等位基因差异的分子基础表明恢复生育率1是甜菜中的复杂轨迹（Beta寻常魅力L.）

背景

细胞质雄性不育(CMS)是许多作物杂交制种中广泛应用的一个性状。甜菜CMS与一种名为preSATP6的独特线粒体蛋白有关，它形成一个250-kDa复合体。恢复生育率1（rf1.）是一种抑制CMS的核基因，因此是糖甜菜育种的目标之一。rf1.具有主导，半主导和隐性等位基因，表明它可能是多等位基因座;然而，遗传作用差异的分子基础是模糊的。分子克隆rf1.揭示了一种基因（orf20)，其蛋白产物可与preSATP6结合形成新的200 kda复合物。在恢复生育力的花药中，随着250-kDa复合物的减少，也能检测到这种复合物。分子多样性rf1.位点涉及组织多样性的基因簇组成orf20例如基因(RF-Oma1s).我们检验了成员聚集的可能性RF-Oma1在该基因座中，可能与生育恢复有关。

结果

六个但是无声化的RF-Oma1检测显性和隐性等位基因是否能产生200-kDa复合物。对转基因愈伤组织的分析表明RF-Oma1来自主导等位基因可以产生200 kda复合体，表明聚集在一起RF-Oma1在主导地位中的阶段可以参与生育恢复。两个隐性等位基因的三个副本中没有一个是200-KDA生成的。通过分析具有这些隐性等位基因的植物的细胞层的线粒体复合物来确认没有这种能力。我们与我们以前的数据一起设计了一组特定于200-KDA生成的PCR引物RF-Oma1该引物测定的mRNA量与花药中250-kDa复合物的量呈负相关，与花药中250-kDa复合物的强度呈正相关rf1.等位基因。

结论

糖甜菜的生育恢复rf1.可以涉及多个RF-Oma1结果表明，在基因座上堆积200-kDa的生殖拷贝增强了该基因的有效性，而在基因座上缺失200-kDa的生殖拷贝则使该等位基因无论拷贝数多少都是隐性的。我们建议用甜菜rf1.是一个复杂的轨迹。

细胞质雄性不育（CMS）是一种线粒体编码特征，是一些作物物种中的杂种种子产生的先决条件[1那2那3.那4.]．CMS通常与雄性无菌诱导线粒体中的特定蛋白质相关，但这些蛋白质的主要结构在物种中不同[5.那6.]．然而，一些CMS特异性蛋白质分享了几个特征，例如具有疏水结构域[7.]．在一些作物（如玉米，用萝卜CMS）和甜菜，CMS特异性蛋白质中已发现在线粒体膜中，作为低聚物形式[8.那9.那10]．

CMS被称为核基因抑制Restorer-of-fertility（RF.)[11]．通常,一个占主导地位的RF.等位基因抑制了CMS表达。因此，杂种种子生产的种子父母应该是纯合的隐性。另一方面，当f时₁杂种是用来生产种子或果实的₁植物应恢复生育能力以确保授粉。因此，辨别RF.基因型在杂交育种中非常重要，但是RF.- - -射频当植物与诱导非不育的线粒体结合时，它们在表型上难以区分。因此，揭示等位基因差异的分子基础RF.对推进混合养殖的巨大帮助。

分子克隆RF.揭示其基因产物是可变的，但最突出的类别编码了参与线粒体基因后转录过程的戊丙醛肽重复（PPR）蛋白[12那13那14]．PPR基因是植物基因组中一个大的基因家族，属于PPR型RF.属于子类被称为RF.-PPR-like基因(采用树脂)[15]．PPR型RF.倾向于聚集采用树脂：组织采用树脂-含基因簇因遗传资源而异[16那17那18]．然而，这种可变基因簇的意义尚不清楚。从作物育种的角度，诊断RF.等位基因是重要的。目前一个未回答的问题是，是否主导/隐性的性质RF.等位基因只取决于集群中特定基因副本的存在/缺失;换句话说，是否剩下的RF.可以忽略类似基因拷贝以进行等位基因诊断。

甜菜甜菜品种是源于CMS的杂交种[19]．甜菜CMS是欧文发现的[20.]，并与一个特定的39kda线粒体蛋白有关，该蛋白由一个起源未知的开放阅读框(ORF)编码，preSatp6[10]．翻译的产物preSatp6能在所有被检查的器官中找到[10]．这种蛋白质是高度疏水性的，当线粒体在温和的洗涤剂(如洋地黄素)中溶解时，可以从250 kda蛋白复合物中检测到[21]．

在某些情况下，甜菜肥料中生育恢复的遗传是复杂的[22]但是最好的糖甜菜之一RF.s是rf1.[23]．分子克隆rf1.揭示了一个基因群，其成员类似于Oma1，一种参与线粒体质量控制的酵母基因[23]．的Oma1类基因rf1.轨迹(以下RF-Oma1)非规范Oma1因为另一个明显的同源基因Oma1基因存在于甜菜基因组中;RF-Oma1可能通过基因复制随后进行了新功能化[24]．

在一个转基因实验中，其中一个RF-Oma1基因被证明能增加花粉的育性[23]．当这个RF-Oma1复制在CMS糖甜菜的悬浮细胞中表达，其翻译产品可以与PRESATP6蛋白结合，产生新的200-KDA蛋白质复合物，而一个RF-Oma1从隐性rf1.等位基因没有这样的活动[21]．200-KDA复合体也被检测到rf1.结果表明，200-kDa复合物的出现是花药间分子相互作用的标志RF-Oma1和preSatp6[21]．伴随着200-KDA复合物在生育恢复的花药中的出现，250-KDA复合物的量高度降低，但单体预备蛋白的总量几乎不变[21]．我们将这一现象解释为preSATP6蛋白的高阶结构发生了改变，这是由于其具有分子伴侣样活性RF-Oma1[21]．

我们的特殊兴趣是分子多样性rf1.轨迹。到目前为止，我们已经确定了六个的核苷酸序列Rf1 / Rf1不同的等位基因RF-Oma1拷贝数(无花果。1）（对于这些基因中的氨基酸序列同源物，请参阅附加文件1:表S1)。其中一个等位基因是半显性NK-305rf1.他的homozygote完全肥沃，而杂合子是半肥沃的[25]．这种遗传作用与显性NK-198形成对比rf1.谁的杂合子在同样的条件下具有完全的可育性，让我们推断出这一点rf1.甜菜基因资源中的等位基因在功能上已经分化[25]．分子组织的rf1.似乎显着分歧[26那28那29其中许多等位基因还没有特征;因此，其他具有不同遗传行为的等位基因是可能的。确定遗传作用差异的分子基础是评价遗传资源发现新基因的必要条件rf1.等位基因。

在目前的研究之前，十六出了六个RF-Oma1图中的副本。1不表达（orf20_{nk - 219 - 1}是一个明显的假蛋白）。这种缺乏信息促使我们调查rf1.通过完全描述所有的RF-Oma1基因在无花果。1．令我们惊讶的是，占主导地位的NK-198rf1.是由四个200 kda的生成物组成的RF-Oma1副本。这一发现使我们提出了特定的可能性RF-Oma1复制可能不是等位基因性质的决定因素，但与200-kDa复合物产生相关的mRNA总量是确定等位基因强度的关键之一。事实上，我们发现mRNA的数量与250-kDa复合物的数量呈负相关关系。mRNA的数量很好地解释了等位基因强度的差异。我们的发现意味着200-kDa生长量的增加RF-Oma1副本加强了等位基因，而非生成剂RF-Oma1复制对恢复生育力的等位基因没有任何帮助。我们建议用甜菜rf1.可能是一个复杂的位点，其作用是由聚类决定的RF-Oma1副本。

一个主要rf1.等位基因以基因剂量依赖性方式降低了250-KDA蛋白质复合物的积累

在我们的遗传分析过程中，我们检查了是否是占优势的NK-198rf1.等位基因对250-kDa蛋白复合物的量有基因剂量效应。我们用的是BC₂F₂来自TA-33BB-CMS（CMS系列）和NK-198之间的交叉（NK-198的捐赠线）衍生的人口rf1.）选择NK-198的纯合子和杂合子rf1.．虽然两种基因型都是表型难以区分，但在我们的温室中完全肥沃[25就有可能诊断出rf1.利用s17 DNA标记进行基因型[25]．nk - 198rf1.被命名为p1的特异性PCR带型识别，而rf1.来自TA-33BB-CMS（与TK-81 MM-O相同rf1.在图中。1）由P4鉴定。我们选择了NK-198的纯合子和杂合子rf1.收集它们未成熟的花药在含洋地黄素的缓冲液中制备总花药细胞蛋白，并在蓝原生(BN)聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测蛋白复合物。在250-kDa复合物信号强度可以被量化的情况下，使用抗presatp6进行免疫印迹分析;样本量、一抗血清浓度和暴露时间按[25]．与250-kDa信号频带相比rf1rf1.在同一群体中，杂合子的杂合子减少较多，但可以看到较暗的条带(图)。2一个);而纯合子的250-kDa信号带几乎不可见(图2)。2a).这种250-kDa复合物的减少不太可能是由于负载量不足或样品制备不当，因为anti-COXI检测到的另一线粒体复合物的水平在样品中具有可比性(图)。2b).这些结果表明NK-198rf1.对250-kDa复合物的积累施加基因剂量效应，尽管我们不知道这种累积效应对表型。

所有RF-Oma1册nk - 198rf1.有可能生成200kda的配合物吗

我们进一步调查了NK-198rf1.等位基因在分子水平，以确定如何施加这种对生育恢复的这种大遗传效应。根据Matsuhira等。[23), nk - 198rf1.由四组组成RF-Oma1册,orf18来orf21（以后称为orf20_{nk - 198 - 4}来orf20_{nk - 198 - 1}， 分别;见图。1）.Kitazaki等[21的翻译产品orf20_{nk - 198 - 2}（以前orf20)能与preSATP6蛋白结合，并在BN聚丙烯酰胺凝胶上生成独特的200 kda蛋白复合物;然而,其他RF-Oma1副本仍保持不协调。在这项研究中，我们调查了这三个无表情RF-Oma1副本具有产生200-KDA蛋白质复合物的相同电位orf20_{nk - 198 - 2}．三个副本中的每一个（orf20_{nk - 198 - 1}那orf20_{nk - 198 - 3},orf20_{nk - 198 - 4}）被融合到旗帜标签并由烧花菊病毒（CAMV）35s启动子在二元载体中调节。将转基因引入CMS糖甜菜悬浮液中。通过BN-PAGE分离来自转基因细胞的线粒体蛋白并用抗假释探测，以选择性地识别含有PREATP6的线粒体蛋白质复合物。如先前的研究中所见（例如，在免疫印迹上检测到涂片图像（例如[25]）。令我们惊讶的是，在所有四个样本的车道中看到了200-KDA的信号乐队RF-Oma1来自nk - 198rf1.(无花果。3.)，提示这四个序列都能产生一种与preSATP6蛋白相互作用的蛋白。

尽管Matsuhira等人[23暗示所有的RF-Oma1册nk - 198rf1.表达，4个序列产生的相对转录水平未知。对转录本丰度进行定量分析的最大障碍是四种转录本之间的高序列相似性RF-Oma1拷贝，这使我们无法设计引物对来具体量化这四种物质RF-Oma1mRNA的种类。比较这四个RF-Oma1，我们注意到小的插入/删除(indels)和几个单核苷酸多态性(SNPs)，使我们能够推断的比率RF-Oma1mRNA物种（附加文件2：图S1）。我们专注于在3'拖车中的外显子1和两个SNP中的6-BP Indel（附加文件2:图S1);indel区分了两个mRNA组(orf20_{nk - 198 - 1}/orf20_{nk - 198 - 4}和orf20_{nk - 198 - 2}/orf20_{nk - 198 - 3}），并且两个SNP区分三个mRNA组（orf20_{nk - 198 - 4}那orf20_{nk - 198 - 3},orf20_{nk - 198 - 1}/orf20_{nk - 198 - 2}）.因此，从表达NK-198的花药中获得转录组数据rf1.应该包含RF-Oma1可以分为这些组的mRNA。

一个fertility-restored公元前_6.F₁将TA-33BB-CMS与NK-198杂交后的植株自交获得NK-198rf1.纯合子，s17标记为p1p1。在进行RNA-seq分析之前，从四阶段花药中提取RNA样本。读计数汇总在附加文件中3.S2:表。我们估计了四种转录产物的比率RF-Oma1NK-198rf1.(表1）;例如，我们获得了组的转录比率，如orf20_{nk - 198 - 1}/ orf20_{nk - 198 - 4}．另一方面，比率orf20_{nk - 198 - 4}抄本中的成绩单RF-Oma1NK-198的成绩单rf1.利用3 ' UTR中的SNPs确定纯合子(表S2）.使用这些值，比率orf20_{nk - 198 - 1}计算转录物。虽然所获得的值是近似值，但最富有的成绩单可能是可能的orf20_{nk - 198 - 2}， 其次是orf20_{nk - 198 - 4}．两个低表达基因的表达水平，orf20_{nk - 198 - 1}和orf20_{nk - 198 - 3}可比。

不同起源的隐性等位基因分析

我们还检查了剩下的三个无表情RF-Oma1副本(即NK-219 mm-O副本rf1.和π615522rf1.）有可能产生200-KDA复合物。在这项研究中，我们首先选择了两条甜菜系列，PI 518644和PI 615522，具有orf20_{nk - 219 - 1}来orf20_{nk - 219 - 3}和orf20_{PI 615522}分别为(26]．PI 518644和PI 615522注册为“o型”，一种缺乏恢复等位基因但具有不育诱导线粒体的特定基因型。两条线与TA-33BB-CMS交叉。所有F.₁植物（来自TA-33BB-CMS X PI 518644和TA-33BB-CMS X PI 615522的1个）的植物是完全雄性无菌的。

的表达RF-Oma1在F.₁采用逆转录-定量PCR (RT-qPCR)对植物进行检测。从减数分裂和四分体时期的花药中提取细胞总rna。RF-Oma1由所有副本共同的引物同时检测mRNA。结果总结在表格中2．在每种基因型中的人阶段的表达水平通常高于在四个阶段。F₁表达的TA-33BB-CMS X PI 615522的植物RF-Oma1而TA-33BB-CMS x PI 518644比TA-33BB-CMS高1.8 ~ 2.6倍2）.这种差异似乎与拷贝数有关RF-Oma1在Zygote（表2）.

我们测试了是否有RF-Oma1PI 615522和PI 518644的翻译产物是200 kda的生成物。未成熟花药的细胞总蛋白₁植物受到BN-PAGE的影响。使用anti-preSATP6进行免疫印迹分析发现，两株F1植株的图像与TA-33BB-CMS相似。即使长时间暴露也没有检测到200kda信号波段(图)。4.）.

我们建造了国旗融合orf20_{nk - 219 - 1}那orf20_{nk - 219 - 2}和orf20_{PI 615522}在二元载体中由CaMV 35S启动子控制。对转基因悬浮细胞的线粒体蛋白进行免疫印迹分析，在BN-PAGE上均未见200 kda信号带(图2)。3.）.总之，没有RF-Oma1到目前为止，在隐性等位基因中发现的拷贝是200 kda的生殖力(见图。1）.

200-KDA生成mRNA数量可以解释遗传行为rf1.等位基因

检测到了RF-Oma1结果表明，两个隐性等位基因的mRNA表达量与拷贝数相关RF-Oma1,数RF-Oma1在评估rf1.力量似乎是不合适的。我们假设遗传行为rf1.等位基因依赖于RF-Oma1有可能产生200kda复合物的转录本。设计特定的引物RF-Oma1的核苷酸序列RF-Oma1图所示。1与可以生成200-KDA复合物的表格的SNP或Indels对齐以找到特定的SNP或indels（附加文件4.：图S2）。我们发现一个3-BP Indel，辨别来自月种的200-KDA生成副本，并设计了一个底漆集合专门放大200-KDA生成RF-Oma1．我们通过使用二进制向量来测试其特异性RF-Oma1作为模板。如图S3所示（附加文件5.)，在200 kda产生时出现了预期大小的PCR扩增产物RF-Oma1但不是来自非生成形式。

用这个引物，我们量化了RF-Oma1在花药中。NK-198的纯合子和杂合子rf1.被选自BC_6.F₂人口。选择NK-305的纯合子和杂合子rf1.从[25]．在这个群体中，NK-305rf1.由S17 DNA标记的特定模式[P2]标记。从减数分裂和四级的花药中萃取总细胞RNA。RT-QPCR的结果总结在表中3.．通常，两种发育阶段之间mRNA积累类似。NK-198中mRNA的量最高rf1.纯合子，其次是NK-198rf1.杂合子,nk - 305rf1.纯合子，NK-305rf1.杂合子，按这个顺序。未检测到mRNArf1rf1.使用本底漆时(表3.）.

我们寻找另一个与等位基因强度相关的值rf1.．由于技术困难，我们无法量化200 kda复合物。相反，我们专注于250-KDA信号强度减少的程度rf1.等位基因（或两个rf1.等位基因)在BN-PAGE上比较rf1rf1.（此后，我们将此值称为Δ^250kda.）.我们之前已经表明，250-KDA复合物的量的减少可能是由预先序列的高阶结构的改变引起的，因为单体PREATP6几乎不变[21]，而抗Coxi检测到的420-KDA复合物的量显然不受影响[21]．COXI多肽单体的积累在不同基因型之间似乎具有可比性[10]．对nk - 198rf1.，图中为250-kDa信号频带的信号强度。2与anti-COXI检测到的420-kDa信号频带归一化(表4.）.p1p4的信号强度比(0.17±0.02)比p4p4(1.74±0.26)降低1.57，可见Δ^250kda.通过单个NK-198rf1.是1.57。注意，p4p4和p1p1之间的差异是1.74，这是本系统检测的上限。

Arakawa等人[25]估计在NK-305的纯合子和杂合中的250-KDA复合物的积累rf1.和rf1rf1.和我们的研究过程一样。根据(25[250-KDA / 420-KDA比率为1.57±0.16和0.86±0.07rf1rf1.和NK-305杂合子，因此Δ^250kda.一个NK-305rf1.副本是0.71。NK-305的比率rf1.纯合子为0.12±0.01，与rf1rf1.δ的1.45或两次^250kda.单一NK-305rf1.．

与200 kda产生和Δ^250kda.四种基因型(即纯合型和杂合型NK-305rf1.和nk-198rf1.）.我们绘制这些数据集如图所示。5.和图S4(附加文件6.)，发现转录本积累水平与Δ呈显著正相关^250kda.．

250-kDa蛋白复合物中含有cms特异性多肽preSATP6rf1.[21]．我们对自然发生的数量方面感兴趣rf1.等位基因。等位基因差异的分子基础rf1.可能涉及多个RF-Oma1在等位基因中复制，但不是特定的复制。

这项研究的一个值得注意的发现是所有的RF-Oma1册nk - 198rf1.能够产生200kda的复合物。这一发现是出乎意料的，因为转基因表达orf20_{nk - 198 - 1}那orf20_{nk - 198 - 3}和orf20_{nk - 198 - 4}显然是男性无菌[23]．如果雄性不平症，这些不同结果之间的和解是可能的rf1.等位基因被认为是编码单一的RF-Oma1能够产生200 kda复合体，但由于产生少量mRNA，几乎不能恢复生育力[27]．这件基地，Fukkoku-Oubarf1.(见图。1)，是不可恢复的，但具有该等位基因的植株有时会发展出类似于半可育植株的花药含量(因此，我们不愿称该等位基因为隐性)，正如我们在三个转基因中看到的(我们未发表的观察)。根据Arakawa等人[27[这项研究，金额orf20_FukkokumRNA被推断为与orf20_{nk - 198 - 1}那orf20_{nk - 198 - 3}或orf20_{nk - 198 - 4}．这三个人都有可能RF-Oma1复制在功能上相当于Fukkoku oubarf1.；因此，表达这些构建体中的每个构建体的转基因仍然是雄性无菌。

我们报道过转基因甜菜表达orf20_{nk - 198 - 2}尽管该转基因来源于NK-198rf1.[23]．这结果表明了生育恢复的可能性orf20_{nk - 198 - 2}只能部分解释NK-198的力量rf1.．这一观点可能被NK-305的半可育表型所支持rf1.杂合子报告在[25，这与orf20_{nk - 198 - 2}表达基因转移。根据Arakawa等人[25]，NK-305rf1.是由orf20_{nk - 305 - 1}和orf20_{nk - 305 - 2}，其中只有前者是200 kda的生成(见图)。1）.因此，表中的数据来自基因型p2p43.可以被解释为那些来自的人orf20_{nk - 305 - 1}mRNA。基于表中的数字1，我们估计orf20_{nk - 198 - 2}表中mRNA约占p1p4的40%3.．因此，我们的结果表明orf20_{nk - 198 - 2}和orf20_{nk - 305 - 1}产生可比量的mRNA。因此，Matsuhira等人所述的转基因植物的表型。[23似乎与单个NK-305表达的表型一致rf1.[25]．总之，表达每一个单一的转基因解剖RF-Oma1从副本nk - 198rf1.验证其他遗传行为rf1.等位基因，但它们都没有复制NK-198的遗传行为rf1.．当然，我们不能排除其他可能，如转基因表达不足或背景效应涉及转基因的表型。

可能，所有四个RF-Oma1在NK-198rf1.参与生育力恢复，实现植株完全可育。在这个模型中，主恢复器是orf20_{nk - 198 - 2}，但全面修复还需要另外三个RF-Oma1拷贝提供足够量的mRNA，以减少250 kDa复合物的积累，以允许正常花粉发育的水平。该模型假定累积效果RF-Oma1这可以通过NK-305的基因剂量效应推断出来rf1.；它的纯合子比杂合子更能恢复生育能力[25]．NK-198对250 kDa复合量也有明显的基因剂量效应rf1.．这种累积效应也可以从表中看出3.．我们建议甜菜rf1.位点可能是一个复杂的位点，其等位基因以聚类组成为特征RF-Oma1副本。

力量rf1.250-kDa复合物在花药中的数量减少(即Δ^250kda.）.我们估计了δ^250kda.一个NK-198rf1.1.57(表4.），这是单个NK-305的两倍rf1.(0.71)(表4.）并且与200-KDA生成mRNA的量一致（比较基因型P1P4和表格中的P2P43.）.也许250-KDA复合物的量与数量相反RF-Oma1与200 kda产生相关的mRNA。为了支持这一假设，我们发现mRNA和Δ的数量^250kda.为正相关(图。5.）.这个剧情摆在了NK-198的概念rf1.在纯合子条件下，200 kda的生成mRNA在NK-198rf1.纯合子是杂合子的两倍3.)，其潜力为Δ^250kda.= 3.14 (2 × 1.57)，见表中基因型p1p44.）.这种潜在Δ^250kda.，但不能完全指向250-kDa复合体，因为1.74 (250-kDa积累在rf1rf1.)为上限，剩余的1.40未使用。剩余活动将需要管理，如果RF-Oma1对植物有害的一些副作用，否则这种等位基因的频率将通过计数器选择下降。虽然这个假设可能与观察结果有关，但恢复全部生育能力的基因型频率罕见在甜菜中[30.的遗传多样性特征，需要进一步研究rf1.目的是开发甜菜遗传资源，促进甜菜育种。

甜菜rf1.包括不同强度的等位基因，包括显性和半显性等位基因。占主导地位的nk - 198rf1.是由四份RF-Oma1具有产生200-kDa复合物的潜力，而半显性NK-305rf1.等位基因有一个200 kda的生殖拷贝和一个非生殖拷贝。RF-Oma1隐性等位基因的拷贝没有这种活动，但它们被转录，mRNA的量似乎依赖于复印。使用针对200-KDA生成拷贝的特异性引物组，量化mRNA。转录物丰度与由PREATP6组成的250-KDA蛋白复合物的量与CMS特异性线粒体蛋白质组成的数量相反。MRNA数量还解释了NK-198示例的不同遗传行为rf1.和nk - 305rf1.．我们提出了一个假设在哪个甜菜rf1.一个具有多个等位基因的复杂位点，其特征是由功能决定的吗RF-Oma1拷贝聚集在等位基因中。这个假设暗示了没有一个解剖RF-Oma1即使它们从强大的衍生出来，副本就足以恢复完全生育rf1.等位基因。

植物材料

甜菜(β寻常的ssp。寻常的本研究中使用或提及的线条或摘要列于表中5.．甜菜系NK-198、NK-219 mm-CMS、NK-305、TA-33BB-CMS和TA-33BB-O由日本国家农业和食品研究组织开发。NK-198和NK-305是育性恢复系[21那23那25]．TA-33BB-CMS和TA-33BB-O具有相同的核基因型，但前者和后者分别具有男性不育诱导线粒体和非诱导线粒体。的RF-Oma1这两条线的序列是相同的orf20_TK-81[24]．NK-219 mm-CMS是一个CMS线胜任农杆菌属介导的转换(31]．PI 518644和PI 615522是美国农业部开发的美国甜菜品种[26]．'fukkoku ouba'是日本叶甜菜加入[27]．通过使用纸袋如上所述的纸袋来完成十字架。26]．植物在北海道大学北方生物圈野外科学中心的温室或田野中生长。在目视检查花粉生育和分为完全正常的半肥力（花药变为橙色，但很少脱离），以及[25]．

基因分型

DNA标记s17已详细介绍[25那27那29]．通过标准CTAB的方法从绿叶中分离出总细胞DNA [32]．PCR引物核苷酸序列见表S3(附文件)7.）.

蛋白质复杂的分析

用蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE)分离花药或粗线粒体的蛋白质复合物。21]．使用了一只本网Novex Bistris凝胶系统（Thermo Fisher Scientific，Waltham，Ma，Ma）。根据制造商的说明手册，将分离的配合物涂在杂志上（GE Healthcare，Little Chalfont，英国）。原发性抗血清是反先前的[10], anti-COXI [10]和anti-FLAG(日本名古屋医学和生物实验室)。抗血清按[25]．二次抗体是HRP缀合的山羊抗小鼠IgG和HRP缀合的山羊抗兔IGG（杰克逊免疫研究，西林，PA，美国）。如前所述修改了定量条件[25]．未裁剪的图像在附加文件中提供8.．

转基因愈伤组织

类似于[24那25那27]被用来构建转基因。感兴趣的开放阅读框(Open reading frames, ORFs)是从总细胞DNA中PCR扩增出来的，如[23]并通过网关系统（Thermo Fisher Scientific）克隆到PDONR / ZEO中。使用基氏素诱变基础套件（Takara Bio，Kusatsu，Japan），通过体外诱变来融合标志标签。将所得基因转移到PMDCω中，伴网相容的二元载体[21]．通过14404的土壤杆菌将转基因引入NK-219mm-CMS愈伤组织中[31]．对于寡核苷酸引物的序列，见表S3（附加文件7.）.

反向transcription-quantitative PCR

收集减数分裂或四分体时期的花药，如[21]．用于样品制备的RneAsyplant迷你试剂盒（Qiagen，valencia，Ca，USA）和RNA酶DNA酶I（Takara Bio）。用上标III第一链合成系统（Thermo Fisher Scientific）和寡核苷酸底漆合成互补DNA。如[中所述，遵循量化转录物水平的条件25那27]．RT-qPCR引物见表S3.（附加文件8.）.

RNA-Seq

利用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)从四分体期花药中分离到细胞总RNA。RNA (2 μg)被送往日本Macrogen公司(日本京都)，然后用2100生物分析仪(安捷伦技术公司，美国加州帕洛阿尔托)进行质量检查。使用TruSeq链mRNA LT样本准备试剂盒(Illumina, San Diego, CA, USA)制备文库，并由Novaseq6000 (Illumina)对每个序列进行配对测序，每个序列为101 bp。原始序列数据用镰刀(Sickle ver.1.33) (https://github.com/najoshi/sickle.)的质量阈值为Q20，长度阈值为50 bp, FastQC ver.0.11.7 (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）， 分别。参考序列如图S2所示（附加文件2)，对应于DDBJ登录号AB646133和AB646135。使用HiSAT2 ver.2.1.0 (https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml）.使用IGV ver.2.4.13 (https://software.broadinstitute.org/software/igv/）.

本研究过程中产生或分析的所有数据均包含在本发表的文章及其补充信息文件中。序列数据存储在DDBJ序列读取归档(DRA010937)中。

CMS：

细胞质雄性不育

PPR:

戊酸肽重复

采用树脂:

Restorer-of-fertility像

CAMV：

花椰菜花叶病毒

BN-PAGE:

蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳

子:

开放阅读框架

RT-qPCR:

逆转录定量聚合酶链反应

作者表示感谢Sachiyo Ue，Chihiro Sano，以及Yohei Kanomata的优质技术援助。本研究的一部分是在北海道大学北方生物圈的现场科学中心进行。

本研究得到了日本科学院KAKENHI基金18号K05564和NARO生物技术研究推进机构(BRAIN)(创新技术发展研究计划，基金号30001A)的部分资助。TA获得JSPS青年科学家研究奖学金(16 J01146)。作者声明，资助机构在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写中没有作用。

隶属关系

1. 农业研究能力，北海道大学，Kita-9，Nishi-9，Kita-Ku，札幌，日本060-8589

   荒川Takumi Arakawa，松永Muneyuki，松井胜则，kanana Itoh, Kazuyoshi Kitazaki & Tomohiko Kubo

2. 日本岐阜县丘陵山区农业技术研究所，中津川508-0203

   Takumi Arakawa.

3. 北海道农业研究中心，国家农业和食品研究组织，新山，Memuro，Memuro，日本082-0081

   Yosuke Kuroda＆Hiroaki Matsuhira

贡献

TA和TK设计了这项研究。TA，MM和KK分析转基因悬浮细胞与旗帜融合RF-Oma1．TA定量分析了花药中的250kDa复合物和mRNArf1.等位基因。公里的分析rf1rf1.囊里。KI和KK估计了花药中mRNA的比值orf20_{nk - 198 - 1}那orf20_{nk - 198 - 2}那orf20_{nk - 198 - 3}和orf20_{nk - 198 - 4}．YK, HM, TK开发了植物材料。TA和KK写了草稿稿。TK监督了这项研究并最终定稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Tomohiko Kubo.．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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