydF4y2Bam是GydF4y2Ba侵犯。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白基因标记在转化大肠杆菌中的高表达GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba植物揭示了通用汽车的启动子区GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba在线虫接种后强烈激活22.4。此外，在过表达通用植物的植物中显着降低了线虫的倍增GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4基因GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba与野生型相比。此外，乘法GydF4y2Bam是GydF4y2Ba在GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba突变体主要在活动中显着增加GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-2。这一增长并不是在活动中显而易见的GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0–1，保留了一部分启动子区域，包括周围区域的HSE− 83 英国石油公司。然而，在序列水平上对大豆抗感基因型进行结构分析，没有发现整个基因模型中存在任何多态性。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

大豆伴侣转基因GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4参与对根结线虫的防御反应GydF4y2Bam是GydF4y2Ba在里面GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba. 具体来说，启动子区域覆盖− 拟南芥线虫感染后，启动子激活需要来自转录起始位点（TSS）的191。在Gm中没有检测到可以解释这些防御反应差异的多态性GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4大豆抗感基因型间的基因差异。因此，无论是在大豆基因型对根结线虫反应的序列水平上，还是通过检测对Gm激活至关重要的顺式元件，都需要进一步的研究来阐明植物防御机制的触发因素GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4基因启动子。GydF4y2Ba

多年来通过遗传增益的大豆生产率的增加是不可否认的。然而，害虫和病原体的管理仍然通过对环境的影响或其生产成本的负担来构成大豆产量的主要挑战[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]. 在这些害虫中，在巴西和全世界所有主要大豆种植区都发现了植物线虫。据估计，巴西大豆作物因植物寄生线虫造成的生产损失约为162亿巴西雷亚尔/年[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

已经开发了几种策略来控制植物疗法，例如作物旋转，杀线虫和生物治疗的使用[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]. 此外，还尝试了涉及基因过度表达和沉默的转基因方法[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．最后，遗传性抗性已用于探索遗传遗传学计划的遗传育种计划GydF4y2Ba基因座GydF4y2Ba在大豆中，如植物引种（PIs）中描述的数量性状位点（QTL）[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．但是，有一些抗性来源可用，限制了广泛耐用性的发展[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．因此，了解抵抗响应所涉及的分子机制是制定用于控制这些害虫的生物技术策略的重要方法[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

伴侣蛋白蛋白质存在于原核生物和真核生物中，并且在植物王国的几种物种中广泛分布。在植物中，生物和非生物胁迫会引发不同的防御机制，例如激活一组高度保守的蛋白质，称为热休克蛋白（HSP）[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］．热休克蛋白的主要功能是作为分子伴侣，维护其他受温度等因素影响的蛋白质的空间结构[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]. 这些蛋白质最初是在小鼠的唾液腺中观察到的GydF4y2Ba果蝇GydF4y2Ba热休克胁迫下的spp[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]. 根据序列大小和同源性，HSPs可分为5类：HSP60、HSP70、HSP90、HSP100和HSP20（小HSP或sHSP）。HSP20蛋白在不同的蛋白质中表现出一个N端疏水区，其序列和长度完全不同，随后在蛋白质的C端部分有一个约90-100个氨基酸残基的保守结构域和一个短的C端延伸[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

尽管它们的名字，HSP20蛋白不仅在热休克后被诱导，而且还被其他非生物刺激物诱导，如缺水、重金属、臭氧和紫外线辐射[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]以及在不同的生物应力下，如线虫侵扰[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．对细胞溶质HSP20蛋白的功能的研究表明，HSP20通过将其解离二聚体与变性蛋白质的连接[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20GydF4y2Ba]. 根据这一假设，热诱导的热休克蛋白20的解离可能导致疏水区的暴露，从而导致变性蛋白质的稳定[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]. 然后，HSP20与其他依赖ATP的分子伴侣如HSP70、HSP90、HSP100和GroEL合作进行蛋白质复性[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]. 此外，与其他分子伴侣相比，HSP20表现出更高的结合化学计量比，这导致了一些推测，HSP20作为一个水库，在应激反应中稳定变性蛋白质的流动[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在先前的研究中，Lopes Caitar等人[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]以HSP20家族的51个成员的表达方式为特征GydF4y2Ba最大甘氨酸GydF4y2Ba（总经理）GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba20）在非生物（热和冷）和生物胁迫下（侵染GydF4y2Bam是GydF4y2Ba)感病（brs133）和抗性（PI595099）大豆基因型的研究。在生物胁迫条件下，这些基因的表达水平强烈依赖于基因型。此外，暴露时间（接种后4天或8天）对两种基因型的基因表达都有显著影响。全球机制51个成员中有5个GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba20个家系在两种处理下均显著表达，但Gm的表达GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4（ABBREV。对于Glyma10G176400）基因站出来。与假的接种样品相比，其相对表达水平在感染的抗性基因型中为60倍，而在线虫存在下，在易感基因型中观察到抑制抑制。有趣的是，该作者报告了与大豆反应相关的这些大豆家族基因的启动子区域中的标准组织的系统发生了系统的系统性发生。GydF4y2Bam是GydF4y2Ba侵犯。GydF4y2Ba

在这项研究中，我们试图阐明转基因的参与GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4回应GydF4y2Bam是GydF4y2Ba侵扰。我们首先评估了根结线虫存在下启动子的活性。然后，进行了电子和功能分析，以表征分子伴侣Gm的功能GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4关于回应GydF4y2Bam是GydF4y2Ba的侵扰。我们的研究结果为该基因在线虫防御反应中的作用提供了重要的数据。GydF4y2Ba

通用汽车GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4促进剂被强烈诱导GydF4y2Bam是GydF4y2Ba在拟南芥根中GydF4y2Ba

研究Gm的反应性GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4发起人GydF4y2Bam是GydF4y2Ba侵染，潜在的转基因GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4启动子序列（来自转录开始点的2kb）与GFP的编码区融合并引入GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba幼苗，导致四个事件（PGMGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4-3,4,6和12）GydF4y2Ba．GydF4y2Ba在接种后第9天（dai）测定这些植物根系的荧光水平GydF4y2Bam是GydF4y2Ba在未接种的植物中(模拟)。与预期的一样，GFP的平均活性在所有测试事件中显著升高(PGmGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4–3、4、6和12）比模拟事件（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）。GydF4y2Ba

通用汽车的结构和多态性分析GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4英寸GydF4y2Bam是GydF4y2Ba抗性和易感基因型GydF4y2Ba

GM.GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4基因预测全长1158 血压337 5’UTR区域的血压，588 编码区bp和233 3’UTR区bp；在没有内含子的情况下，这个序列产生了一个潜在的编码蛋白196个氨基酸。植物的同源基因GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba展出了类似的组织，与通用汽车展示了74.6％GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4，也没有内含子区域，可能编码196个氨基酸的蛋白质。GydF4y2Ba

基于Santos等人获得的重测序数据[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]在21份大豆种质中，一个潜在的启动子区跨度为2.0 比较了6个大豆抗病基因型的TSS和全转录区（包括外显子和UTRs）的kbGydF4y2Bam是GydF4y2Ba和15个易感者[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]. 总经理GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba21个基因型中有22.4个基因高度保守，序列无变异。同样，启动子区域除了转录起始位点上游−1229位(a /T)发生了替换外，没有出现序列变异，但由于该替换是随机分布在基因型之间，不可能与抗性联系在一起。GydF4y2Ba

Gm过表达GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4增加对拟南芥的根结线虫抗性增加GydF4y2Ba

根癌农杆菌GydF4y2Ba携带GMGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4:：pH7WG2D结构用于转换GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba. 过表达Gm编码区的三个稳定事件GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4在35S启动子控制下，通过花浸转化获得启动子。阳性事件的选择和确认的检测eGFP荧光GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba根。在T4代的三种纯合事件的根中观察到强大的绿色荧光，展示了转化的转变成功GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4，而在野生型（WT）中，未检测到荧光（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）。GydF4y2Ba

将转基因植株的根形态特征（长度和重量）与野生型植株进行比较，以检测转基因植株过度表达可能引起的变化GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4. 转基因株系的平均根长和根重为8.0 厘米和60 mg，与野生型Scheffés检验无显著差异(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba ≤ 0.05). 附加文件中描述了这些数据和其他形态比较GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

通用汽车的表达水平GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba用RT-qPCR对14株转基因植株中的22.4个基因进行定量分析。正如预期的那样，检测到高水平的基因表达GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba用35S启动子调控的目的基因转化的植株(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。在通用汽车中观察到最高表达GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4-8-OE线，其次是GMGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4-6-OE和GMGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba分别为22.4–4-OE事件。GydF4y2Ba

转基因的影响GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4过度表达GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba转基因植物反对GydF4y2Bam是GydF4y2Ba通过计数细菌数量来检查感染情况GydF4y2Bam是GydF4y2Ba22日龄时植物根系上的雌性与野生型植物的比较（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab).在测试的三个纯合事件中，观察到转基因的雌性数量显著减少GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4–6-OE（82%）和GmGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba与WT（OE）相比，22.4-8-OE（42％）事件。通用汽车GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4–4-OE事件并未导致GydF4y2Bam是GydF4y2Ba雌性（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

淘汰总经理GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4拟南芥中的直系同源物损害了对植物的防御反应GydF4y2Bam是GydF4y2Ba

确认大豆通用州的参与GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4在对线虫侵扰的反应中，两个敲门声GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba对害虫侵蚀进行测试的突变体。这GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-1和GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0–2个突变体在启动子中插入T-DNA− TSS上游或5′UTR处191 pb+ TSS下游分别为149 pb。突变株的纯合系通过PCR（附加文件）进行选择GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）。GydF4y2Ba

通过根长（cm）、根质量（mg）、叶片数和鲜地上部质量（mg）的比较，验证了突变对植物生长发育的影响GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-1和GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0–2与WT（附加文件）中的相应属性进行比较GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba). 转基因植株和野生植株的这些形态参数的平均值之间没有显著差异。转基因植株的平均根长为11.4 厘米，而11.2 转基因植株的根质量为835.3(GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-1)及938.2 (GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0–2）毫克，而重量为976.4毫克 毫克。同样，在转基因植株和野生型植株中，叶片数和地上部重量没有显著差异。因此，所评估的形态参数并未表明转基因和野生型的发育有任何显著差异GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba植物。GydF4y2Ba

最后，研究了突变对线虫感染和繁殖能力的影响GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba通过在两种转基因事件的植物中获得的鸡蛋，幼稚（J2）和女性的数量和WT接种的植物评估植物GydF4y2Bam是GydF4y2Ba．与WT相比，与45 dae的两种事件相关的雌性的数量表现出大约150％的倍增增加（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种）。另一方面，少年/鸡蛋的数量仅在于GydF4y2BaA.拟南芥GydF4y2Ba22.0–2突变体（2631.15），与对照组（964.68）相比，为突变体中幼鱼/卵的数量GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0–1（1636.29）（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

基于这些结果，GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-1和GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0–2GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba突变体表现出易感性增加GydF4y2BaM. Javanica，GydF4y2Ba成为后者的那个呈现出大量女性和鸡蛋和青少年的人比野生型植物Scheffé的测试（GydF4y2BaP.GydF4y2Ba ≤ 0.05).

拟南芥At4g10250基因启动子区顺式元件分析GydF4y2Ba

基于AT4G10250的启动子区域的分析，我们在+ 79， - 146， - 165和-456bp的+ 114bp和tata盒的位置鉴定了富含Ta的序列。在位于位置+ 182，+ 173，+ 71，+ 5，-2， - 121， - 126， - 165， - 181， - 310和-355bp的位置+ 182，+ 173，+ 71,21,310和-355bp的序列中发现了Caat盒元素。通过热冲击因子（HSF）转录因子（HSF）转录因子（HSE）识别和激活热休克元件（HSE）[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba[在六种不同的位置，+ 166，+ 48， - 97， - 408， - 462和-467bp，观察到TSS的六种不同位置。与其他元素相比，W盒位于-303bp位置处的负股线（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）。GydF4y2Ba

T-DNA插入线位于事件启动子区CAAT盒和W盒顺式元件之间GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0–1，在cis元素HSE和富含5′UTR的TA之间GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0–2（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）。GydF4y2Ba

作为伴侣蛋白，sHSP蛋白被描述为由不同的生物和非生物胁迫诱导，包括线虫感染[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba］．在这项研究中，我们特别研究了Gm的作用GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4基因GydF4y2Bam是GydF4y2Ba细节中的抵抗响应。选择该基因是因为先前的研究报告其在大豆中强烈表达GydF4y2Bam是GydF4y2Ba-在生物和非生物胁迫下，抗性基因型pi595099和敏感基因型brs133受到抑制[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］．大豆的积累被认为是一种重要的来源，对特定的菌株和小种线虫的抗性，包括GydF4y2BaM. Javanica，GydF4y2Ba并在大豆13号染色体上定位了一个与抗性相关的QTL（soyhsp176）[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

我们的结果表明了通用汽车GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4启动子活动GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba植物在线虫侵扰后高度活化，确认转录激活响应GydF4y2Bam是GydF4y2Ba以前报告的[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]. 总经理GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4启动子介绍了一个结构组织，其中CAAT盒位于HSE元素的上游，一个位于HSE上游的W字母[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］．这种保守的启动子结构被发现GydF4y2Ba热休克蛋白20GydF4y2Ba响应于线虫侵扰的家庭成员，其中HSE可能被热休克转录因子识别[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]. 正如预期的那样，GFP荧光标记显示，感染拟南芥转基因植株的启动子诱导平均比未感染拟南芥转基因植株高34.47%（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）。GydF4y2Ba

虽然我们展示了通用汽车启动子的活动GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4英寸GydF4y2Bam是GydF4y2Ba然而，我们无法证明这种不同水平的转基因GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4在基因序列水平上解释了抗性和感病大豆材料的转录本和相关的对比表型。我们对21份重新测序的大豆材料进行了分析，未检测到转基因基因启动子、5'UTR、3'UTR或外显子的任何变异GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4与表型相关的基因。抗病材料和感病材料的全基因和启动子区完全相同。GydF4y2Ba

基因表达的差异调控GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4抗感基因型与Fuganti等人的结果一致[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]. 这些作者在两个微卫星标记satt144和Soy之间定位了一个来源于抗源PI595099的群体中与根结线虫抗性相关的QTLGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba176.大豆GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba176标记位于包含另一个SHSP，GM的区域GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba17.6-L基因。另外，发现该基因的表达水平被差异地调节在来自映射人群的抗性和易感个体之间，仅在抗性个体中诱导。Gene GM的启动子区的多态性分析GydF4y2BaHSP.GydF4y2BaFuganti等人的17.6-L [GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]与易感基因型相比，抗性基因型中检测到更多的AT（n）重复，而Gm基因中的AT（n）重复数是恒定的GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4在这项工作中分析的基因型。因此，我们的分析并未表明（n）重复和基因转基因的启动子活动之间的任何相关性GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4.GydF4y2Ba

Gm基因差异表达的一种可能解释GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4大豆基因型对大豆的表型对比反应GydF4y2Bam是GydF4y2Ba在我们的研究中，感染可能是由于增强子区域的存在，这些增强子区域与其他基因的启动子区域相互作用，无论是在它们的附近还是远距离，改变了它们的调控[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］．但是，我们的数据不足以确认这一假设。GydF4y2Ba

另一种解释是表观遗传调控，在序列水平上无法检测到。据报道，这一机制与大豆对胞囊线虫的抗性有关[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]. 在另一项研究中[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]在大豆囊肿线虫（SCN）侵扰后在大豆植物中观察到差异水平甲基化，这可能影响转录因子对CIS-ELECINGS调节对线虫的转录活性的转录因子[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba］．尽管这种情况可能是对通用汽车监管的另一种解释GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4，进一步研究是确认这一假设的必要条件。GydF4y2Ba

拟南芥有19个基因编码GydF4y2Ba热休克蛋白20GydF4y2BaS.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba基于其亚细胞定位和同源性分成12个亚属GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]，是的成绩单GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba与Gm同源的基因模型GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4，至少GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.0，在正常条件下(22°C)检测不到，在热应激时(38°C)累积到高水平[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．迄今为止，没有可用的证据激活GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.0在生物胁迫条件下，如线虫侵扰。GydF4y2Ba

为了更好地理解该伴侣在对根结线虫的阻力响应中的作用，我们过表达了大豆基因GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba植物并研究了两条DNA插入线，其中敲除局部基因。在我们的研究中，两个事件呈现了GM的组成型过度表达GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4基因GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba导致雌性的数量显着降低了82和42％（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab）。类似地，当在拟南芥植物中敲除直晶基因时，我们观察到雌性数量增加了150％（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa） 是的。根据这些结果，我们推测GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4参与线虫侵染反应，可能通过捕获未折叠的蛋白质和减少蛋白质聚集体大小作为细胞防御的第一道防线。因此，随着更多结合位点的产生，以及ATP依赖性HSP70和HSP100的协助，聚集被逆转并且促进了复性[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba］．GM的高转录水平GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4在转化植物中过表达可能在内质网中提高了植物蛋白的稳定性，无论是有利于防御反应，还是通过在害虫侵扰期间维持植物中的活性伴侣供应。GydF4y2Ba

考虑到与T-DNA插入启动子区位置相关的突变株的易感性水平，我们观察到在该事件中影响较小GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-1，其中卵和幼稚的数量与野生植物不同（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab） 是的。在这个突变体中，大部分启动子不受T-DNA插入的影响(− 191来自TSS），其中保持了线虫反应启动子的组织结构，包括周围的HSE元素− 来自TSS的83 pb（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）。另一方面，T-DNA插入GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-2在5'UTR（+ 149个位置）中完全消除了阻力，确认了这种HSE元素区域靠近GM中的TSS的重要性GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4线虫侵染后的直字。GydF4y2Ba

角色GydF4y2BaHSP.GydF4y2BaEscobar等人在水稻中描述了与其线虫反应启动子活性相关的20个基因[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]，他描述了大豆的参与GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba17.4基因在植物感染反应中的作用GydF4y2BaM隐姓埋名GydF4y2Ba. 作者还观察到Hs的启动子GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba17.4水稻sHSP能诱导β-葡萄糖醛酸酶（GUS）标记基因的表达，17～20天后，50%～70%的根瘿被染色 感染后几天GydF4y2BaM隐姓埋名GydF4y2Ba．此外，他们观察到，在TSS上游的83bp区域中的突变是线虫反应中启动子激活的决定因素[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]，证实了我们的结果。GydF4y2Ba

同样，Barcala等人。[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]描述了在不同情况下对调节的组合和/或特定序列的重要性。HA启动子区的功能分析GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba17.6G1和HaGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba向日葵中的另外两个sHSP（18.6G2）也与启动子组织对线虫感染的反应能力有关。只有哈GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba18.6G2在巨细胞中被诱导，在启动子中有两个hse，一个在近端，另一个在远端。相比之下，医管局只观察到一例HSEGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba17.6G1启动子，在远处区域。我们还发现CAAT盒元件GydF4y2BaHAHSP18GydF4y2Ba.6G2立即位于HSE上游和HSE之间，只有HSE的下游GydF4y2Bahahsp17.GydF4y2Ba.6G1启动子。GydF4y2Ba

有趣的是，响应于Nematode侵扰的大豆基因启动子的组织，与AT4G10250启动子的顺式侵袭相似，如leopes-caitar等人所述的那样。[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］．大豆HSP20基因的启动子负责GydF4y2Bam是GydF4y2Ba在结构中含有HSE元素的区域，侵染呈现出两个CAAT元素，而W盒位于较远的位置[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］．另一方面，在AT4G10250中的TSS中，不可能观察到-83bp区域内的HSE元件的发生，但它与TSS相处地位于-97bp位置。因此，类似的结构组织GydF4y2BaHps22型。GydF4y2Ba4在大豆和拟南芥之间也可以反映功能保护。GydF4y2Ba

虽然是通用汽车GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4基因经初步鉴定为高诱导表达GydF4y2Bam是GydF4y2Ba线虫抗性大豆基因型并在易感中抑制，在启动子或这些基因型的编码区域中观察到多态性的差异。通用汽车GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4基因影响阻力响应GydF4y2Bam是GydF4y2Ba，由于其过度表达降低了线虫的感染潜力，高达82％，拟南芥原子敲除线增加了150％的敏感性。通用汽车的启动子GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4基因被诱导表达，以响应病毒的侵染GydF4y2Bam是GydF4y2Ba9代时，感病和抗病植物启动子间无差异。At的启动子区域GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.0包含至少191个 在TSS附近有HSE存在的情况下，bp是触发GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba至GydF4y2Bam是GydF4y2Ba线虫。GydF4y2Ba

线虫培养与植物材料GydF4y2Ba

的人口GydF4y2Bam是GydF4y2Ba在巴西巴拉那州Londrina的Embrapa Soja线虫部门的温室中，在大豆植株中繁殖，并按照J Bonetti和J Ferraz的技术进行加工[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba］．在孵化室中，每天收集可行的第二阶段J2，在Erlenmeyer烧瓶中每天收集3天，并使用彼得腔室进行量化。GydF4y2Ba

本研究所使用的大豆种子登录号pi595099是由巴西巴拉那州隆德里纳的Embrapa大豆胚芽库提供的。GydF4y2Ba

种子GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba生态型哥伦比亚（Col-0）和种子GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba一个基因敲除突变体的两个独立系GydF4y2Ba雅典GydF4y2Ba22.0来自拟南芥生物资源中心（ABRC）（WiscDsLox489\ U 492E13），库存号为N858258GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-1和GK-265F12-014990用库存号N335081为GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-2）。没有专业人士进行正式识别我们研究中使用的植物材料。GydF4y2Ba

GM的多态性分析GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4基因GydF4y2Ba

从Santos等人获得了21个大豆基因型的重测序数据[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]. 根据大豆基因组上传了41003835-41006424核苷酸序列的fasta文件(GydF4y2Bahttps://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmlGydF4y2Ba＃GydF4y2Ba，版本wm82.a1.v1）。GydF4y2Ba

材料的表型反应GydF4y2Bam是GydF4y2Ba在Gramapa Soja-Nematology实验室获得侵染[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]，BRS valios rr，BRSGO 8360，CD 201，MG / BR46 Conquista，PI 595099和Paraná，被归类为耐柔性品种和Anta 82，Brs 232，BRS 360RS，BRS 361，BRSSambaíba，BrsgoChadões，Brsmt Pintado，Brsmt Uirapuru，Ft Abyara，Ft Cristalina，IAS 5，NA 5909 RG，P98Y11和Williams82易感。GydF4y2Ba

用整合基因组学观察（IGV）评价所有21种基因型的核苷酸序列[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

克隆通用汽车GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4大豆基因GydF4y2Ba

死者的DNAGydF4y2Bam是GydF4y2Ba根据多伊尔和多伊尔所描述的技术提取抗线虫大豆基因型PI595099 [GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]并用于用引物CDSGM扩增编码区GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4-F和CDSGMGydF4y2BaHGydF4y2Basp22.4-R，启动子区域用引物PGm扩增GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4-F和PGMGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4-R（附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba). 使用Wizard®SV凝胶和PCR净化系统（Promega）纯化PCR片段。GydF4y2Ba

用PCR™8 / GW /Topo®TaCloning®套件（2012）引入片段，然后用于转化电容菌株的细胞GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaDH5α通过电穿孔。通过在终浓度为100μg.ml-1和酶分析中使用抗生素潮霉素进行转化的克隆的选择，而重组剂和含有预期取向中的片段的克隆则通过限制反应确定。来自含有促进剂的克隆的质粒DNA和GM的促进区GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4在预期方向上与载体pHGWFS7：：P进行重组反应[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]进行启动子分析(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa） 以及用于编码区域分析的向量pH7WG2D：：CDS（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba（二）[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

A.肿瘤学家GydF4y2BaGV3101与工厂改造GydF4y2Ba

使用含有正确克隆的目的片段的质粒pHGWFS7和pH7WG2D进行转化GydF4y2BaA.肿瘤学家GydF4y2BaGV3101菌株在2,2 kV, 25 μF下电穿孔，在200或400手腕控制器Ω。含有庆大霉素和潮霉素的yes培养基在28°C孵育过夜。为了确认阳性的细菌克隆，使用引物PGm进行PCRGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4-F和PGMGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4-R对于启动子和引物设置PH7WG2D-F和PH7WG2D-R的编码区（附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）。重组细菌用于改变GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba哥伦比亚（Col-0）生态型，使用花卉DIP方法[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]. 在含有1/2x MS培养基（Sigma Chemicals n°m-5519）、0.8%琼脂（Sigma Chemicals n°A-1296）和15%琼脂的培养基中进行T0和随后T2、T3和T4代转化种子的选择 μg/ml-1潮霉素。转化子在没有生长迟缓的情况下被鉴定为潮霉素抗性苗。通过PCR（附加文件）确认阳性事件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）然后繁殖，直到在后续实验中使用的T4谱系。GydF4y2Ba

转基因植物的分子分析GydF4y2Ba

这GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba用通用汽车转化的植物GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4并在15μgml下选择抗生素潮霉素GydF4y2Ba^{- 1GydF4y2Ba}通过从根部提取的基因组DNA通过PCR确认（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）。底漆对PGMGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4-F和PGMGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4-R（启动子区）或pH7WG2D-F和pH7WG2D-R（编码区）按说明书进行PCRGydF4y2Ba塔克GydF4y2BaDNA聚合酶Invitrogen试剂盒。从未转化植物中提取的DNA作为阴性样本。启动子区PCR条件为95°C for 4min, 95°C for 30 s, 56°C for 30 s, 72°C for 45 s, 35个循环，另外一个步骤72°C for 5min。GydF4y2Ba

如果是GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba与通用汽车公司一起转型GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4编码区，PCR条件为95 4°C 最小，然后是35 95周 30°C s、 62个 30°C s和72 45°C s、 在72处增加一步 °C持续5分钟 两种扩增产物均用常规电泳法在半透明显微镜下观察，并用光聚焦仪（Loccus）采集和存储图像。GydF4y2Ba

检测GFP活性GydF4y2Bam是GydF4y2Ba侵犯GydF4y2Ba

这GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba转基因株系GydF4y2BaHGydF4y2Basp22.4–3页GydF4y2BaHGydF4y2BaSP22.4-4，PGMGydF4y2BaHGydF4y2Basp22.4–6和PGmGydF4y2BaHGydF4y2Basp22.4–12，庇护PGmGydF4y2BaHGydF4y2Basp22.4:GFP法测定Gm启动子活性GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4基于绿色荧光强度。在感染了400 J2的植物的根部进行了评估GydF4y2Bam是GydF4y2Ba9岁以后的个人 接种天数或26岁未受感染天数 摄氏度[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］．该实验是在具有三种植物和四个独立转化事件的完全随机设计（CRD）中进行的。表达EGFP的根的图像被捕获，其中5.0万像素相机连接到蔡司AXIO范围A1复合显微镜（Zeiss Corporation），并用动机软件（2.0版）加工。通过使用Adobe®Photoshop®CS613.0×32程序进行荧光水平的定量分析。使用SAS /Stat®软件，版本9.4进行统计分析。版权所有©2016 SAS Institute Inc.使用Scheffé的测试，在5％的意义水平中，在方差分析模型中测试了治疗方法与控制手段之间的对比。GydF4y2Ba

生物测定GydF4y2Bam是GydF4y2Ba

在功能分析方面，对14种未转化植物和转基因植物进行了比较GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4选择过表达GFP标记的编码区，在CRD中进行线虫生物测定。人口GydF4y2Bam是GydF4y2Ba被乘以，根源挑战400 m是GydF4y2BaJ2/工厂。接种物通过靠近植物根部的一个小的开口被移液。GydF4y2Ba

在26°C接种22天后[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]，收集根部并单独称重。评估女性的数量GydF4y2Bam是GydF4y2Ba通过计算与酸紫红色染色的线虫进行的[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]. 比较了转基因植株和野生型植株的各项指标GydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4基因。使用SAS /Stat®软件，版本9.4进行统计分析。版权所有©2016 SAS Institute Inc.使用Scheffé的测试，在5％的意义水平中，在方差分析模型中测试了治疗方法与控制手段之间的对比。GydF4y2Ba

量化GMGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4成绩单水平GydF4y2Ba

使用制造商（Invitrogen）推荐的Trizol试剂（1mL / 100mg组织）提取总RNA。萃取后，根据制造商的建议，用脱氧摩尔核酸酶I（Kit Invitrogen-DNase I）处理RNA样品，以消除样品中存在的任何DNA分子。使用制造商推荐的上标III试剂盒（Invitrogen）在cDNA合成步骤中使用处理的RNA。使用Sybr®GreenPCR主混合套件（Applied Biosystems）根据制造商的说明，在StealOnplus™系统热循环仪（Thermo Fisher Scientific）中进行RT-QPCR。对于归一化，采用AT_ACT（Actin At3G18780）基因，其用底漆AT_act-F和AT_ACT-R扩增，而引物置于RT-GMGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4-F和RT GmGydF4y2BaHSP.GydF4y2Ba22.4-R用于靶基因（附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）。通过静止程序计算的靶基因的相对定量使用野生型控制设备作为每个相应的处理的校准器。用来自每个转基因的至少14根重复评估样品，在PCR中使用三种技术复制。GydF4y2Ba

T-DNA插入突变体的检测GydF4y2Ba

来自单个敲除突变体的两个独立线GydF4y2Ba雅典GydF4y2Ba22.0来自拟南芥生物资源中心（ABRC）（WiscDsLox489\ U 492E13），库存号为N858258GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-1和GK-265F12-014990用库存号N335081为GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-2）。代码GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-1和GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba整个手稿采用22.0-2。序列分析显示GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba在191bp上游插入22.0-1相对于转录物起始位点，而在其中GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-2突变体下游为149 bp（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba). 关于T-DNA插入的大小GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0–1是8954 长度为bp，长度为GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-2为6498 bp。GydF4y2Ba

用引物对LP/RP和BP1/RP进行纯合度验证GydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-1和LP / RP和BP2 / RP forGydF4y2Baathsp公司GydF4y2Ba22.0-2（附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）。其中一个扩增反应涉及使用LP（左边界）和RP（右边界）引物，其围绕插入件的区域围绕区域，因此只能验证对照植物中的扩增，同时未观察到扩增由于插入件的尺寸，突变植物。另一方面，在使用引物RP（右侧边界）的反应中以及引物BP1和BP2，其分别在启动子和外显子中退火，导致仅在突变植物中扩增，如对照植物未呈现插入。GydF4y2Ba

45天后，用紫红色染色的雌性和鸡蛋/幼年物的总数[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]根据Coolen和D'Herde进行评估[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．在CRD下的对照植物和突变体之间比较了两种评估的参数。使用SAS /Stat®软件，版本9.4进行统计分析。版权所有©2016 SAS Institute Inc.使用Scheffé的测试测试突变体和控制手段之间的对比度，以5％的意义。GydF4y2Ba

At4g10250启动子的顺式元件鉴定GydF4y2Ba

推测的500个顺式元素 使用生物信息学工具PlantCARE对At4g10250基因转录起始位点上游的bp区域进行了表征[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]和Athamap [GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]数据库。GydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。GydF4y2Ba

ABRC公司：GydF4y2Ba

拟南芥生物资源中心GydF4y2Ba

业务伙伴：GydF4y2Ba

基对GydF4y2Ba

CaMV公司：GydF4y2Ba

花椰菜马赛克病毒GydF4y2Ba

CRD：GydF4y2Ba

完全随机设计GydF4y2Ba

戴：GydF4y2Ba

接种后第二天GydF4y2Ba

绿色荧光：GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白GydF4y2Ba

格斯：GydF4y2Ba

β-葡萄糖醛酸酶GydF4y2Ba

HSE：GydF4y2Ba

热休克元件GydF4y2Ba

HSF：GydF4y2Ba

转录因素GydF4y2Ba

Inoc公司：GydF4y2Ba

接种GydF4y2Ba

J2:GydF4y2Ba

第二阶段青少年GydF4y2Ba

模拟:GydF4y2Ba

不接种GydF4y2Ba

QTL：GydF4y2Ba

定量特质基因座GydF4y2Ba

SCN编号：GydF4y2Ba

大豆囊肿线虫GydF4y2Ba

上海标准普尔：GydF4y2Ba

小热休克蛋白GydF4y2Ba

TSS：GydF4y2Ba

转录起始点GydF4y2Ba

WT：GydF4y2Ba

野生型GydF4y2Ba

我们要感谢我们的实验室同事来自Comblapa Soybean的支持和全国改善高等教育（CAPES）的奖学金理事会。GydF4y2Ba

这项工作得到了来自巴西政府和CNPQ，Comblapa大豆和全国改善高等教育理事会的MCT的Inct Plance Regress Biotech Grant提供支持，以获得奖学金。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 隆德里纳州立大学生物化学与生物技术系，隆德里纳，巴西GydF4y2Ba

   Suellen Mika Hishinuma Silva和Rafael Bruno Guayato NomuraGydF4y2Ba

2. 田纳西大学植物科学系，诺克斯维尔，美国TNGydF4y2Ba

   斯蒂凡尼娅·洛佩斯·凯塔（Valéria Stefania Lopes Caitar）GydF4y2Ba

3. 巴西隆德里纳Paraná-Iapar，隆德里纳农艺研究所生产与植物保护部GydF4y2Ba

   Bruna Caroline Sercero.GydF4y2Ba

4. 北帕拉那州立大学，Bandeirantes，巴西GydF4y2Ba

   aline garcia da Silva＆Mayra Costa da Cruz Gallo de CarvalhoGydF4y2Ba

5. 巴西农业研究公司植物生物技术部EMBRAPA Soybean，Londrina，PR，BrazilGydF4y2Ba

   伊凡尼·德奥利维拉·内格罗普斯、瓦尔迪尔·佩雷拉·迪亚斯和弗朗西斯马尔塞利诺·吉马雷斯GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

SMHS、VSLC和FCMG策划并设计了该研究。VSLC进行了计算分析。SMHS进行了实验，生成了图形，并起草了手稿。RBGN、BCS和AGS也参与了实验的执行和样品的制备。WPD为线虫实验提供了材料，有助于线虫实验的定位。IONL对数据进行统计分析。VSLC, RBGN, MCCGC, FCMG和IONL对手稿的讨论做出了贡献。所有作者阅读并批准最终稿件。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaFrancismarCorrêaMarcelino-GuimarãesGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

作者声明他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商说明GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放存取GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba. 知识共享公共领域放弃(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。GydF4y2Ba

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