大豆蛋白质半胱氨酸蛋白酶的基因组调查及根结节共生中的表达分析

背景

植物藻毒素样半胱氨酸蛋白酶（PLCPS.)是一类蛋白质水解酶，在根瘤共生(RNS)中起着重要作用PLCP公司豆类中的家庭基因非常有限，以及角色Glycine Max Plcps.(gmplcps.)在结瘤过程中，对结节的发育和衰老还没有完全了解。

结果

在本研究中，我们确定了97gmplcps.并进行了一个基因组的调查来探索大豆的扩张PLCP公司家族基因及其与RN的关系。19个亚拉加罗对基因组段，由77组成gmplcps.通过全基因组重复（WGD）事件形成的，鉴定出现，显示重复的高度复杂性。不同物种之间的系统发育分析表明谱系分化gmplcps.发生在家系扩展后，大串联重复片段在大豆中具有特异性。表达模式gmplcps.在共生相关的组织和结节中鉴定了相关的RNS相关gmplcps.并提供了在大豆中投入其推定的共生功能的见解。共生函数分析表明RNS相关GMPLCP.基因(glyma.04g190700）真的参与旋结和结节发展。

结论

我们的发现提高了我们对豆科植物功能多样性的理解PLCP公司家族基因，并为豆类的推定作用提供了见解PLCPS.在结瘤过程中，根瘤发育和衰老。

植物藻素状半胱氨酸蛋白酶（PLCPS）是一种大类与植物病原体/害虫相互作用，种子萌发，发育，免疫，衰老，环化和应力反应相关的大类蛋白水解酶[1.,2.,3.,4.,5.,6.,7.,8.］．PLCP属于C1A CYSPROT（家族C1，CLAN CA），是植物半胱氨酸蛋白酶的典型成员[3.,9］．这些酶作为惰性前体制备，用信号肽，自动抑制前驱蛋白和活性蛋白酶域[1.］．此外，一些plcp在其c端区域携带GRAN域[10.］．PLCP公司家族基因已被系统地研究拟南芥，橡胶，木薯，蓖麻，杨树，葡萄树，gossypium hirsutum,卡里卡番木瓜和米[1.,11.,12.,13.,14.]，虽然研究PLCP公司家族基因在豆类的整个基因组中非常有限。

PLCP公司家族基因已被证明参与结瘤[15.,16.]以及大豆的结节发育和衰老，黄芪西科斯,Pisum sativum.和截形苜蓿[17.]. 例如，PsCYP1在不确定结节中的衰老开始表达，PsCyp15A型和mscyp15a.在结节中表达[18.,19.］．MTCP6.在发育和应激诱导的结节衰老中诱导表达，其早期表达促进结节衰老[20.］．MTCP77通过加速植物PCD和ROS累积来确定结节衰老[21.］．Asnodf32.，结节特异性半胱氨酸蛋白酶[22.]负面调节结节发育，组织衰老和结节寿命A. SINICUS.[23.］．大豆CYSP1(gmcysp1.）可能参与结节发育和衰老[24.］．然而，这些研究主要基于个别成员PLCPS.．在大豆，数十个PLCPS.与根结节共生（RNS）有关[25.,26.,27.]，虽然的作用GMPLCP.在旋转瘤中，不完全理解结节发育和衰老。

在本研究中，进行了全基因组调查，探讨了大豆的特殊特点和扩展PLCP公司家庭基因。表达概况gmplcps.在大豆根结节中分析共生以识别RNS相关的PLCPS.. 共生功能分析表明，一个RNS与GMPLCP.基因(glyma.04g190700)可能在结瘤和结节发育中发挥作用。我们的发现提高了我们对豆科植物功能多样性的理解PLCP公司家族基因，并为豆类的推定作用提供见解PLCPS.在结瘤过程中，根瘤发育和衰老。

鉴定PLCP公司在大豆的基因家庭

大豆基因组的调查初步鉴定了106个基因基因座编码推定的PLCP甘氨酸最大var。威廉姆斯82基因组（表S1.）。所鉴定的大豆PLCP具有各种分子量，其各种分子量为6128.82-57,479.13Da，它们编码了具有55〜517个氨基酸残基和等电点（PI）的肽4.3〜9.32。NIH / NLM / NCBI CD搜索工具分析了这些106 PLCP中的保守域，以及表S2.列出详细信息。抑制剂_I29和肽酶_C1基序在大豆PLCPs中普遍保守，5个PLCPs（Glyma.04G028300、Glyma.10G120700、Glyma.13G229100、Glyma.14G085800和Glyma.17G239000）也有GRAN基序。此外，在这106个大豆PLCP中，有9个根据其序列长度被认为是假定的假基因（表S）1.)以及肽酶C1结构域缺失或肽酶C1结构域中存在大片段缺失（表S）2.），所以我们在大豆中识别出97个GMPLCP。

染色体地点和大豆重复PLCPS.

研究大豆的潜在重复性PLCPS.首先，候选人GMPLCP.位于一对副骨块中的重复对甘氨酸WGD。如图1所示。1.，含有77豆豆的19个候选副潜级段对PLCPS.在17豆蔻染色体上观察到。此外，两个基因簇（Glyma.06G275100,glyma.06g275200.和格莱玛06G275300；glyma.06g283000.和glyma.06g283100在染色体6上观察到）和glyma.12g130300.在染色体12上的大基因簇中定位。第二，在候选重复段对中进一步进行了共同性分析。2.示出了候选重复段对的侧翼区域。最后，由19个重复的段对甘氨酸确定了WGD事件（表1.). 值得注意的是，第10对和第11对在6号染色体或12号染色体上有较大的串联重复片段，表明这些大豆中存在高度的复杂性PLCP公司复制品。

利用大豆基因组数据库检索这些基因的同义突变率(Ks)值PLCPS.．所有KS值范围为0.1028至0.3374，而这19个重复的副吡咯的分歧时间为8.43和27.66 mya，平均为14.2 mya（表1.)，这与WGD事件（10–20 Mya）一致。非同义突变率（Ka）与Ks（ω）之比 = Ka/Ks）通常用于测量作用于编码序列的选择历史[28.］．当ω<1时，至少一个基因在净化选择下，​​而ω> 1表示定向选择[29.,30.］．表格1.表明，对于17个重复的段对（第10号和第11号除外，ω为0.069至0.643，表明这些基因受净化选择受到限制。

系统发育和外显子性结构分析PLCPS.在拟南芥蒂利亚纳,M.血液凋亡,莲花japonicus.和大豆

探讨大豆的系统发育关系PLCPS.随着其他豆科植物和非豆科植物的那些，我们在97中进行了全长的肽序列对齐gmplcps.（大豆），26atplcps.(A. Thaliana.), 33mtplcps.(M.血液凋亡）和25岁ljplcps.(L. japonicus.)使用MEGA(6.0版本)(图。3.）。这个PLCPS.从这四种不同的物种分布在九个基团中（A组给A组）。其中，大豆PLCPS.和19个重复的分段对甘氨酸WGD事件分布在所有九个群体中，表明大豆的谱系分化PLCPS.发生在家庭扩张之后。大豆PLCP公司在这9个类群中，成员分布不均匀，其中A、B、D组仅以豆科植物组成PLCPS.（图。3.)，说明这三组在分化前就发生了A. Thaliana.和豆科植物或是A. Thaliana.或特定于豆类。除了，AT5G45890是独立于每组，表明该基因具有特异性特征和新功能。

之间PLCPS.虽然在三种豆科植物中发现了串联重复事件M.血液凋亡和L. japonicus，大串联重复片段对只存在于大豆中PLCPS.(对A组和B组的10和11)，表明这种复杂的复制PLCPS.是针对大豆，而不是豆类。数量PLCPS.在大豆中显着超过了M.血液凋亡和L. japonicus.除上述大串联重复片段事件外，其主要原因可能是大豆中的片段重复事件，特别是G组和I组(图1)。3.）。在这两组中，只有三个mtplcps.和三ljplcps.，虽然有20个副吡咯大豆PLCPS.. 然而，这些同源基因在大豆中保留的原因尚不清楚，这可能与大豆的某些生物学功能有关。

每个基因的cDNA序列PLCP公司在上述九个基团中（图。3.）与其基因组序列进行比较，以分析它们的UTR /外显子结构，并且在每组中发现了类似的基因结构PLCPS.（图。4.）。大部分的PLCPS.在A组到D组D表现出相对简单的基因结构，其中70％PLCPS.只包含一个内含子。E组到I组，所有PLCPS.在这五组中有两个或更多的内含子（图。4.). 这些群体特异性基因结构与它们之间的关系是一致的PLCPS.跨物种并进一步支持这些功能分歧PLCPS.．

对大豆的分析PLCPS.

去大豆PLCPS.基于使用大豆基因组数据库中的数据的42个GO术语调查。这些GO功能术语分为三类：生物过程，细胞组分和分子功能（图。5.），它们的详细基因ID信息显示在表S中3.. 其中，5个基因(glyma.06g042600.,glyma.06g282300.,glyma.12g124300.,格莱玛12G126000和glyma.12g131000)没有预期的Go功能。其余均具有半胱氨酸型肽酶活性，并参与了蛋白质的水解过程，其中大部分大豆为半胱氨酸型肽酶PLCPS.均定位于细胞外区(87个基因)。对于重复片段对，在对1中有两个基因，在对15中有三个基因，在最复杂的两对中有23个基因(对NO。10和11)参与衰老、乙烯反应、真菌防御反应、不相容互作和叶片衰老过程，并具有衰老相关液泡位置。在1、9、17和19对基因中，其中一个串联重复序列基因具有不同的功能。另外，其余12对基因对中，除第6对(glyma.06g042600.没有预测的去功能），两种基因都参与了相同的生物过程。

大豆的表达模式PLCPS.在RNS.

确定大豆不同成员之间的系统发育关系PLCPS.，我们基于97全长PLCP肽序列比对进行系统发育分析。结合图1中的分类。2.，这97豆豆PLCPS.被分成9级，例如大豆PLCPS.A组分为1类，大豆PLCP公司B组中的S分为2等级，等等（图。6.一种）。

确定哪种大豆PLCPS.参与RNS，我们首先调查了97豆豆的表达概况PLCPS.在植物共生相关组织数据库的基础上，建立了植物共生相关组织数据库，这些组织包括根、根毛、根瘤、根瘤。共生条件与根系。符号状态。结果表明，大豆PLCPS.在这些组织中具有不同的表达模式，并且大多数高表达基因主要关注在6级至10级（图。6.b）。然后，我们使用我们以前的RNA-SEQ数据[18.]分析了这97种大豆的表达谱PLCPS.根据我们之前的RNA序列数据（图。6.C）。我们比较了这97豆豆的表达水平PLCPS.在上述与共生相关的组织和结节样品中，并在与共生相关的组织中高表达的基因中，有些PLCPS.在结节样品中也具有高表达（图。6.b和c），表明这些PLCPS.可以参与RNS或结核发育。

考试是否这些PLCPS.在共生相关的组织和结节样品中的高表达具有结节发育和/或衰老的作用，我们分析了28所选择的表达差异PLCPS.通过QPCR不同的结节开发时间点之间。首先，四种参考基因的表达稳定性（elf1b.,Qact.,G6PD公司和泛素)，其中，elf1b.和Qact.所有样品中最稳定，而且GMG6PD.和泛素始终不稳定（图S1.）。然后，elf1b.和Qact.结果表明，这28个PLCPS.在五个结节之间有差异表达（图。7.）。其中，12PLCPS.在结节发育和/或衰老期间上调，并在接种后84天收集的结节处达到它们的峰（图84dN）（图。7.a、 d、g、l、n、r、s、u、v、x、y和ab）。四PLCPS.在结节发育过程中表达下调，在64dN或84dN时表达较低（图。7.B，C，F和H）。七PLCPS.在30dn或42dn达到峰值（图。7.e、 I、k、m、o、w和aa）。三PLCPS.在结节发育和/或衰老期间被下调在调节上调（图。7.p，q和z）。glyma.06g014800.在结节发育和/或衰老期间被上调然后下调（图。7.j），和格莱玛14G216300在30dn和84dn处具有高表达（图。7.t） 是的。

功能分析glyma.04g190700大豆毛状根转化的研究进展

如上所述，glyma.04g190700在共生相关的组织中高度表达（图。6.b） 并在结节发育过程中上调（图。6.c和图。7.g），建议glyma.04g190700可能在结瘤和结节发育中起作用。为了证实这一结果，RNA干扰glyma.04g190700采用大豆毛状根转化法（图。8.）。与BXYD3接种后50天的共生表型在50天内得分．rnaiglyma.04g190700导致结节数增加（图。6.一种）。RNAi的结节glyma.04g190700显示比对照显着更高的氮酶活性（图。6.b） 是的。表达水平glyma.04g190700和四种结果蛋白基因（ENOD40,结节35,钙调蛋白和LB1.）[31.,32.,33.通过毛发根和结节的QPCR检查（图。8.C和D）。这个glyma.04g190700与对照组相比，RNAi毛状根和根瘤中的转录物减少到50%以下（图。8.C和D）。四种结核蛋白基因的表达水平（ENOD40,结节35,钙调蛋白和LB1.）急剧增加了glyma.04g190700与控制毛根和结节中的那些相比，RNAi毛的根和结节（图。8.综上所述，这些结果强烈表明glyma.04g190700参与结核和结节发展。

PLCPS.是一大类蛋白水解酶，在RNS中发挥重要作用[7.,8.]，虽然全基因组研究PLCP公司豆科植物的家族基因非常有限。本研究首次对大豆进行了全基因组调查PLCP公司基因并探索大豆的扩张PLCP公司家族基因。结果的表达模式gmplcps.在大豆中，RNS为豆科植物的假定作用提供了见解PLCPS.在结瘤过程中，根瘤发育和衰老。

基因组扫描和大豆的扩展PLCP公司家族基因

基因组识别PLCPS.已系统地执行拟南芥，橡胶，木薯，蓖麻，杨树，葡萄树，G. Hirsutum,C. Papaya.和米[1.,11.,12.,13.,14.］．在本研究中，97gmplcps.在大豆中鉴定出，且数量多于以往研究中的其它植物。根据系统发育分支和结构特征，这些大豆PLCPS.被分为九个亚科，这与以前的研究相似[11.,34.,35.,36.］．然而，在这九个群体中，只用豆类形成三组PLCPS.而且只有26岁在PLCPS.在群体中，与其他研究有很大差异[1.,11.,12.］．

两种全基因组重复（WGD）事件发生约59和13 mA，在大豆基因组中经历了[37.,38.,39.]，对大豆中许多多岛家族的扩展具有显着贡献[28.,40,41.］．不同的基因家族可能有不同的多倍性衍生的重复事件和重复基因保留的进化机制[28.]，它在家庭的自适应演化和生物学功能中起重要作用[42.,43.,44.］．大豆PLCP公司基因家族中，数量明显多于A. Thaliana.,M.血液凋亡和L. japonicus.，这可能是由WGD事件，串联复制和大规模的分段复制来引起的[11.,12.］．在大豆的重复事件中PLCP公司基因家族两个大型节段复制对包括37gmplcps.小串联重复对和单基因片段重复对大豆的扩展也有贡献PLCP公司家庭基因。此外，这些重复簇基因的保留可能主要归因于它们不同的表达模式，在这些对中的特殊结构和功能，这与先前的研究相似[45.,46.,47.］．

潜在的共生功能gmplcps.在大豆

以前的研究表明PLCPS.在内源蛋白质转换中发挥重要作用[48.]种子特征，萌发和成熟[49.,50.非生物环境压力[11.,49.]及保护植物免受螨害[51.]， 菌类 [52.,53.]， 细菌 [54.[病毒[55.］．根瘤菌III型分泌系统（T3S）是植物病原体的毒力因子的导引子，可以通过豆类衍生的类黄酮诱导，并据报道通过主体防御系统识别来调节染色过程[56.］．此外，我们以前的研究表明，结节发育和衰老与植物免疫防御直接相关[26.］．PLCPS.据报道涉及生物和非生物应激[11.]负责对病原体细菌进行防御，并调节植物免疫力[54.]近年来发现了越来越多的分子机制[11.］．在本研究中，值得注意的是，没有大的串联复制对，只有两个小串联复制对gmplcps.在结节发展中表达了脱节，表明RNS相关GMPLCP.重复基因主要来源于单基因片段重复，而不是串联重复。与以往研究不同的是，RNS相关重复对中的两个同源基因在RNS中表现出相似的表达模式[11.］．

已经提出了以前的研究PLCPS.在几种豆科植物根瘤的发育和衰老中起重要作用[17.,20.,21.,22.,23.,24.,57.］．在大豆,PLCPS.可能在结瘤中起重要作用[15.,27.]以及结节发育和/或衰老[25.,26.］．然而，角色的gmplcps.在结瘤中，结瘤的发育和衰老尚未完全了解。在目前的研究中，表达谱gmplcps.在五种共生相关的组织和五种不同的结节样本中[18.]全面分析，结果确定了数十个相关的PLCPS.，建议多个gmplcps.可以参与结节信号识别和免疫和/或结节发育和衰老。在以前的转录简介数据中，表达式为14gmplcps.在衰老发作期间特别增加[25.］．在这些当中gmplcps.，在结节衰老期间，12个基因上调，而其余两个基因在64dN或84dn下具有低表达。在这项研究中，其他四个gmplcps.也可能在结节发育和衰老中发挥作用。此外，五PLCPS.可以参与氮固定过程，八个PLCPS.可以参与结核发育的早期和/或中期。这些数据表示gmplcps.可能不仅参与结瘤衰老，而且参与结瘤和结瘤发育。在本研究中，共生性功能分析glyma.04g190700表明它真的参与了染色结和结节发育。RNS相关的具体监管角色和不同功能gmplcps.需要进一步研究。

RNS相关的特征gmplcps.

以前的研究表明，多倍体衍生的重复基因导致豆类中的增强RN [58.,59.］．在本研究中，RNS相关gmplcps.主要集中在第5类到第9类，这些基因大部分参与了单基因片段的复制，说明多倍体起源于基因的重复事件gmplcps.在RNS中也发挥了重要作用。此外，RNS相关gmplcps.具有含有UTR序列和三个或更多内含子的相对复杂的基因结构。在这些RNS相关的GMPLCP中观察到三种发散的图案模式。第一个模式包含了Propeptide_c1域[60.]肽酶_c1a_cathepsin b域[61.]（仅适用于Glyma.03G226300和Glyma.19G223300）。在三种蛋白质中发现的第二种模式（Glyma.04G028300，​​Glyma.14G085800和Glyma.17G239000），不仅具有两个典型的基序（抑制剂_I29结构域和肽酶_C1结构域）[62.[还有一个Gran畴，也是与一些已知的plcps相似[10.］．其余的或大多数相关的RNS相关的GMPLCP通常被分类为包含两个典型图案的第三种模式。这些结果表明RNS相关GMPLCP中没有特殊的蛋白质结构，类似于染色和结节显影相关的大豆胱抑素[63.］．

总之，我们进行了一个基因组调查并确定了97gmplcps.．对由WGD事件产生的19个片段重复对进行了鉴定和分析，表明大豆的重复具有高度的复杂性PLCPS.．表达概况gmplcps.利用大豆根瘤共生体鉴定了RNS相关基因PLCPS.．共生函数分析表明RNS相关GMPLCP.基因(glyma.04g190700）真的参与旋结和结节发展。我们的研究结果改善了对豆类功能多样性的理解PLCP公司家族基因，并为豆类的推定作用提供见解PLCPS.在结瘤过程中，根瘤发育和衰老。

鉴定PLCPS.在大豆中，M. Truncatula.,L. japonicus.和A. Thaliana.基因结构分析

这个PLCP公司从大豆基因组数据库中鉴定了大豆家族基因[http://soybase.org/]以及甘氨酸最大wm82.a2.v1 phytozome数据库[http://www.phytozome.net/soybean.]. 用NIH/NLM/NCBI-CD搜索工具对所有已鉴定的GmPLCPs进行分析，分析其不含肽酶C1结构域或肽酶C1结构域存在大片段缺失和/或其序列长度< 150个氨基酸被认为是假定的假基因，并被手动删除（表S）1.和表S.2.). 采用基本的局部比对搜索工具算法（BLASTP），以e值<1e-10为阈值，进行同源序列的识别gmplcps.在M. Truncatula.,L. japonicus.和A. Thaliana.．外显子/内含子/ UTR结构PLCPS.通过使用基因结构显示服务器程序GSDS2.0进行分析（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）。

大豆PLCPS.顺序

检索phytozomev12.0数据库下载gmplcps.．expasy网站（http://web.expasy.org/protparam/)计算了其等电点和分子量gmplcps.．地图图表软件和大豆基因组注释文件（GMAX_275_WM82.A2.v1.gene.gff3）用于分析gmplcps.在染色体上。大豆和大豆饲养员的工具箱（https://soybase.org/gb2/gbrowse/gmax2.0/）用于获得被视为近期重复的块。

系统发育分析

不同的PLCPS.应用于多种系统发育分析，包括97gmplcps.，26PLCPS.从A. Thaliana.，33.PLCPS.从M.血液凋亡，和25L. japonicus.．共克尔W程序用于进行全长肽序列比对。Mega6软件[64.[邻居加工（NJ）方法和1000个引导复制与P距离模型的分析用于执行多种系统系统发育树。程序RAXML，MEGA V6.0和MRBAYES 3.2（http://www.megasoftware.net.）[64.,65.,66.]进行了97的系统发育分析gmplcps.．Raxml 8.0.0 [67.用于执行最大似然（m1）分析，使用raxml中的扩展多数规则共识树标准（Auto Mre）进行了1000个引导测试，用于执行Rapid 1000引导复制分析，混合模型用于构建MRBAYES分析。

大豆WGD事件重复片段对的识别与分析

为了识别由大豆WGD事件形成的重复片段对，首先确定每个片段对的同义词（Ks）GMPLCP.或重复的基因对gmplcps.是从大豆和大豆饲养员的工具箱中鉴定出来的。其次，根据分布的gmplcps.在大豆染色体和它们的同义值，鉴定了11串联重复基因簇（图。1.). 第三，初步鉴定了两个大的同源簇（10号和11号对），每对中有两个大的串联重复基因簇；5个同源簇（1号、9号、15号、17号和19号对），每对中有一个串联重复基因簇；12个同源基因对。然后，为了检验这些初步确定的19个候选旁同源片段对，本研究采用了以下两个标准：1）将重复片段对分组在一起gmplcps.系统发育树（图。3.和图。6.a）和2）在共聚合分析中显示候选重复段对的侧翼区域（图。2.）。

发散时间（T）用T = Ks/（2） × 6.1 × 10^{- 9}）×10^{- 6}mya [68.]估计复制对的日期。此外，使用PAML程序的ON00方法计算ParaLog对的非同义（KA）[69.]在重复后调查达尔文的阳性达尔文选择。计算Ka至Ks（ω= Ka / ks）的比率以测量在编码序列上的选择历史[28.］．

Go注释与基因表达分析

围棋诠释gmplcps.通过在大豆基因组数据库中使用“GO术语富集工具”进行[http://soybase.org/］．大豆数据库（https://soybase.org/Goslimu v2/仪表板。php）来下载这些Go术语的详细基因信息。植物群落数据库（植物群落12，http://www.phytozome.net/大豆）用于下载表达式模式数据gmplcps.在五种与共生相关的组织中。表达模式gmplcps.通过检索我们以前的RNA-seq数据，对5个结节样本进行了分析[26.］．r中的pheatmap包[41.用来产生这些的热量gmplcps.．

植物材料和生长条件

在日光温室中，将表面灭菌的大豆天龙一号幼苗在湿润的滤纸上萌发，昼夜周期保持在16/8 h和相对湿度（RH）分别为70%和28% °C，持续2–3天。然后在盛有消毒珍珠岩和蛭石（比例为1:1）的盆中生长幼苗，并用半强度B&D培养基浇水[63.］．4-5天后，使用大豆根茎113-2菌株（储存在我们的实验室）接种幼苗。从大豆结节中收集RNA分离的样品，在五个时间点：12dN（接种后12天结节），30dN（接种后30天结节），42dN（接种后42天结节），64dN（64天结节结节）在接种后）和84dn（接种后84天结节）。单独收集来自不同时间点的结节，用三种生物重复收集，并在-80℃下冷冻以进行RNA分离。

RNA提取和qPCR

我们使用TRIzol试剂（Invitrogen，USA）提取结节的总RNA，DNase I（Takara）消化总RNA，以及带有gDNA擦除器（Takara Bio，Inc.）的Prime Script RT试剂盒（完美实时）执行反向转录分析。使用Epoch多体积分光光度计系统、NanoDrop和Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）测量RNA的数量和质量，并使用五个RNA样品上的qPCR反应来确认这些RNA样品中不存在gDNA。使用表S中列出的引物组，将来自约1μg RNA的逆转录的cDNA用作qPCR的模板4.．RT-PCR扩增混合物（20μL）含有2μL模板cDNA，ITAQ血液SYBR绿色超混（10μL）（Applied Biosystems）和0.5μl前进和反向引物。在CFX连接实时系统（应用生物系统）上运行反应，每个测定包括无模板控制（负控制）。30s在95℃下的循环条件为30s，然后在95℃，在60℃下在62℃和12 s处在72℃下在72℃下的40℃和12℃下循环。PCR扩增后，为每个PCR产物产生熔化曲线以检查PCR反应的特异性（图S2.）。四种参考基因的表达稳定性（elf1b.,Qact.,G6PD公司和泛素）被评估，和elf1b.和Qact.被选为28所选择的QPCR分析的参考基因gmplcps.. 以两个参考基因为对照，采用geNorm方法对每个模板的样本周期阈值（CT）进行标准化[70]；E, PCR效率)分析qPCR实验中基因表达的相对变化。每个样本使用三个生物复制样本和三个或三个以上的技术复制反应，以确保统计的可信度。

Glyma.04g190700特定的RNAi

206bp的5^′- 解释glyma.04g190700通过PCR扩增并克隆到P5941-35S - 内含子 - （GFP-BAR标记）中，产生pglyma.04g190700-Rnai-1;185磅的3'-区域的片段glyma.04g190700通过PCR扩增并克隆到P5941-35S - 内含子 - （GFP-BAR标记）中，产生pglyma.04g190700-rnai-2。在这两者中glyma.04g19070特定于特定的RNAi载体，感觉和反义glyma.04g190700RNA序列将与内含子分开的串联连接。用于构建这两个的底漆glyma.04g190700-特定的RNAi载体列于表S中5.．

A. rhizogenes.细胞K599覆盆子glyma.04g190700-rna干扰-1，pglyma.04g190700-RNAI-2和空载体用于诱导大豆中转基因毛状根的形成。表达空载体的转基因毛状根用作对照。接种用BXYD3后，生长具有阳性转基因毛状根的植物50天，并评分染色表型。表达水平glyma.04g190700,ENOD40,结节35,钙调蛋白和LB1.在p中glyma.04g190700通过使用表S中列出的引物通过QPCR测定-RNAI或对照5.以及前面描述的过程[71.,72.］．如通过气相色谱（GC-14，日本）所述的乙炔还原测定（ARA）测定氮酰酶活性[73.］．

大豆毛状根转化

glyma.04g190700特定的RNAi构建体被转移到A. rhizogenes.通过电穿孔，然后A. rhizogenes.- 导明的程序[74.]诱导大豆毛状根形成。侵染后，将大豆幼苗移栽到含大豆全氮营养液的水培上，并用透明塑料覆盖以保证高湿度。愈伤组织形成后（约5 将幼苗移栽到大型水培池中。在两周内，毛状根开始从感染部位发芽，并用荧光显微镜进行筛选（图3.). 从转基因毛状根中提取基因组DNA，通过基因特异性引物证实CK和RNAi。每个幼苗只允许有一个转基因毛状根，并用绳子包裹。对于结瘤试验，转基因复合植物接种根序BXYD3并转移到含有1/10n（530mmol / Ln）的蛭石上的罐子，并在26°C的16- / 8小时/夜间循环中生长。我们在BXYD3接种后50天在50天内探测了这些转基因复合植物的结节表型，并使用了空载体转基因毛状根作为对照。

本研究中使用的所有数据和材料可在合理的请求时从相应的作者获得。

PLCP：

植物木瓜样半胱氨酸蛋白酶

RNS：

根结节共生

WGD：

全基因组重复

格兰：

肉芽桃

PI：

等电点

ks：

同义突变率

K a：

非同义突变率

RNAi：

RNA干扰

NJ：

邻接

ml：

最大似然

RH：

相对湿度

BLASTP：

基本的本地对齐搜索工具算法

T3SS:

III型分泌系统

我们感谢廖红教授对RNAi载体p5941-35S-内含子（GFP-Bar-marker）的贡献。

来自中国国家自然科学基金的资金（Grant No.11701346），中央非营利科学机构的基础资金（Grant No.1172018001），中国国家转基因项目（2016ZX08004-005）的基础研究资金（2016ZX08004-005），CAAS（CAAS-ASTIP-2016-OCRI）的农业科技创新计划，中国国家自然科学基金（Grant编号U1904102），南湖学者兴阳师范大学青年学者课程。资金机构在研究和收集，分析和解释方面没有在数据和写作稿件的设计中没有作用。

作者笔记

1. 松里元和丹霞克同样为这项工作做出了贡献。

隶属关系

1. 中国农业科学院石油作物，农作物，中国农业科学院石油作物遗传改善重点实验室，中国农业科学院石油作物研究所，武汉

   宋立元、李荣、陈海峰、张昌娟、黄奕、陈立苗、郝庆南、杨红荔、曹东、陈水莲、郭卫国、单志辉、杨忠禄、张晓娟、邱德镇、周新安

2. 2 .福建农林大学资源与环境学院，福建福州350002

   丹霞凯

3. 达美阳师范大学大别山区达比山农业资源研究所与利用与利用研究所

   丹霞凯，襄僵李＆雷王

4. Fafu-UCR园艺生物学和代谢组合中心，福建农业和林业大学，福州，350002

   乐峰关

贡献

S.Y.，D.K.，Y.G。和新安。Z.设计了这项工作，S.Y.写了稿件，S.Y.，D.K.，R.L.和X.L.执行大多数实验和分析，L.W.，H.C.，C.Z.，Y.H.，L.C.，Q.H.，H.Y.，D.C.，S.C.，W.G.，Z.S.，Z.Y.，Xiaojuan。Z.和D.Q.基本上贡献了这项工作的完成。所有作者都阅读并批准了最终手稿。

通讯作者

对应到乐峰关或者周新安．

道德认可和参与同意

不适用。

出版许可

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意事项

斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。

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