神莲MADS-box基因家族的全基因组鉴定(gydF4y2Ba莲属椰子gydF4y2Ba)标识gydF4y2BaSEPALLATA同族体gydF4y2Ba参与花发育的基因gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

神圣的莲花(gydF4y2Ba莲属椰子gydF4y2Ba)是一种重要的多年生水生观赏植物。它的花型决定了它的园艺和观赏价值。然而，莲花发育的机制仍不清楚。MADS-box转录因子在植物发育的各个过程中起着至关重要的作用，特别是在花的器官发生和分化过程中。MADS-box转录因子调控荷花器官发生的机制尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

为了全面了解MADS-box基因在神莲发育中的功能，我们基于已有的基因组信息系统地对该基因家族成员进行了特征分析。共鉴定出44个MADS-box基因，其中16个为I型基因，28个为II型基因。系统分析了MADS-box基因的结构及其表达模式。此外，亚细胞定位分析表明，它们主要定位于细胞核，其中agydF4y2BaSepallata3.gydF4y2Ba（gydF4y2BaSEP3.gydF4y2Ba)同族体gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba被证实参与了花的器官发生。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些结果为了解荷花MADS-box基因家族及其功能提供了一些基础信息，为了解荷花器官发生机制和培育具有较高观赏价值的品种提供了依据。gydF4y2Ba

不gydF4y2BalgydF4y2BaumbonaceaegydF4y2Ba是开花植物中最小的科之一，它只包含两个物种，名为gydF4y2Ba莲属椰子gydF4y2BaGaertn。和gydF4y2Ba莲属luteagydF4y2Ba珀耳斯,分别gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．gydF4y2Ban .椰子gydF4y2Ba因其在佛教和印度教中的重要意义，在亚洲也被称为圣莲[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．此外，荷花也是一种重要的园艺植物，具有观赏、营养和药用价值[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．实际上，荷花有三大类，即花、籽、藕。荷花是东南亚重要的水生观赏植物，因其花色和形状多变，是我国十大名花之一。花的形状很大程度上是由它的四个基本组成器官，萼片，花瓣，雄蕊和心皮的排列决定的。花瓣的数量、大小和形状对花的形状有很大的影响。在莲花中，有许多过渡的花瓣形状。根据莲花的形态，莲花分为少瓣、双瓣、重瓣和全双瓣四大类[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．花瓣状是观赏植物育种中选择的关键特征之一，在此基础上，已获得了许多具有花瓣状分化的荷花品种，如雄蕊花瓣状和心皮花瓣状。这种花瓣形状的过渡特征使莲花成为研究花发育，特别是花器官发生的理想植物。gydF4y2Ba

由于花器官发生中的第一个关键转录因子(TFs)的鉴定[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，一系列控制花器官规格的转录因子被描述出来，形成了著名的经典的“ABC/DE”模型[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．A、B、C、E类基因的不同组合决定了花萼、花瓣、雄蕊、心皮和胚珠分别受A + E、A + B + E、B + C + E、C + E和D + E的控制[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．在这个模型中，一个功能基因子集由A类(gydF4y2BaApetala1 / Fruitfull.gydF4y2Ba，gydF4y2BaAP1 /富尔语gydF4y2Ba)、B类(gydF4y2BaAPETALA3 / PISTILLATAgydF4y2Ba，gydF4y2BaAP3 /πgydF4y2Ba)， C/D类(gydF4y2Ba无性生殖的/ SEEDSTICK / SHATTERPROOF1/2gydF4y2Ba，gydF4y2BaAG / STK / SHP1/2gydF4y2Ba)及E类(gydF4y2BaSEP1 / 2/3/4gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

除了推定的A类基因gydF4y2BaAPETALA2gydF4y2Ba（gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba)，所有其他已知的A、B、C和E类基因编码MADS-box蛋白[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．首字母缩写MADS box代表四个位点的首字母缩写，酵母的微染色体维持(MCM1)，酵母的AGAMOUS (AG)gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，亏损(DEF)gydF4y2Ba金鱼草majus,gydF4y2Ba血清反应因子(SRF)gydF4y2Ba智人gydF4y2Ba，所有成员在n端都包含一个保守的58-60个氨基酸的m结构域[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]．在真核生物中，MADS-box基因家族普遍用于发育控制[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]．系统发育将MADS-box基因家族划分为I型和II型两个分支，其中包含具有srf样MADS结构域或MYOCYTE ENHANCER FACTOR 2 like (MEF2-like)结构域的基因[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．I型MADS-box基因可进一步分为Mα、Mβ和Mγ，而II型MADS-box基因仅存在于植物界[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]，并进一步分类为MIKCgydF4y2Ba^cgydF4y2Ba和MIKCgydF4y2Ba^＊gydF4y2Ba基于介入（I）区域的结构分歧[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]．除了mads -结构域(M)外，mikc -型蛋白一般还包含干预(I)结构域、角蛋白样(K)结构域和C-末端(C)结构域三种共同结构域结构，它们共同与其他成分相互作用，结合CArG box，激活下游基因的表达[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

以往的研究表明，MIKC具有普遍的功能gydF4y2Ba^cgydF4y2Ba植物发育中的基因[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]．几个MIKCgydF4y2Ba^cgydF4y2Ba基因,如gydF4y2Ba无性生殖的24gydF4y2Ba（gydF4y2BaAGL24gydF4y2Ba),gydF4y2Ba短期营养阶段gydF4y2Ba（gydF4y2Ba高级副总裁gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba开花轨迹CgydF4y2Ba（gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba),gydF4y2Ba马德斯影响开花gydF4y2Ba（gydF4y2BaMAF1 / FLMgydF4y2Ba)，gydF4y2BaAGL15gydF4y2Ba和gydF4y2BaAGL18gydF4y2Ba,gydF4y2Baconstans过表达抑制因子1gydF4y2Ba（gydF4y2BaSOC1gydF4y2Ba)控制花期gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba透明TESTA16gydF4y2Ba（gydF4y2BaTT16gydF4y2Ba)基因参与种皮的色素沉着和胚胎发育[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]．gydF4y2BaAGL6gydF4y2Ba基因在花分生组织调控、花器官、种子发育以及雌雄花器官发育中发挥着多种作用[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]．其中一些还调节营养生长，如gydF4y2BaAGL12gydF4y2Ba在根系发育和开花过渡中都很重要[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba),而gydF4y2BaAGL17gydF4y2Ba-分支同源基因调控侧根的发育[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

由于MADS-box基因在植物发育特别是花器官发生中的重要作用，对其功能的研究一直是植物生物学研究的热点之一。为了实现这一目标，有必要对MADS-box基因家族进行系统的全基因组分析，这一研究已经在许多植物中广泛开展，如拟南芥[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)、大米(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba芸苔属植物拉伯gydF4y2Ba［gydF4y2Ba40gydF4y2Ba],兰花[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba],葡萄藤[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),而gydF4y2Ba罗莎中华民神gydF4y2Ba［gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．莲花的基因组最近已被测序并被释放[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，便于进一步研究基因或基因家族的功能特征。对bHLH、R2R3 MYB和GARS转录因子家族也进行了类似的研究[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]．然而，目前还没有针对荷花MADS-box基因家族的全基因组系统分析，尽管针对这一基因家族的一些特定成员的研究很少，包括荷花gydF4y2BaAPETALA1-likegydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]和其他花器官身份MADS-box基因[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]．为了更全面地了解MADS-box基因家族在荷花发育过程中的功能，特别是在控制花形方面的功能，我们对MADS-box基因进行了全基因组鉴定，并系统地分析了它们的分布、系统发育关系、基因结构、以及排列在神圣莲花“中国古董”上的表情图。在此基础上，选取了可能参与花器官形成的MADS-box基因进行进一步分析gydF4y2BaSEP3.gydF4y2Ba成熟的同源物涉及花器官规范。这些结果可能有助于进一步了解该基因家族的功能，特别是在莲花发育中。gydF4y2Ba

莲箱基因的鉴定及其在莲花基因组中的分布gydF4y2Ba

为了了解荷花MADS-box基因家族的基本情况，我们首先在荷花基因组数据库中查找MADS-box基因家族，以确定该家族的基因数量[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]．52个候选基因被注释为MADS-box基因(表SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)检索。同时，经过生物序列分析，也得到了相同数量的假定MADS-box蛋白。为了准确地确定成员，在删除与NCBI中相同序列ID对齐的候选成员(表SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，共44张gydF4y2Ban .椰子gydF4y2BaMADS-BOX基因（gydF4y2BaNnMADS1-44gydF4y2Ba通过向他们注释来证实gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaMADS-BOX基因名称[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]，其中一些包含不同的转录变体(表SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．其中部分具有节段或串联重复(表SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．他们的非同义(gydF4y2Ba卡gydF4y2Ba)和同义词(gydF4y2BaKsgydF4y2Ba)的替代率进行了分析(表SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)， Ka/Ks比值接近1。gydF4y2Ba

Lotus基因组已经被组装成巨型支架，包括9个大支架和几个小支架[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]．在所有确认的gydF4y2BaNnMADSgydF4y2Ba基因，36分布在十大最大的兆瓦多及1-10（图）gydF4y2Ba1gydF4y2Baa），剩余的8个基因锚定在其他小百万型巨大的兆瓦上（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).除了不含任何添加剂的巨蛋白3和巨蛋白7gydF4y2BaNnMADSgydF4y2Ba基因，megascaffold 2，其中最大的megascaffold (133.00 Mb)含有7gydF4y2BaNnMADSgydF4y2Ba基因;megascaffolds 1、4、5和6均有5个成员(图SgydF4y2Ba1gydF4y2Bab).类似于R2R3 MYB的分布[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]，巨魔盒中的疯子箱基因的密度不均匀。Megascosmold 4是最密集的9.24 MB / mad-box基因，而Megascosmold 1具有最小密度（51.00 mb /基因）（图SgydF4y2Ba1gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

系统发育分析gydF4y2Ban .椰子gydF4y2BaMADS-box基因gydF4y2Ba

到目前为止，已经报道和总结了34种其他植物基因组中的MADS-box基因[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]．在所有列出的植物中，荷花含有一个相对较小的MADS-box基因家族(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)，可与其他基生种比较(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).为了更全面地了解这个基因家族，研究了荷花各MADS-box基因的全长，gydF4y2Ba拟南芥,gydF4y2Ba从NCBI数据库中下载水稻进行进一步的分类和系统发育分析。根据BLASTP对TAIR数据库的分析，I型16例(其中Mα 9例，Mβ 2例，Mγ 5例)，II型28例(其中MIKC 25例)gydF4y2Ba^cgydF4y2Ba和3个MIKC*) MADS-box蛋白在荷花(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa和表SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba），所有预测的疯子箱蛋白都包含属于MIKC的不同的转录变体gydF4y2Ba^cgydF4y2Ba(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．同时，我们还利用预测的三个物种的MADS-box蛋白序列构建了系统发育树(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab). 25 MIKCgydF4y2Ba^cgydF4y2Ba类型gydF4y2BaNnMADSgydF4y2Ba基因(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab)可进一步分为12个亚科:SOC1、AGL6、A (AP1/FUL)、b (AP3/PI)、C/D (AG/STK/SHP1/2)、E (SEP)、SVP、AGL12、AGL15、AGL17、TT6 (b姐妹亚科)和FLC。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab及表SgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．然而，flc样基因在荷花中缺失。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab). b子支系包含4个成员，A和E都包含3个成员，除AGL12只有1个成员外，其余的子支系包含2个成员。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab及表SgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

基因结构及保守基序分析gydF4y2Ba

为研究荷花MADS-box基因的结构，对44个荷花MADS-box基因cDNA全长和基因组DNA序列进行了分析gydF4y2BaNnMADSgydF4y2Ba仅用NCBI数据库中获得的基因进行系统发育分析，与gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和米饭（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).这些结构gydF4y2Ba麦斯gydF4y2Ba基因间也表现出系统发育关系。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)。除了gydF4y2Bannmads3.gydF4y2Ba其他所有mikc型(II型)基因的外显子-内含子结构均大于6个外显子(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).相比之下，I型MADS-box基因几乎没有内含子，除了gydF4y2BaNnMADS28gydF4y2Ba包含一个内含子(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

利用MEME motif搜索工具，在44个荷花MADS-box蛋白中共鉴定出20个保守motif(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)。除了NNMADS43之外，图案1存在于43个成员中，其中仅包含一个基序（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)。主题2和7存在于所有MIKC中gydF4y2Ba^cgydF4y2Ba除NnMADS9缺失基序2外的MADS-box蛋白(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac). E类(NnMADS7/8)和AGL6同源(NnMADS10/11)亚家族包含motif 9，而SVP亚组(NnMADS22和NnMADS23)包含motif 10和motif 13。Motif 16被认为是典型的B类Motif(图16)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac). Motif 12和Motif 17代表B亚科NnMADS1/2/3/4的个体保存模式。此外，TT16支成员NnMADS24/25中也发现motif 17。包括NnMADS5/6在内的AG簇成员含有一个特殊的motif 20。其他MADS-box蛋白在这个亚家族中有一些特定的基序，尽管这些基序不一致。Mα型MADS-box基因的不同成员含有不同的基序数量，如NnMADS26、NnMADS28和NnMADS32/33/34含有多于3个基序，而NnMADS27和NnMADS29/30/31含有少于2个基序。Mβ和Mγ基团最多有两个基序。NnMADS39和NnMADS43含有一个非特异性基序(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

Nnmads蛋白的保守芯M区域具有〜59个氨基酸，与其他物种中的那些一致[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．M区有两种类型，分别称为type I (SRF-like)和type II (MEF-like)。为了评估NnMADS蛋白中M区域的保守性，I型和II型的成员与每种类型的代表进行比对分析gydF4y2Ba智人gydF4y2Ba，表明两种类型都高度保守，II型(MEF-like)更为保守(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

空间的表达gydF4y2BaNnMADSgydF4y2BaS在NNMADS的几个成员的花器官和亚细胞定位gydF4y2Ba

给定基因的表达可能与其功能有关。探索表达模式gydF4y2Bannmadss.gydF4y2Ba，利用前人研究的叶、叶柄、根茎(包括根尖、延伸区、节间)、根、花蕾、花瓣、雄蕊(未成熟和成熟)、心皮(未成熟和成熟)、花托(未成熟和成熟)、种子(种皮和子叶)等16个组织的转录组数据进行进一步分析[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]．这44个的数据gydF4y2Bannmadss.gydF4y2Ba提取并绘制热图，显示其表达风格(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个，表sgydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．我类型gydF4y2BaNnMADSgydF4y2Ba基因在所有组织中普遍表达低或无法检测，除了gydF4y2BaNnMADS29gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS30gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS40gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS41gydF4y2Ba,gydF4y2BaNnMADS43gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个)。两个都gydF4y2BaNnMADS29gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS30gydF4y2Ba属于Mα亚型，在不同组织中广泛表达(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个)。gydF4y2BaNnMADS40gydF4y2Ba在根、根茎和子叶中优先表达，gydF4y2BaNnMADS41gydF4y2Ba根茎是节间特有的吗gydF4y2BaNnMADS43gydF4y2Ba叶片和叶柄特异(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个)。至于II型gydF4y2BaNnMADSgydF4y2Ba基因,MIKCgydF4y2Ba^＊gydF4y2Ba亚型包含两个无处不在的表达成员和一个没有可检测的表达(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa)，而MIKCgydF4y2Ba^cgydF4y2Ba该亚型可分为花器官优先型、营养组织优先型和无所不在型三种表达模式。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).花器官优先表达基因包括gydF4y2Bannmads1.gydF4y2Ba，gydF4y2Bannmads2.gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS4-8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS10gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS11gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS16gydF4y2Ba,gydF4y2BaNnMADS17gydF4y2Ba；包括营养组织优先表达基因gydF4y2Bannmads9.gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS15gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS18gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS19gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS20gydF4y2Ba,gydF4y2BaNnMADS23gydF4y2Ba；包括普遍表达的基因gydF4y2BaNnMADS12gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS13gydF4y2Ba,gydF4y2BaNnMADS22gydF4y2Ba．具体地说,gydF4y2BaNnMADS24gydF4y2Ba和gydF4y2BaNnMADS25gydF4y2Ba仅在心皮中表达(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).由于我们更关注花的器官发生，我们进行了qRT-PCR来确认这些MIKC的积累gydF4y2Ba^cgydF4y2Ba子类型gydF4y2Ba麦斯gydF4y2Ba基因（gydF4y2BaNnMADS1-14gydF4y2Ba)，在花器官高表达(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab,表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．对比qRT-PCR和RNA-Seq数据，两者基本一致(图SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

由于蛋白质的正确定位对其功能非常重要，因此还通过烟草叶的瞬态转化来研究NNMADS蛋白的亚细胞定位。我们选择了几个代表性的疯子箱家庭成员，包括类基因（gydF4y2BaNnMADS12gydF4y2Ba)、B类基因(gydF4y2Bannmads1.gydF4y2Ba)、C类基因(gydF4y2BaNnMADSgydF4y2Ba6），E类基因（gydF4y2Bannmads7.gydF4y2Ba，gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba),gydF4y2BaAGL6gydF4y2Ba基因(gydF4y2BaNnMADS10gydF4y2Ba)，与绿色荧光蛋白(GFP)融合进行亚细胞定位分析。它们都位于核内(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．有趣的是，GFP的信号是gydF4y2Bannmads1.gydF4y2Ba也定位于细胞膜(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

过度的gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba

众所周知，每种花器官的成因是必要的，包括花瓣，雄蕊和雌蕊所必需的e-类基因[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．所有花卉器官都显示出萼片状表型gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Bae类基因三重突变gydF4y2Baspe1spe2spe3gydF4y2Ba．在四突变体中gydF4y2Baspe1spe2spe3spe4gydF4y2Ba，所有花器官都转变为叶状器官[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．在荷花中，有三个e级MADS-box基因gydF4y2Bannmads7.gydF4y2Ba，gydF4y2Bannmads8.gydF4y2Ba,gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba．根据他们的表情模式，gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba是唯一表现出花器官特异性的，因为前两者在根和根茎中均有高表达(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．因此,我们选择gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba作为拟南芥中功能验证的候选基因。的gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba在35S启动子结构驱动下转化成gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(Col-0)。共获得10个转基因株系，其中2个T3株系表现出早花表型(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).表达方式gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba然后在这两个品系中检测基因，证实过表达(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).过表达系除开花早外，还表现出叶片向花器官过渡的表型(图5)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab, c)和双雌蕊或双花的形成(图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaD-I）。gydF4y2Ba

为了探究这些表型的潜在机制，我们检查了几个关键基因的表达，包括gydF4y2BaAtLFYgydF4y2Ba，gydF4y2BaAtAP1gydF4y2Ba，gydF4y2Baatag.gydF4y2Ba,gydF4y2BaAtFTgydF4y2Ba，调节花期和花序的形成gydF4y2Ba拟南芥NnMADS14gydF4y2Ba超表达。qRT-PCR结果显示两者均有表达gydF4y2BaAtLFYgydF4y2Ba和gydF4y2BaAtAP1gydF4y2Ba随着过表达，基因显著增加gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba,而gydF4y2Baatag.gydF4y2Ba和gydF4y2BaAtFTgydF4y2Ba只有微小的表达增加(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baj)。gydF4y2Ba

的表达gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba在不同的莲花品系中gydF4y2Ba

基于表型gydF4y2Ba拟南芥NnMADS14gydF4y2Ba过度表达线，似乎该基因的表达水平与开花和花香组织呈正相关。要确认莲花中也是如此，选择了六种不同的莲花菌株来分析表达式gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba基因。这些菌株表现出不同的花期和花形(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa，b）。QRT-PCR结果表明gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba基因在所有菌株的花蕾中均有表达(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac).然而，无论是花期较长还是雌蕊花瓣较长菌株的表达量都较高(图5)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

由于MADS-box基因家族在植物花器官和果实发育中的重要作用，越来越受到科学界的关注。截至目前,gydF4y2BaMADS-boxgydF4y2Ba在超过34种不同的植物中，基因已经被系统地描述出来[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]．通过对已发布的基因组数据库的检索gydF4y2Ban .椰子gydF4y2Ba“中国古董”(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]，共检测到44个MADS-box基因，而在另一种野生莲花的基因组中只有40个MADS-box基因被注释[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]．这需要进一步改进莲花基因组数据，这可能会导致更多的发现gydF4y2Bannmadss.gydF4y2Ba．该系列的基因可以分为两种类型，具有五种子类型。这些系统发育分析gydF4y2BaNnMADSgydF4y2Ba和那些来自gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba而水稻表明，该基因家族的不同类型和亚类型的分化早于这三种不同植物的进化。这种分化可能发生在胚胎体发生的过程中，甚至更早。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).一般基生种含量较少gydF4y2BaNnMADSgydF4y2Ba基因比那些高度进化的物种要多[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，这似乎是由全基因组复制(WGD)决定的。在演化过程中，至少发生了两个WGD事件gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和米[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]，而莲花只经历了一个没有γ WGD的WGD [gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]．Ka/Ks比值接近1，表明没有发生选择突变。这些建议gydF4y2Ban .椰子gydF4y2Ba可作为研究MADS-box功能演化的基础植物模型。gydF4y2Ba

与含有丰富转录变异的II型基因不同，所有I型基因都属于单系谱系，这与被子植物中I型基因的生、死进化率高于II型基因的假说是一致的[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]．大多数I型基因结构简单，只有一个外显子。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，类似于大米，葡萄，和gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]．相比之下，II型MADS-box基因的结构更为复杂，有几个基因包含超过10个外显子(图5)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．II型MADS-box的蛋白结构也比i型复杂。综合起来，II型MADS-box基因可能受到更复杂的调控。与之前的报告一样，它也表明，对于植物来说，II型基因可能在功能上比I型基因更重要，尽管一些I型基因也被证明在植物繁殖中发挥了重要的调节作用[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

在II型基因中，MIKCgydF4y2Ba^cgydF4y2Ba亚型最闻名于其植物特异性和对花心组织的重要性。系统发育分析表明该亚型的基因可以进一步分为12个枝条（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab)，荷花和水稻中都没有FLC支系。大家都知道gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba基因通过控制春化和非春化途径来调节开花时间[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]．似乎FLC支系在水稻、棉花和兰花等不需要春化才能开花的植物中不存在[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]．这说明荷花不需要春化才能开花。gydF4y2Ba

至少14gydF4y2Bannmadss.gydF4y2Ba属于植物中著名的经典' ABCDE '模式基因[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，包括A类(AP1/FUL)、B类(AP3/PI)、C/D类(AG/STK/SHP1/2)和E类(SEP1/2/3/4) [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．大多数‘ABCDE’模式基因表现出花器官优先表达模式(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，表明了它们在莲花器官发生中的潜在作用。A、B、C/D和E类基因的代表性成员的亚细胞定位验证了其核定位(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．因为E类基因对基于ABCDE模型的每个花器官的发育都很重要，ABCDE模型是其在荷花中的同源基因之一gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba中选择进行功能表征gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，证明了其在花器官发生中的重要性。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．结果表明gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba功能主要通过调节表达gydF4y2BaLFYgydF4y2Ba和gydF4y2BaAP1gydF4y2Ba基因。虽然莲藕还没有稳定的转化系统，表达出来gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba结果表明，该基因与荷花的开花时间和花器官发生高度相关。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．类似的功能gydF4y2Ba9月gydF4y2Ba花器官形成中的类似基因也在许多其他植物中被证实，如gydF4y2Ba蝴蝶兰属gydF4y2Ba兰花,gydF4y2Ba李属却已,gydF4y2Ba和大豆[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]．在草莓(从花萼发育而来)中，SEP1/2 homolog FaMADS9在花萼发育和调控成熟程序中起着重要作用[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

总之，基因组搜索鉴定了莲花基因组中共44个疯子箱基因。系统发育分析显示了疯箱基因家族的潜在分歧时间，缺乏gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba不需要春化作用的植物的枝类。对其表达模式和亚细胞定位的系统分析显示了一些潜在的可能gydF4y2BaNnMADSgydF4y2Ba参与花器官发生的基因。其中，功能同系物有gydF4y2BaSEPS.gydF4y2Ba基因gydF4y2BaNnMADS14gydF4y2Ba经过验证gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在不同的荷花种质中，其表达量在开花时间和花形上存在明显差异。对荷花MADS-box基因家族的全面了解有助于进一步了解其花器官发育的机制，为高价值观赏荷花的育种提供依据。gydF4y2Ba

植物材料，RNA提取，cDNA合成gydF4y2Ba

莲属椰子gydF4y2Ba“中国古董”品种(黄国政教授命名)由作者在中国武汉(30°32′45″N114°24′52″E)实验池中种植，与测序结果一致[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]，已在中国科学院武汉植物园栽培数十年。在7月10:00前采集16个组织，包括叶片、叶柄、根茎(包括根尖、延伸区和节间)、根、花蕾、花瓣、雄蕊(未成熟和成熟)、心皮(未成熟和成熟)、花托(未成熟和成熟)、种子(种皮和子叶)。采集样品不需要获得任何权威机构的许可。所有样品采集后立即用液氮冷冻，然后保存在−80℃冰箱中，用于RNA提取。gydF4y2Ba

使用RNA试剂(OminiPlant RNA Kit, CWBIO, China)提取总RNA。提取过程中，用RNase-free DNase I (Thermo, Shanghai, China)去除基因组DNA。用HiScript II一步RT-PCR试剂盒(Vazyme，中国)对rna进行逆转录，根据试剂盒的说明合成互补dna (cdna)。gydF4y2Ba

荷花MADS-box家族基因的数据库检索与鉴定gydF4y2Ba

MADS-box蛋白序列gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，而稻米则从香港湿地公园(gydF4y2Bahttp://www.arabidopsis.org/gydF4y2Ba)及水稻基因组注释计划(gydF4y2Bahttp://rice.plantbiology.msu.edu/gydF4y2Ba),分别。gydF4y2BaNgydF4y2Ba．gydF4y2Ba椰子gydF4y2BaMADS-box蛋白序列来源于lotus数据库(gydF4y2Bahttp://lotus-db.wbgcas.cn/gydF4y2Ba)，在NCBI中接种，获得全长CDS和基因组序列。确认和鉴定假定的事物gydF4y2Ban .椰子gydF4y2BaMADS-box基因，SRF-TF域(PF00319)从Pfam 31.0 (gydF4y2Bahttp://pfam.xfam.org/gydF4y2Ba)针对隐马尔可夫模型(HMM，gydF4y2Bahttps://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmergydF4y2Ba)．详细信息见表SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba．本研究中使用的其他物种的疯子盒序列是从之前的研究中获得的[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]．利用NCBI()分类工具构建了这些物种之间的进化关系。gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/CommonTree/wwwcmt.cgigydF4y2Ba)，下载菲利普树格式。然后，由phlip软件版本3.695 (gydF4y2Bahttp://evolution.genetics.washington.edu/phylip/getme-new1.htmlgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

物理图构建与系统发育分析gydF4y2Ba

使用开放访问软件Mapchart (v2.3.2)分析gydF4y2BaMADS-boxgydF4y2Ba荷花基因组中的基因，特别是在十大巨型咖啡因中[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]．多个序列使用默认参数由MUSCLE对齐[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]．利用MEGA7.026算法构建系统发育树[gydF4y2Ba68gydF4y2BaJones-taylor-thomton (Jtt)模型。采用bootstrap方法进行1000个重复的系统发育试验。使用成对删除选项设置间隙和缺失数据处理，以验证产生NJ树拓扑的异化区域。gydF4y2Ba

分析gydF4y2BaMADS-boxgydF4y2Ba基因的结构和复制gydF4y2Ba

lotus MADS-box家族蛋白序列采用MEME软件版本5.0.1 (gydF4y2Bahttp://meme-suite.org/doc/cite.htmlgydF4y2Ba)[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]．参数设置为:重复次数任意，最大图案数= 20,6≤宽度≤200。智能工具(gydF4y2Bahttp://smart.embl-heidelberg.de/gydF4y2Ba)来确认模因母题。ClustalX软件和CLC Sequence Viewer 8.0.0软件(gydF4y2Bahttps://www.qiagenbioinformatics.com/products/ clc-sequence-viewer-direct-download /gydF4y2Ba用来进行多个序列比对，并产生图像。使用基因结构显示服务器工具（gydF4y2Bahttp://gsds.cbi.pku.edu.cngydF4y2Ba)，通过将CDSs定位到基因组序列(无UTR)进行外显子/内含子基因结构分析。主要标准分析的潜在基因重复情况如下:(1)序列比对长度超过75%的基因，(2)比对一致性超过75% [gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]．的值gydF4y2Ba卡gydF4y2Ba和gydF4y2BaKsgydF4y2Ba使用TBtools (gydF4y2Bahttps://github.com/CJ-Chen/TBtoolsgydF4y2Ba)[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

表达分析使用gydF4y2Ban .椰子gydF4y2BaRNA-seq数据gydF4y2Ba

的表达式轮廓gydF4y2Ban .椰子gydF4y2BaMADS-box基因、RNA-seq数据从NCBI SRA (PRJNA492157、PRJNA503979、PRJNA428028)和lotus数据库(gydF4y2Bahttp://lotus-db.wbgcas.cn/gydF4y2Ba)，然后用于分析。通过FPKM(外显子模型每千碱基对应的片段数/百万reads)的计算，可以得到16个组织，包括叶片、叶柄、顶端、伸长区、节间、根、花芽、花瓣、未成熟花药、成熟花药、未成熟心皮、成熟心皮、未成熟花托、成熟花托、种皮和子叶(图SgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．采用Mev软件4.9.0版本生成表达热图gydF4y2BaNnMADSgydF4y2Ba基因。gydF4y2Ba

实时荧光定量PCR分析基因表达gydF4y2Ba

从荷花MADS-box家族中筛选出了同源的经典ABC(D) E模式基因作为候选基因。选取14个MADS-box基因对不同组织的转录水平进行量化。Actin作为内对照。引物集列于表SgydF4y2Ba6gydF4y2Ba．qRT-PCR反应使用SYBR Green Master Mix (BioRad，gydF4y2Bahttp://www.bio-rad.com/gydF4y2Ba)。[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]．分析3个生物重复，每个重复有3个技术重复。用2计算相对基因表达量gydF4y2Ba^{−gydF4y2Ba△gydF4y2Ba△gydF4y2BaCtgydF4y2Ba}比较阈值循环（CT）方法[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]．数据以均数±标准差表示。gydF4y2Ba

转基因和亚细胞定位分析gydF4y2Ba

从dna中扩增出候选MADS-box家族成员编码域序列(CDS)gydF4y2Ban .椰子gydF4y2Ba用高保真耐高温DNA聚合酶通过PCR检测cDNA。这些基因的引物采用Primer Premier 5.0设计。PCR产物克隆到pMD®18-T载体(TaKaRa)中。测序时，将PCR产物克隆到载体中，转化DH5αgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞。对于尼科尼亚转型，它们被克隆到与GFP融合的PMDC83向量中，并由CAMV 35S启动子驱动。引物列于表s中gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．分离重组质粒并根据火花等人描述的方案转化烟叶。［gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]．渗透后，植株生长2 ~ 3天，在共聚焦显微镜(徕卡)上观察转化的叶片。采用DAPI染色液(Beyotime)对细胞核进行染色。gydF4y2Ba

对于转基因分析，构建35S::gydF4y2BaNnSEP3gydF4y2Ba-GFP转化为gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba（col-0）使用gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba-介导花浸法[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在22°C和16小时/8小时(光/暗)光周期的生长室内培养。利用T3纯合子转基因株系进行进一步研究。gydF4y2Ba

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。gydF4y2Ba

AG:gydF4y2Ba

无性生殖的gydF4y2Ba

记者:gydF4y2Ba

ApetalagydF4y2Ba

cd:gydF4y2Ba

编码域序列gydF4y2Ba

DEF:gydF4y2Ba

DeficiensgydF4y2Ba

Ct:gydF4y2Ba

阈值周期gydF4y2Ba

FLC：gydF4y2Ba

开花轨迹gydF4y2Ba

FPKM:gydF4y2Ba

每千碱基外显子模型每百万次读取的片段gydF4y2Ba

富尔语:gydF4y2Ba

富有成果的gydF4y2Ba

麦斯:gydF4y2Ba

MCM1, AG, DEF和SRFgydF4y2Ba

MAF1 / FLM:gydF4y2Ba

马德斯影响开花gydF4y2Ba

MCM1:gydF4y2Ba

Minichromosome物业管理费gydF4y2Ba

MEF:gydF4y2Ba

肌细胞增强剂因子gydF4y2Ba

NnMADSgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

莲属椰子gydF4y2Ba麦斯gydF4y2Ba

PI:gydF4y2Ba

Pisittala.gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

九月：gydF4y2Ba

SepallatagydF4y2Ba

轴马力:gydF4y2Ba

防摔gydF4y2Ba

SOC:gydF4y2Ba

抑制constans的过表达gydF4y2Ba

SRF：gydF4y2Ba

血清反应因子gydF4y2Ba

Stk：gydF4y2Ba

SeedstickgydF4y2Ba

副总裁:gydF4y2Ba

营养期短gydF4y2Ba

TT16:gydF4y2Ba

透明testa16gydF4y2Ba

WGD：gydF4y2Ba

全基因组重复gydF4y2Ba

我们欣赏武汉植物园，CAS的仙鹏杨博士，以及遗传和开发生物学研究所，CAS博士，依靠本研究中使用的载体。gydF4y2Ba

这项研究没有资金支持。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 湖北大学生命科学学院，生物催化与酶工程国家重点实验室，武汉，430062gydF4y2Ba

   林仲元，杨平芳，林仲元gydF4y2Ba

2. 闽江大学海洋学研究所，福州，350108gydF4y2Ba

   林中原曹丁丁gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

Z. L.和P. Y.设计实验并撰写论文，Z. L.和D.进行实验，Z. L.和R. N.分析数据。所有作者均已阅读并批准稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba巴航杨gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料包括在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用线中另有说明。如果材料没有包含在文章的创作共用许可证中，而您的预期使用不被法律法规允许或超过允许的使用，您将需要直接获得版权持有人的许可。如欲浏览本许可证的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．“创作共用公共领域”豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba