过度的AtAHL20通过镇压导致拟南芥延迟开花英国《金融时报》表达

背景

29人成员拟南芥Ahl.根据核苷酸和蛋白质序列的进化差异，基因家族可分为三大类。这些差异包括内含子的存在或缺失，保守的AT-hook和PPC结构域的类型和/或数量。Ahl.基因家族成员分为两个系统发育型切口，疏水自然和思工-B。29个成员中的大部分仍然在功能上无表。此外，在不同AHL类型中发现的保守基序和域中观察到DNA和肽序列多样性的生物学意义是一个受试者区域，该主题区域仍然很大程度上是未开发的。

结果

转基因植物过表达AtAHL20在短期和漫长的日子间之后开花晚。成绩单累积分析显示35 s: AtAHL20植物含量缩短英国《金融时报》,TSF AGL8和SPL3mRNA水平。同样，过表达阿哈尔20年代正轨in.Camelina Sativa，拟南芥的密切相关Brassicaceae.家族成员种，通过抑制CsFT公司表达式。然而，过度表达的异常AtAHL20在AT-hook结构域高度保守的R-G-R核心基序中存在错义突变的基因破坏了晚开花表型。来自目标酵母双杂交分析的数据显示，AtAHL20与自身和其他几个之前参与花期调控的a型- i型ahl相互作用:AtAHL19, AtAHL22和AtAHL29。

结论

我们通过函数增益分析证明AtAHL20是一个负稳定者英国《金融时报》表达，以及其他下游调控开花时间的基因。类似的结果在Camelina Sativa转基因植物overexpressingCsAHL20建议这是一个保守的功能。我们的结果表明AtAHL20作为一个独立于光周期的负调节器过渡到开花。

29人成员拟南芥含核定位的AT-HOOK基序（AHL）基因家族在所有测序的植物物种中都存在，从苔藓范围内Physcomitrella金属盘开花植物如拟南芥那高粱双色那Zea Mays.和Populus Trichocarpa.[49.那50.］.AHL蛋白质的特征在于两个保守的结构单元：钩钩图案和植物和原核保存（PPC）结构域[1那12.］.

钩子是一个小的DNA结合蛋白质结构域，其首先在哺乳动物中的AHL同源物中以高迁移率组（HMG）非组蛋白染色体蛋白HMG-I（Y）。1］.Arabidopsis AHLs在钩域结构域中含有保守的精氨酸 - 甘氨酸 - 精氨酸 - 脯氨酸（R-G-R-P）核心基序[35.那49.那50.］.当来自所有测序的土地植物物种的钩钩结构域序列进行对准时，只有精氨酸 - 甘氨酸 - 精氨酸（R-G-R）氨基酸残基仍然保守100％，表明它们对功能很重要[50.］.对HMG蛋白和含有AT-hook基序的多肽的研究表明，AT-hook结构域通过R-G-R基序与富含at的DNA的小凹槽结合[1那18.那32.那33.］.该核心基序中的突变已被证明是废除DNA结合以及AHL蛋白质功能[14.那17.那35.那47.那49.］.

拟南芥ahls.演变成两个主要的系统发育方式：Clade-A和Clade-B [49.］.Clade-A和支系bahls.经历了多次基因复制事件，导致了基因家族的扩张[50.］.单一和多基因丧失功能突变体的功能表征表明遗传冗余存在多个Ahl.拟南芥基因[35.那40那49.］.在以前Ahl.基因淘汰赛研究，单一本文分别插入突变体包括AHL22-1[40]，sob3-4和ESC-8.[35.]没有表现出明显的表型，除非其他紧密相关的家庭成员也被淘汰出局。赵等人。[49.]报道了什么时候特定Ahl.基因以高阶组合被淘汰，例如在四重方面SOB3-4 ESC-8 AHL6 AHL22，与较低顺序基因敲除突变体组合相比，所得植物呈现出更显着的表型。此外，Zhao等人。[49.]还表明了sob3-6，携带密码等位基因在AT-HOOK主题的R-G-R核心中呈现致命的负突变体，与此相比显示了更戏剧性的缺口表型Sob3-4 esc-8 ahl6 ahl22四倍的突变。基于这些数据，提出了一种分子模型，AHLs相互作用，自身作用，以及其他核蛋白，如转录因子(transcription factors, TFs)，形成“DNA-AHL-TF complex”[49.］.总的来说，这些数据表明，基因冗余存在于AHLS。假设大多数AHLS函数作为复合物，并且DNA结合的钩子基质中的突变可能使整个复杂的非功能性[49.］.

拟南芥的职能丧失和职能增益研究都表现出色ahls.在植物生长发育过程中，包括生长素、油菜素内酯和赤霉酸信号转导、下胚轴伸长、叶柄生长、根系结构、环境胁迫反应、维管组织发育、花器官起始、器官大小、开花时间和花粉壁发育等[7.那8.那9.那13.那19.那20.那23.那26.那29.那34.那35.那39.那40那41.那42.那47.那51.那52.］.在29例拟南芥中Ahl.基因家族成员那13个已被鉴定;Atahl1，Atahl3，Atahl4，Atahl10，Atahl15，Ahl16，Atahl18，Atahl19，Atahl20，Atahl22，Atahl25，Atahl27和AtAHL29[12.那19.那28.那29.那34.那35.那39.那40那43.那47.那53.］.有趣的是，有几个功能特征ahls.（AtAHL16, AtAHL18, AtAHL22, AtAHL27和AtAHL29）直接或间接地涉及以冗余方式的开花时间调节[40那41.那42.那47.］.AtAHL16, AtAHL18, AtAHL22, AtAHL27和AtAHL29都是思工 - aahls.[49.］.

在这项研究中，我们利用了函数的增益分析策略，以避免与遗传冗余相关的潜在问题ATAHL20（AT4G14465），思工Ahl.．AtAHL20最初选择了功能分析AtAHL6（Clade-BAhl.基因家族成员)作为功能特征比较研究的一部分ahls.属于两个不同的系统发育型切口并含有不同的钩钩结构域类型。那项工作正在进行中;因此，这项研究仅重点关注AtAHL20．转基因植物过表达AtAHL20在漫长的日子（LD）和短日（SD）条件下伴随着野生型开花。关键开花时间调节器的转录物丰度分析，开花位点t (ft)，表明它的表达被压抑35 s: AtAHL20植物。此外，英国《金融时报》的冗余的同系物,TSF公司，以及其他下游开花途径基因，AGL8.和SPL3，也被压抑了35 s: AtAHL20植物。我们证明，在钩钩域中的保守R-G-R核心基序中的第二个精氨酸残留对于表现非常重要阿哈尔20年代过度表达表型。靶向酵母 - 两个杂交测定结果表明，阿哈尔20与其最近的家庭成员及其最近的家庭成员以及其他目的，其先前已被证明为调节开花时间的其他人的植物AHL19和ATHL229。总的来说，我们证明了这一点AtAHL20是一个密光无关的阻遏物英国《金融时报》表达和其他下游开花途径基因。

AtAHL20组织表达模式

我们分析了阿哈尔20年代通过转录融合的表达模式β-Glucuronidase.(格斯)报告基因。强劲的全球格斯信号在所有组织中都被观察到，包括根毛，这表明AtAHL20在幼苗中组成型（图。1), 12天的老Patahl20-Gus.显示转基因植物格斯叶片轻微脉和毛状体中的活性（图。1b） 是的。在花的结构上，格斯在花瓣，花瓣脉管，花药，柱头和样式的上部检测到活动，但是在花梗和花序梗血管系统中较弱（图。1C，D）。半定量PCR分析也显示出差异AtAHL20组织表达模式在整个幼苗，幼苗根，下胚轴，花和单片体中，一种与GUS组织化学染色图案类似的趋势（图。1e）。大部分，AtAHL20展示了一种无处不在的组织表达模式和重叠pFT-GUS莲座叶小脉的表达模式[36.］.

35 s: AtAHL20植物晚点比野生型开花

基因过表达研究和激活标记屏幕已成为用于表征的关键工具Ahl.基因功能[28.那35.那40那43.]. 多个独立的转基因植物过度表达AtAHL20表现为矮化表型(图。2a，b）和与野生类型相比的晚开花表型ahl20-1/AHL20-2 T-DNA两个LDs下的插入线（图。2c, d)和SDs(图。2e，f）。以前，显示了在钩结构域中的保守精氨酸氨基酸残基是必要的AtAHL22和ATAHL29的功能表型(35.那47.那49.］.因此，我们接下来检查了这是否是这种情况AtAHL20．我们生成了携带的构造AtAHL20含有点突变的编码序列(ATAHL20M.）在保守的R-G-R核心基序中，将精氨酸残基数72改变为组氨酸（R72> H）。合成的35 s: AtAHL20m过表达该突变蛋白的转基因植物失去了在植物中观察到的矮化和晚开花表型35 s: AtAHL20植物（图。2a-f）。取而代之的是35 s: AtAHL20m与野生型和野生型相比，转基因植株表现出早花表型本文分别在SDs和ld下的插入线(图。2C-F）建议AtAHL20是一种不依赖光周期的花抑制因子。这些结果表明，第二保守的精氨酸残基是必需的表现阿哈尔20年代过度表达表型。

拟南芥和Camelina的保守功能AHL20型正轨

自从拟南芥和Camelina Sativa是密切相关的Brassicaceae.科成员种[2那21.，我们假设有些Ahl.立方体将共享类似或重叠的生物功能。测试这个假设，三个Camelina之一AHL20-like副本CSAHL20（LOM104718987），和哪个相似度高AtAHL20在核苷酸和蛋白序列水平上克隆到双载体35s Camv.发起人。结果构造用于转换Camelina Sativa（L.）Crantz var。卡纳野生型植物。我们孤立多个t_3.与野生型对照相比，纯合单轨插入过表达线，其呈现后开花和矮化表型（图。3.一种）。这些表型类似于观察到的表型35 s: AtAHL20转基因植物，推断Camelina和ArabidopsisAHL20型基因具有类似的生物学功能。

AtAHL20压制英国《金融时报》表达

进一步调查观察到的晚开花时间表型的原因35 s: AtAHL20在转基因植物中，我们测量了关键调控开花基因的转录水平，开花位点t (ft)[4.]通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-QPCR）。英国《金融时报》成绩单水平35 s: AtAHL20转基因植物降至近30％的野生型水平（图。4.一种）。该结果类似于在过表达另一个人的植物中报告的结果Ahl.基因家族成员,AtAHL22[40］.相比之下，35 s: AtAHL20m植物含有升高的英国《金融时报》与野生型和35 s: AtAHL20植物（图。4.a），与在这些植物中观察到的早期开花表型一致。

自从35秒：CSAHL20转基因Camelina植物与野生型相比显示出晚开花的表型（图。3.a），我们假设这是由于抑制了CsFT公司表达式。RT-qPCR数据显示，转录水平为三种之一CsFT公司基因在35秒：CSAHL20与野生型植物相比，植物被压抑四折（图。3.b）。序列对齐显示出高度相似之处at和CsFT公司核苷酸和肽序列。

使用高通量下一代核糖核酸（RNA）测序（RNA-SEQ）的转录分析是一种有价值的工具，用于鉴定全球水平的差异表达基因[45.那46.］.进一步深入了解整体开花时间途径转录组扰动35 s: AtAHL20将转基因植株与野生型植株进行比较，进行RNA-Seq分析。通过Kal 's z检验来鉴定野生型和野生型之间的差异表达基因35 s: AtAHL20转基因植物（数据S1-2）.结果表明，1628个基因表达下调，2179个基因表达上调35 s: AtAHL20转基因植物与野生型相比。基因本体（GO）分析[30.]根据下调的基因列表进行(数据S1） 在35 s: AtAHL20与野生类型相比的植物。这导致在生殖发育的小子集中鉴定出3个调节开花时间的基因;AGAMOUS-LIKE 8（AGL8/AT5G60910），鳞片启动子结合蛋白-LIKE 3（SPL3/AT2G33810）和FT双妹妹（TSF / AT4G20370）．通过RT-QPCR分析证实了该结果，其显示了所有三种基因的抑制35 s: AtAHL20植物与野生型相比（图。4.b）。然而，AGL8.那SPL3和TSF公司转录本积累水平在35 s: AtAHL20m和ahl20T-DNA插入突变体植物（图。4.b）。

AtAHL20与其他枝状- a型AHLs相互作用，参与花期调控

已经证明了几种AHL蛋白与自己和其他非AHL蛋白相互作用[25.那28.那35.那47.那49.］.有趣的是，几个人的思工 - aahls.已经与开花时间表型相关联，表明这些基因中存在遗传冗余[40那41.那42.那47.］.因此，我们通过靶向酵母双杂交(Y2H)测定，检测是否有Clade-A型AHLs形成homo和/或异二聚体。为了避免假阳性的蛋白-蛋白相互作用，将转化为诱饵蛋白的酵母置于合成定义(SD)培养基上，并预先确定抑制浓度为1 mM 3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)(图1)。5.一种）。通过SDII培养基的生长证明了通过SDII培养基的生长证明了酵母的成功共转化，并通过SDII培养基生长来证明（图。5.b）。我们展示阿哈尔20与本身相互作用以形成同源过二聚体（图。5.c).接下来，我们检测了其他参与花期调控的Clade-A ahl是否相互作用形成异二聚体。事实上，AtAHL20与AtAHL19、AtAHL22和AtAHL29相互作用。我们进一步询问所有的ahl是否可能相互作用，并测试了一个clad - b成员AtAHL6和一个clad - a成员AtAHL20之间的相互作用。AtAHL6和AtAHL20之间没有相互作用，说明并非所有的ahl都相互作用(图1)。5.C，表格1）.

过度的AtAHL20在拟南芥中赋予延迟开花的时间表型

我们的职能增益研究表明过度表达AtAHL20在SDs和LDs下都赋予了一个晚花期表型（图。2）.这一结果与之前的研究结果一致，表明存在几个枝a型拟南芥AHLs (ATAHL18，ATAHL.22日,AtAHL27和AtAHL29)在花期调节中[35.那40那47.］.具体而言，转基因植物过表达AtAHL22那AtAHL27和AtAHL29表现出开花晚的表型[35.那40那47.］.ATAHL22，ATAHL27.和AtAHL29单基因敲除突变体未显示出任何清晰的开花时间表型。只有当AtAHL27、AtAHL29 AtAHL22和AtAHL18同时敲出和/或敲下来，四肢突变体显示早期开花的表型[35.那40那47.］.这些数据表明ahls.可以作为调节基因表达的复合物的一部分作用[31.那37.那47.]这些基因和其他思工 - a之间存在这种功能冗余Ahl.家庭成员。的确，赵等人。[49.]提出了类似的模型，认为不同的ahl形成多ahl复合物来调节拟南芥下胚轴的生长。来自我们的目标酵母双杂交分析的数据通过证明AtAHL20与自身和其他cladea AHL成员发生物理上的相互作用来支持这个模型;AtAHL19、AtAHL22、AtAHL29(图。5.）.因此，可以想象，这些ahl作为一个复合物的一部分调节花期。AtAHL20不与AtAHL6相互作用(a Clade-BAhl.）表明并非所有AHL彼此相互作用。总的来说，我们已经表明了这一点AtAHL20是第五个思工 - aAhl.与拟南芥的开花时间调控有关。

AtAHL20是一个阻遏物英国《金融时报》表达

基因表达分析表明过表达AtAHL20导致了英国《金融时报》转录物水平（图。4.）.考虑到这几个，这并不奇怪ahls.， 包括Osahl1.那ATAHL5，ATAHL10，ATAHL12那AtAHL16那AtAHL20那AtAHL22那AtAHL27和AtAHL29,据报道，表现出启动子结合能力或已被证明赋予下游靶基因的转录抑制或激活[7.那8.那10.那11.那19.那24.那39.那41.那42.那54.］.特别是，之前的研究表明AtAHL20是拟南芥的防御的负调节因子[28.］.我们还表明，Camelina的Ahl20正轨压抑CsFT公司表达，表明两个物种之间存在一个守恒函数(图。3.）.它可以假设有几个ahls.单独调节基因转录或作为拟南芥和其他物种的蛋白质复合物的一部分[7.那24.那47.那49.］.我们的研究没有显示出直接的生物机制联系AtAHL20基因的过度表达和抑制英国《金融时报》转录。然而，一个接近的a级Ahl.家庭成员, AtAHL22，被证明是压制英国《金融时报》通过染色质重塑过程表达[47.］.这发生了通过英国《金融时报》染色质建筑通过H3乙酰化和甲基化改性。此外，Favero等人。[7.]还表明了AtAHL29，一个疏口党Ahl.，直接绑定到YUC8和SAUR19启动子导致基因表达抑制。李及徐，[24.进一步证明了这一点AtAHL27和AtAHL29捆绑yuc9.通过染色质调节剂的SWI2 / SNF2相关1（SWR1）复合物的启动子和抑制基因表达。最近，Favero等。[8.[ATHL29表明，ATAHL29与PIF靶向基因座结合以减少PIF对这些区域的结合，从而抑制拟南芥叶虫草中生长促进基因的转录激活。我们假设阿哈尔20也可能绑定英国《金融时报》启动子元件和抑制其表达，可能单独或作为复合体的一部分。毕竟，AtAHL20已经被证明对几种含A/ t的元素具有结合亲合力[10.那11.］.可以通过包括酵母 - 单杂化和（染色质免疫沉淀）芯片RT-QPCR实验的未来研究来提供对基因抑制机制问题的最终答案。有趣的是，35 s: AtAHL20植株表现出相似的成年植株表型(矮化和晚开花)35 s: AtAHL22植物（图。2),ESC-D / ATAHL27也SOB3-D / ATAHL29[35.那40］.靶向的Y2H研究表明，ATAHL20与ATAHL22相互作用，和SOB3 / ATAHL29（图。5.）.因此，这些AHLS函数冗长以调节开花时间，可能是包含ATAHL19，ATAHL20，ATAHL22和ATAHL29的复合物的一部分。

在钩钩域中的畸形突变废除阿哈尔20年代过表达表型

我们假设是在阿哈尔20年代AT-hook域将基于其他分支a中的类似结果取消功能Ahl.基因家庭成员，AtAHL29[35.),AtAHL22[47.］.因此，这并不奇怪35 s: AtAHL20m转基因植物(无花果。2A-F）失去通常在野生型时观察到的后开花表型AtAHL20基因过度表达。我们的工作假设基于[35.那47.那49.]是AT-hook结构域保守的R-G-R核心中的第二个精氨酸残基对DNA结合很重要，没有它，AtAHL20就不能结合富含at的DNA，并招募染色质修饰成分来抑制英国《金融时报》转录。这与Lu等人的缺失突变研究一致[28.]他指出去除整个AT-hook结构域可以消除AtAHL20的抑制功能。例如，这就提出了一个有趣的问题，即在1型和2型AT-hook基序中发现的保守R-G-R氨基酸三联体与AT-hook结构域两侧的肽序列的生物学重要性。在所有三种AHL类型（I型，−二、，−三） 也要废除在过度表达这些基因的转基因植物中观察到的过度表达表型？R-G-R核两侧氨基酸序列的差异性在Clade-A和Clade-B AHLs中起什么作用？哺乳动物AHL同源基因HMGA蛋白的研究表明，不同类型的AT-hook结构域以不同的亲和力与DNA结合[5.那18.］.HMGA蛋白含有1型钩子钩，类似于CLADE-A AHL中发现的蛋白（例如ATAHL20，ATAHL22，ATAHL27和ATAHL29）[49.[是否发现由于R-G-R核心基序附近的肽序列的性质，被发现赋予富含富含DNA的亲和力。有趣的是，含有2型钩子的HMGA类似于ATAHL6中发现的2型钩子，对富含DNA的DNA结合亲和力降低了[5.那18.］.值得注意的是，来自的初步数据AtAHL6功能研究的增益表明，过表达携带R81-> H突变的异常基因的转基因植物（35satahl6m）难道不是取消了在35S：ATAHL6.植物。因此，我们可以推测这是否因为ATAHL6的钩域域具有低DNA结合亲和力的事实。将来，重要的是进一步研究含有不同钩钩类型的疏虫突变 - A的思叫突变突变的效果，其保守的R-G-R芯侧翼侧由发散的氨基酸序列侧翼。

英国《金融时报》镇压AtAHL20对下游开花途径基因表达产生负面影响

定量PCR数据显示过表达AtAHL20也导致了压抑TSF公司那AGL8.和SPL3表达式（图。4.b）。AGL8.和SPL3在下游的功能英国《金融时报》在开花途径[16.] 然而TSF公司冗余行为英国《金融时报》作为花卉途径积分器[44.］.两个冗余花卉途径集成商的事实英国《金融时报》和TSF公司转录水平以类似的方式调节35 s: AtAHL20转基因植物，提出了一个有趣的问题。做AtAHL20直接在这两个花卉途径集成商上行动，或者在他们上游行动。进一步的实验，包括芯片SEQ，酵母 - 单杂交测定有助于鉴定ATAHL20的直接靶标。以前的工作表明过表达AtAHL29，一种思工 - 一种类型-I基因（就像AtAHL20），也引起拟南芥的延迟开花[35.］.有趣的是，我们实验室的初步Chip-Seq数据显示，AtAHL29可以结合英国《金融时报》。在一起，这些数据表明ATAHL20可以通过直接结合其下游靶标的启动子来以类似的方式起作用。

与此同时，一个异常的AtAHL20蛋白在35 s: AtAHL20m转基因植物仅导致升高英国《金融时报》转录水平但不在下游开花途径基因TSF公司那AGL8.和SPL3。我们推测这一点AtAHL20间接地影响下游靶标的表达通过直接抑制开花途径的主要调节部件，英国《金融时报》．因此，也许提升了英国《金融时报》成绩单水平35 s: AtAHL20m转基因植物不足以显著改变下游成分的表达。

综上所述，过度表达AtAHL20抑制开花途径基因的表达英国《金融时报》,TSF AGL8和SPL3．相反，在钩钩域中携带困难的异常ATAHL20蛋白的异常ATAHL20蛋白废除了这些表型。这些数据表明AtAHL20是一种转录因子，其功能部分依赖于AT-hook域保守的R-G-R核心基序。

植物材料

所有拟南芥植物在哥伦比亚（col-0）背景。Col-0.和AtAHL20本文分别插入突变体,ahl20-1（Salk_144620）和ahl20-2(Salk_148971)种子来自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC)。亚麻荠植物Camelina Sativa(l)Crantzvar.在25°C的温室(光照16小时，黑暗8小时)中生长。亚麻荠的种子是由华盛顿州立大学的scott Hulbert博士提供的，他是从华盛顿州立大学的Stephen Guy博士那里获得的。15.］.

转基因拟南芥和亚麻荠的克隆与生产

拟南芥

AtAHL20过度表达

含有拟南芥的网关兼容的入口向量Ahl.本研究中使用的基因编码序列和其他基因是从ABLC获得的。过度表达AtAHL20，网关入口载体，pENTR223，用于网关LR反应(Invitrogen, Carlsbad, CA)，目的载体pEarlyGate100二进制载体(35年代组成型启动子[6.］.二进制向量携带AtAHL20cDNA用于改变Col-0.通过花浸法种植的野生植物[3.］.为了在ATAHL20的AT-HOOK域中生成点突变，我们使用了使用网关兼容底漆的Quikchange闪电站点定向诱变套件（Agilent，Santa Clara，CA）（表2). 带载体AtAHL20在定点定向诱变反应期间使用cDNA作为模板。测序所得构建体以确认在各种编码序列中的精氨酸残基的成功突变。

GUS构造

阿哈尔20年代1335 BP长启动子区域使用网关相容的引物（表）扩增PCR（表2）通过BP反应（Invitrogen，Carlsbad，CA）克隆到网关兼容的进入载体PDONR221中。在BP反应之后，测序所得进入载体以确认不存在突变。PDONR221入口向量携带AtAHL20通过网关LR反应将启动子克隆到网关相容的目的地载体PMDC163（ABRC）中，以产生启动子：GUS表达二元载体。

在野生型中产生了表达上述结构的转基因拟南芥植株Col-0.背景通过花浸法[3.］.在0.5×Linsmaier和Skoog改性基础培养基上筛选转基因种子，其补充有含有1.0％（w / v）植物（Sigma-Aldrich），1.5％（w / v）蔗糖的合适抗生素，在25℃下在连续白光下珀西瓦氏菌E-30B生长室。

Camelina Sativa

过度的CsAHL20

CsAHL20 (LOC104718987)在Blast搜索使用后，从NCBI数据库中提取编码序列AtAHL20 (AT4G14465)序列作为查询。引物（表2)从提取的序列中设计并用于扩增CsAHL20的编码序列。PCR扩增产物经Gateway BP克隆酶II (Invitrogen, Carlsbad, CA)反应克隆到pDONR221 Entry载体中，得到pDONR221- csahl20 Entry载体。将pDONR221-CsAHL20与目的载体pUSH21进行Gateway LR克隆酶II (Invitrogen, Carlsbad, CA)反应生成pUSH42-2。在这个构造表达中CsAHL20,编码序列和选择标记DsRed分别由CaMV 35S启动子驱动。二进制向量被转换成根癌土壤杆菌菌株GV3101，通过花浸协议用于植物转化[27.］.T₁用绿色LED灯照射转基因植物的种子，并在红色滤镜下目测荧光种子[27.］.单插入T-DNA T.₂通过筛选产生3：1荧光种子的植物来鉴定突变体。纯合的T._3.来自单个基因座插入线的PUSH42-2-CSAHL20植物用于RT-QPCR分析。

酵母 - 二杂交质粒

以gal4为基础的Y2H系统用于蛋白质相互作用分析[38.］.酵母菌菌株l40ccu3，诱饵矢量（pBTM116-GW-D9)与TRP1记者标记和猎物矢量（pACT2-GW)与鲁报告标记来自Hanjo Hellmann博士的实验室(Washington State University, Pullman, WA)。入口矢量携带ATAHL6，ATAHL19，ATAHL20，ATAHL22和ATAHL29的利用LR反应中的编码序列基因，将相应的开放阅读框克隆到诱饵和猎物载体中(pBTM116-GW-D9） 和 （pACT2-GW)分别是。活性酵母细胞转化诱饵和猎物质粒构建使用标准醋酸锂协议。转化的酵母活性细胞在28℃孵育3天 °C，在补充有Leu和His（SDII）的SD最小培养基上。随机选择4个菌落，20分钟前在高压蒸馏水中稀释1:2000 在缺乏色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶且含有预定水平的3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）的SDII和SDIV上同时滴注μL。酵母在28℃培养 3-6°C 天。

RNA提取，cDNA合成，RT-QPCR，半定量PCR和数据分析

根据制造商的建议，使用植物RNA Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA）从½×MS培养基上生长的10天老Camelina幼苗中提取了总RNA。对于拟南芥，从从21天的成年植物收集的莲座叶中提取总RNA（分析量化英国《金融时报》那TSF公司那AGL8.和SPL3通过RT-qPCR)，以及7天龄幼苗根系、7天龄幼苗全株、成株莲座丛叶、7天龄幼苗下胚轴、花和角果(用于半定量PCRAtAHL20组织特定的表达式)。柱上DNA酶处理进行消化任何潜在的污染基因组DNA。用iScript Reverse Transcription Super mix (Bio-Rad, Hercules, CA)从总RNA (500 ng)中合成互补DNA (cDNA)。RT-qPCR使用Bio-Rad的SSO Advanced Universal SYBR Green Super Mix (Bio-Rad, Hercules, CA)和10倍稀释的cDNA模板(以上合成)在Bio-Rad的CFX96触摸实时PCR检测系统上进行。交叉检查SYBR绿孔的熔化曲线，以消除非特异性扩增。数据归一化为MDAR4信使核糖核酸(mRNA)的表达(内部控制)，显示相对于控制植株的折叠变化。误差条表示技术重复的标准偏差(N= 3)．每个植物线使用三种生物重复。

RNA-SEQ图书馆准备

使用MagJET植物RNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)从生长室培养的21天植株的莲座叶中提取总RNA。使用Dynabeads mRNA DIRECT Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)纯化完整的聚腺苷化(polyA) mRNA。RNA-Seq文库使用离子总RNA-Seq Kit v2 (Life Technologies, Carlsbad, CA)，按照制造商的协议制备。

使用CLC基因组学工作台软件（QIAGEN，VALENCIA，CA）分析RNA-SEQ数据集。RNA-SEQ文库由从三个独立植物中的莲座叶组织提取的RNA构建。kal的z-test后[22.]，基因被分类为差异表达，错误发现率（FDR）被调整P.-value < 0.05和一个折叠变化绝对值> 3。

读取映射和差异表达

已经被Torrent Suite ver 4.2.1测序软件(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)删除了适配器序列的Reads，使用CLC Genomics Workbench 7.5 (Qiagen, Valencia, CA)的默认设置进行质量修剪。对RNA-Seq数据进行预处理后，使用CLC Genomics Workbench 7.5 (Qiagen, Valencia, CA)将reads定位到拟南芥基因组的TAIR10版本。每个基因的读计数使用RNA-Seq分析工具使用默认设置进行量化。原始值的差异表达用比例统计分析工具确定，使用Kal’s z检验和FDR校正。

组织化学GUS分析

GUS分析如[48.]在6天大的幼苗、12天大的植株和温室中生长的开花植物的花结构上。

开花时间分析

已经观察到将幼苗移植到土壤中会导致可以改变开花时间的应力。因此，所有种子都直接播种在含有预浇水土壤混合阳光50混合体50 mix4（骨料）La4的锅中播种，（绿岛分配器公司; riverhead，n.y）。随后将这些罐在4℃下在黑暗中孵育7天，诱导近均匀的发芽。之后，在以下条件下将罐转移到生长腔室中：白光（200μmolm^{- 2}年代^{- 1})， 21℃，湿度60-70%。一旦秧苗长了几天，就用小剪刀把它们修剪成每盆一株。实验室的经验表明，移除整棵幼苗会对周围的幼苗造成根部损伤，进而可能导致损伤/压力，从而改变开花时间。该方法对各基因型的花期结果具有最均匀和可重复性。为了测量开花时间，我们计算了从萌芽到花茎在基生莲座上头0.5 cm处的天数。

序列对齐

AtAHL20、AtFT、CsAHL20和CsFT核苷酸和蛋白质序列从NCBI数据库下载(数据S3). 核苷酸和蛋白质序列比对均使用BOXSHADE公共服务器进行https://embnet.vital-it.ch/software/BOX_form.html．

支持本文的结论的RNA-SEQ数据集是（是）在NCBI序列读取档案（SRA）存储库中提供，下面的链接下的登录号PRJNA671767：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=PRJNA671767

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。

3-at：

3-氨基-1,2,4-三唑

阿布斯：

拟南芥生物资源中心

AGL8:

静态般的8

AHL：

含有核局部的钩子图案

AHL20:

钩模体包含核定位#20

ANOVA：

方差分析

在：

腺嘌呤胸腺嘧啶

:

拟南芥

CaMV:

花椰菜马赛克病毒

Col-0.：

哥伦比亚

Cs:

Camelina Sativa

脱氧核糖核酸：

脱氧核糖核酸

英国《金融时报》:

开花轨迹T.

FDR：

假发现率

去：

基因本体论

格斯:

β埃塔-Glucuronidase.

HMG：

高移动组

身份证号码：

漫长的日子

SD：

短日

MDAR4：

单羟基血萎阴本还原酶4.

mRNA：

信使核糖核酸

NCBI:

国家生物技术信息中心

PPC:

植物和原核生物保存

R-G-R-P：

精氨酸 - 甘氨酸 - 精氨酸 - 脯氨酸

RNA-SEQ：

核糖核酸测序

RT-QPCR：

逆转录定量聚合酶链反应

SD：

合成定义

扫描电镜:

平均标准误差

SPL3：

鳞状藻启动子结合蛋白样3

本文分别:

脱氧核糖核酸转移

TF：

转录因子

TSF:

ft的孪生姐妹

我们感谢华盛顿州立大学的Hellmann博士捐赠了这项研究中使用的酵母 - 双杂交图书馆和载体。我们也很感谢华盛顿州立大学苏格兰博士捐赠Camelina种子。

这个项目是由农业和食品研究专项竞争格兰特# 2013-67013-21666的美国农业部国家粮食和农业研究所(M.M.N.),美国农业部国家食品和农业、孵化项目# 1007178 (M.M.N.),和Brubbaken Reinbold单子叶植物培育基金(M.M.N.)。该项目也得到了全球植物科学倡议研究基金(华盛顿州立大学，R.T.)的支持。资助者没有参与研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写。

从属关系

1. Solulular植物科学，华盛顿州立大学，Pullman，WA，99164

   Reuben Tayengwa＆Michael M. Neff

2. 华盛顿州大学，华盛顿州，沃尔曼，WA，99164

   Reuben Tayengwa，Pushpa Sharma Koirala，Courtney F. Pierce，Breanna E. Werner＆Michael M. Neff

3. 地址：美国大学马里兰州植物科学及园艺景观部门，MD，MD，20742，USA

   鲁本Tayengwa

4. 现地址:华盛顿州鱼类和野生动物部，华盛顿州奥林匹亚，美国，987501

   Pushpa Sharma Koirala.

5. 目前地址：美国农业部，动物和植物健康检验服务，野生动物服务，国家野生动物研究中心，柯林斯堡，CO，80521，美国

   考特尼·皮尔斯

6. 您的地址：华盛顿州立大学护理学院，斯波坎，WA，99202，USA

   Breanna e·沃纳

贡献

R.T.和M.M.N设计了这项研究。R.T.，P.S.K.，C.F.P.和B.E.W.进行了实验。R.T.产生了所有用于拟南芥研究的结构。P.S-K。生成的构造用于Camelina Sativa研究。p.s.k生成并分析了所有Camelina Sativa转基因材料。C.F.P.和B.E.W.参与生成和筛选AtAHL20转基因材料。R.T.和m.nn.写了这篇论文。所有作者阅读并认可的终稿。

通讯作者

对应于鲁本Tayengwa．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商说明

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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