转录组和功能分析揭示了辣椒斑块病毒感染期间自噬的抗病毒作用GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

辣椒轻度斑驳病毒（PMMoV）是辣椒属的一个成员GydF4y2Ba烟草病毒GydF4y2Ba并主要感染溶于溶铀植物。然而，病毒 - 宿主相互作用的机制仍不清楚。为了探讨辣椒植物对PMMOV感染的反应，我们使用高通量RNA测序方法分析PMMOV感染后辣椒植物的转录组变化，并探讨了宿主自噬在调节PMMOV感染中的作用。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

PMMoV感染后共获得197个差异表达基因（DEGs），其中172个显著上调基因和25个下调基因。基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径分析表明，大多数上调的DEGs参与植物的非生物和生物胁迫。进一步的分析显示了多重GydF4y2Baautophagy-related基因GydF4y2Ba(GydF4y2BaATGGydF4y2BaPMMOV感染辣椒和GydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州GydF4y2Ba植物。通过共聚焦显微镜和透射电镜，我们发现植物感染PMMoV可以诱导自噬，证据是GFP-ATG8a荧光斑点增多，细胞中出现双膜自噬结构GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba．此外，通过自噬抑制剂(3-MA和E64d)处理和沉默PMMoV，抑制自噬显著增加了PMMoV RNA的积累，加重了全身PMMoV症状GydF4y2BaNbATG公司GydF4y2BaA的表达式GydF4y2Ba烟草响尾病毒GydF4y2Ba-诱导基因沉默试验。这些结果表明，自噬在植物抗PMMoV侵染中起着积极的作用。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

综上所述，我们的研究结果提供了一个转录组学视角来研究辣椒对PMMoV感染的反应，并揭示了PMMoV感染诱导的自噬在调节PMMoV感染中具有抗病毒作用。这些结果也有助于我们更好地理解植物中PMMoV感染的控制机制，并为抗病作物育种项目制定更好的策略。GydF4y2Ba

胡椒 （GydF4y2BaCapsicum Annuum.GydF4y2BaL.）是一个索甘菊蔬菜作物，全球拥有巨大的经济价值[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba］．众所周知，辣椒易受真菌，细菌和病毒病原体。例如，病毒感染可能会导致诸如领域和保护性培养条件下的严重辣椒产量和质量减少[GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba］．迄今为止，据报道，据报道约13种植物病毒在全世界感染辣椒作物[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]. 在这些已知的植物病毒中，辣椒轻度斑驳病毒（PMMoV）具有传染性强、在土壤中长期存在的特点，对辣椒生产造成了极大的威胁[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

PMMoV是一种阳性的单链RNA（+ssRNA）病毒GydF4y2Ba烟草病毒GydF4y2Ba家庭的GydF4y2Ba野百合科GydF4y2Ba[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．PMMoV的基因组,它包含m7GpppG帽结构在5 '端和3 '端可以并入tRNA结构,包括6356 - 6357核苷酸(nt)并将至少有四个蛋白质编码:126 kda (p126)和183 - kda (p183) replication-associated蛋白质共享相同的起始密码子,运动蛋白(MP)和外套蛋白(CP) [GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．PMMOV感染最初导致轻度叶状物质症状，然后是叶子和水果的斑点和畸形，导致辣椒产量和现金值的显着损失[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．此外，PMMOV感染导致一些人类临床疾病，如发烧，腹痛和瘙痒[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba］．本研究旨在确定调控辣椒中PMMoV感染的宿主因子，可用于制定有效的PMMoV控制策略。GydF4y2Ba

植物病毒侵染是一个复杂的过程，涉及到病毒与寄主植物之间许多尚未阐明的相互作用。有报道称，在病毒初始入侵时，宿主植物可以激活信号级联识别入侵病毒，在病毒感染时，宿主可以改变各种代谢、信号转导和/或蛋白合成相关基因的表达，抑制病毒进一步复制和扩散[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]. 我们推测，能够调控寄主-病原相互作用的寄主因子的鉴定将有助于深入了解控制寄主对病毒感染的防御反应的机制，并为今后的抗病育种提供重要的分子标记[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]. 由于宿主-病毒相互作用复杂，涉及许多生理过程，转录组学分析在这类研究中变得越来越重要[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］．RNA测序(RNA-seq)是识别在非生物和生物胁迫中表达可能发生改变的基因的一种强有力的技术。例如，RNA-seq已被用于研究植物对各种胁迫(包括病毒感染)的防御反应的整体基因表达谱和信号转导途径[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．胡椒的基因组最近已被完全测序[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]. 这一有价值的资源使我们能够研究辣椒PMMoV感染过程中转录组的变化。GydF4y2Ba

自噬是真核生物中一种进化保守的细胞内降解途径。它可以运输细胞质成分，包括蛋白质和功能失调的细胞器，到溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)进行降解[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］．据报道，自噬可以稳定细胞和器官，调节程序性细胞死亡(PCD) [GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]，并控制植物的发育、再生、衰老和其他生物过程，以及对非生物胁迫的响应[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]. 自噬还可以在植物对病原体的初始反应过程中引起超敏反应（HR）介导的细胞死亡，并限制PCD在初始感染部位以外的传播[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba］．此外，自噬被认为通过不同的机制参与植物对病毒感染的防御。例如，BRCA1基因邻居1 (Neighbor of BRCA1 gene 1, NBR1)介导的选择性自噬途径可以通过与病毒衣壳蛋白和病毒颗粒结合抑制花椰菜花叶病毒(CaMV)感染[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]. 自噬可靶向棉花曲叶木尔坦病毒（CLCuMuV）毒力因子βC1降解[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba[ClcumuvβC1蛋白质通过破坏与甘油醛-3-磷酸脱氢酶的自噬相关基因3（ATG3）的相互作用诱导自噬诱导自噬GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在植物RNA病毒感染过程中，自噬也具有抗病毒的作用。以芜菁花叶病毒(TuMV)的侵染为例GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba和GydF4y2Ba尼古利亚娜·宾夕法尼亚州GydF4y2Ba植物可以通过NBR1依赖性选择性自噬抑制[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]. 此外，核心自噬蛋白Beclin1已被证明与TuMV核包涵体b蛋白（NIb）相互作用，抑制其聚合酶活性，并通过与ATG8a相互作用将该病毒蛋白招募到自噬体中进行降解[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］．与此同时，植物病毒也可以操纵自噬来抵御植物的防御。例如，大麦条纹花叶病毒(BSMV) γb蛋白可以削弱ATG7-ATG8相互作用，干扰自噬介导的抗病毒防御[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba］．因此，我们认为病毒和植物自噬之间的军备竞赛可以显著影响植物对病毒感染的防御。迄今为止，尚无关于PMMoV与其宿主自噬相互作用的研究发表。GydF4y2Ba

在本研究中，我们研究了使用RNA-SEQ技术的PMMOV感染期间基因表达的全局变化，并证明了自噬在植物反应对PMMOV感染的抗病毒力作用。我们的结果为PMMOV感染在辣椒中的RNA转录的全球性观点提供了新的见解，以及宿主自噬的抗PMMOV作用。GydF4y2Ba

PMMoV侵染辣椒植株的病害症状GydF4y2Ba

用PMMoV-HLD分离物接种辣椒幼苗。与模拟接种的对照植株相比，接种pmmo的辣椒植株在接种9天后出现叶面褪绿和变形(dpi)(图1)。GydF4y2Ba1.GydF4y2Baa).使用PMMoV CP基因特异性引物，通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实有症状的植株感染PMMoV(图1)。GydF4y2Ba1.GydF4y2Bab)。GydF4y2Ba

RNA-SEQ分析GydF4y2Ba

为了探讨PMMOV感染对辣椒植物中的全球基因表达变化，我们从三个PMMov感染和三种嘲弄的对照辣椒叶样品构建了6种文库，并通过RNA-SEQ分析了它们。从这些文库中获得总计81.38 GB的原始读数（即89,803,414; 92,455,590和86,583,222，从三个PMMov感染的文库中清洁，93,118,712; 95,261,864和87,522,578来自三种嘲弄地接种的图书馆，表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．在这些读取中，分别映射到胡椒基因组的读数的百分比分别超过82.33％（PMMoV感染的文库）和83.28％（嘲弄接种的文库）（表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．对于每个库，超过94.20％的清洁读数在Q30的质量分数（基本呼叫的0.1％误差概率）。此外，所获得的读数的GC含量为43.57至44.07％（表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

鉴定PMMOV感染辣椒植物中的差异表达基因（DEGS）GydF4y2Ba

为了鉴定在辣椒PMMoV感染过程中发挥重要作用的基因，我们分析了这6个文库的转录组谱，并将每个基因的表达水平表示为FPKM(附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．使用FDR <0.05的意义标准，在PMMov感染的文库中鉴定了197只DEG。GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba(FC) |≥1。这些deg包括172个上调基因和25个下调基因。GydF4y2Ba1.GydF4y2Bac、 d和附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．转录组谱和层次聚类概述如图所示。GydF4y2Ba1.GydF4y2Bae） 是的。GydF4y2Ba

DEGS功能性富集分析GydF4y2Ba

为了阐明DEGS的主要功能，进行了基因本体（GO）分析（附加文件GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba). 然后用最重要的GO项对DEGs和GO项（FDR）的功能进行聚类 < （图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba一种）。在此结果的基础上，生物过程类别中的大多数富集的术语涉及非生物和生物应激的反应（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba文件和附加文件GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)．在细胞组分类别中，膜和叶绿体相关氧化石墨烯项是最主要的项。在分子功能类别中，富含蛋白激酶活性的GO项(图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba文件和附加文件GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

为了进一步描述Degs的分子和生物学功能，使用基因和基因组（Kegg）数据库的Kyoto细胞。我们的结果表明，DEGS集中在61 kegg路径中（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．其中，有6种途径显著富集GydF4y2BaPGydF4y2Ba-价值< 0.05（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Bab和附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．显著富集的二烷基糖苷是参与‘二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素生物合成’的二烷基糖苷(ko00945);“phenylpropanoid生物合成”(ko00940);‘角质、琥珀酸和蜡的生物合成’(ko00073);类黄酮生物合成的(ko000941);“苯丙氨酸代谢”(ko00360);以及“不饱和脂肪酸的生物合成”(ko01040)。通过对KEGG通路的富集分析，发现大部分DEGs与次生代谢产物生物合成和氨基酸代谢有关。这一发现进一步表明，PMMoV在辣椒植株中侵染可显著激活或失活参与多种次生代谢途径的基因的表达。我们推测通过这些途径产生的次生代谢物可能会增强植物对各种胁迫条件的响应GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

RNA-seq数据验证GydF4y2Ba

为了验证RNA-SEQ结果，选择与植物防御反应相关的12次，并通过RT-QPCR对其表达进行测试。这些分析的基因是：GydF4y2BaE3泛素蛋白连接酶PUB24GydF4y2Ba(GydF4y2Ba卡布24GydF4y2Ba)，GydF4y2Ba抗病蛋白RPP13GydF4y2Ba(GydF4y2BaCARPP13GydF4y2Ba)，GydF4y2BaWRKY转录因子50GydF4y2Ba(GydF4y2BaCawrky50GydF4y2Ba)，GydF4y2Ba环h2指状蛋白ATL40GydF4y2Ba(GydF4y2BaCAATL40GydF4y2Ba)，GydF4y2Ba质脂相关蛋白11GydF4y2Ba(GydF4y2BaCAPAP11GydF4y2Ba)，GydF4y2BaUDP葡萄糖6-脱氢酶3GydF4y2Ba(GydF4y2BaCaUGD13GydF4y2Ba)，GydF4y2Ba果酸淀粉酶抑制剂20.GydF4y2Ba(GydF4y2BaCapei20.GydF4y2Ba)，GydF4y2Bag型凝集素s受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RLK1GydF4y2Ba(GydF4y2BaCarlk1.GydF4y2Ba)，GydF4y2Ba致病相关蛋白STH-2GydF4y2Ba(GydF4y2BaCaSTH2GydF4y2Ba)，GydF4y2Ba含蛋白21的U盒结构域GydF4y2Ba(GydF4y2BaCaUB21GydF4y2Ba)，GydF4y2Ba丝氨酸羧肽酶II-3GydF4y2Ba(GydF4y2BaCaSCP3GydF4y2Ba)以及GydF4y2BaLRR受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶GSO1GydF4y2Ba(GydF4y2BaCaGSO1GydF4y2Ba)．结果表明表达了GydF4y2Ba卡布24GydF4y2Ba,GydF4y2BaCARPP13GydF4y2Ba,GydF4y2BaCawrky50GydF4y2Ba,GydF4y2BaCAATL40GydF4y2Ba,GydF4y2BaCarlk1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaCaSTH2GydF4y2Ba,GydF4y2BaCaUB21GydF4y2Ba和GydF4y2BaCaGSO1GydF4y2Ba确实诱导PMMOV感染，而表达GydF4y2BaCAPAP11GydF4y2Ba,GydF4y2BaCaUGD3号机组GydF4y2Ba,GydF4y2BaCapei20.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCaSCP3GydF4y2Ba下调，与转录组数据一致(图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Bac和附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

PMMoV感染可诱导细胞自噬GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba植物GydF4y2Ba

上述RNA-SEQ结果也表明了几个累积GydF4y2BaATGGydF4y2BaS对PMMOV感染的上调（附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)．这一发现鼓励我们研究自噬是否参与了PMMoV感染的防御反应。在本研究中，我们选择PMMoV和GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba，作为我们的测试模型。我们的病毒接种和RT-qPCR检测显示GydF4y2BaNbATG3公司GydF4y2Ba,GydF4y2BaNbATG5公司GydF4y2Ba,GydF4y2Banbbeclin1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaNbATG8a型GydF4y2Ba和GydF4y2BaNbATG8f公司GydF4y2Ba在PMMoV-inoculatedGydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba叶片在5 dpi下显着上调（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。在PMMov接种的系统叶片中也发现了类似的结果GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba10 dpi下的植物（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab） 是的。然后我们分析了PMMoV感染对自噬的影响，通过GFP:NbATG8a融合蛋白在PMMoV感染和未感染的细胞中的瞬时表达GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba树叶。与未感染者相比GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba叶片中，与自噬前体或自噬体结构相似的绿色荧光斑点数增加了2倍以上GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba叶子(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac, d).在pmmov感染中始终检测到高水平的ATG8蛋白GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba植物的免疫印迹。ATG8向ATG8-PE的转化通常被认为是自噬的可靠指标。在5和10dpi时，感染PMMoV后，ATG8-PE的积累水平显著增加GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba免疫印迹测定的植物（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bae） 是的。透射电子显微镜（TEM）结果表明PMMOV感染GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba与未感染的植物相比，植物在叶细胞中诱导了大量的自噬结构GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba叶细胞(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baf、 g）。综上所述，这些结果表明PMMoV感染可以诱导细胞自噬GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba植物。GydF4y2Ba

抑制自噬可以增加PMMOV RNA积累GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba

为了研究自噬在PMMoV感染中的作用，GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba植物首先接种PMMoV或只接种磷酸盐缓冲液（Mock）。取样前，用自噬抑制剂处理每种受试植物接种叶片上方的第二片叶片。在1dpi、3dpi或5dpi时，收获抑制剂处理的叶片，然后通过westernblot分析NbATG8的积累。以DMSO处理的植株叶片为对照。我们的结果表明，3-MA处理后，NbATG8的积累水平显著降低（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种）。相比之下，与DMSO处理的植物叶子中的e64D处理显着增加了NBATG8的水平（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa).然后，我们通过RT-qPCR分析了3-MA-、E64d-或dmso处理的植物叶片中PMMoV RNA的积累。我们的结果显示，3- ma -或e64d处理的植株在3和5 dpi时PMMoV RNA水平显著升高(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab），表明抑制自噬可以增加对PMMOV感染的植物易感性。GydF4y2Ba

击倒GydF4y2BaNbATG3公司GydF4y2Ba,GydF4y2BaNbATG5公司GydF4y2Ba,GydF4y2Banbbeclin1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaNbATG7公司GydF4y2Ba或者GydF4y2BaNbATG8a型GydF4y2Ba表达促进PMMOV感染GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba

已知自噬在植物中发挥抗病毒作用[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］．为了进一步研究自噬对PMMoV感染的影响，我们沉默了GydF4y2BaNbATG3公司GydF4y2Ba,GydF4y2BaNbATG5公司GydF4y2Ba,GydF4y2Banbbeclin1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaNbATG7公司GydF4y2Ba和GydF4y2BaNbATG8a型GydF4y2Ba表达式中GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba使用基于特定TRV的VIGS载体的植物个体。用携带205的TRV载体接种的植物 以bp-GFP基因插入为对照。10点 接种PMMoV侵染的粗叶提取物后第3天和第4天，接种于每株植株的第3和第4片叶片上。7点以后 接种PMMoV后的第天GydF4y2BaNbATG3公司GydF4y2Ba- ，GydF4y2BaNbATG5公司GydF4y2Ba- ，GydF4y2Banbbeclin1.GydF4y2Ba- ，GydF4y2BaNbATG7公司GydF4y2Ba-或者GydF4y2BaNbATG8a型GydF4y2Ba-沉默植株的系统叶片PMMoV症状明显强于非沉默对照植株(图1)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba此外，基因沉默植株的PMMoV系统症状比非沉默植株出现得更快(图1)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bac).通过RT-qPCR，分别测定了7 dpi时获得的每个检测植株的第1和第2系统叶组织中每个靶基因的沉默效率和PMMoV RNA的积累(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bad和附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．结果表明，这些基因被敲除GydF4y2BaATGGydF4y2Ba基因表达单独增强PMMOV积累，特别是在GydF4y2Banbbeclin1.GydF4y2Ba沉默植物(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bad） 进一步支持自噬在植物抗PMMoV感染中发挥重要作用的观点。GydF4y2Ba

PMMOV感染是辣椒产业的巨大威胁。因此，有效控制策略的发展对辣椒农民至关重要。众所周知，植物中成功的病毒感染取决于病毒和宿主植物之间的ARM种族的结果，而自噬在ARM比赛中起着至关重要的作用[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba31GydF4y2Ba,GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．迄今为止，PMMOV如何调制宿主自噬尚不清楚。自转录组测序的第一个报告以来，RNA-SEQ技术已经严重且成功地用于探讨参与病毒和宿主植物之间相互作用的宿主基因[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba,GydF4y2Ba34GydF4y2Ba,GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

通过转录组测序，获得了PMMoV侵染后辣椒植株整体基因表达变化的详细信息。通过对这些RNA序列数据的综合分析，我们确定了197个DEG（图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Bac） 与不同的调控途径有关。我们推测一些或许多DEGs与宿主防御反应有关，在辣椒对PMMoV感染的反应中起重要作用。例如，通过GO和KEGG途径分析，在PMMoV感染时诱导了多个胁迫响应基因或与植物-病原相互作用途径相关的基因（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)．DEG诱导级联可能导致辣椒植株与PMMoV之间不相容的相互作用GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)，导致轻度PMMoV症状(图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Baa).这些被鉴定的DEGs大多与激酶信号转导、转录因子(transcription factors, TFs)和防御反应基因相关。宿主防御应答基因的激活可导致抗菌次生代谢产物的产生，从而抑制PMMoV在辣椒植株中的进一步传播。GydF4y2Ba

病毒诱导病原相关分子模式（PAMP）触发的免疫在植物对病毒感染的免疫中起着重要作用[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．植物PUB24可以与PUB22和PUB23协同作用，作为PTI对几种PAMPs反应的负调控因子[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］．因为GydF4y2Ba卡布24GydF4y2Ba在辣椒中感染PMMoV后诱导（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba和附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)，我们假设归纳GydF4y2Ba卡布24GydF4y2Ba表达可降低PTI反应和防御反应。受体样蛋白激酶(RLKs)和受体样蛋白(RLPs)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员，已知参与感知外部信号[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba,GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］．在这项研究中，表达水平GydF4y2BaCarlk1.GydF4y2Ba在感染PMMoV后显著上调(图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba和附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．PMMoV感染后，富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat, LRR)受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶GSO1也被上调。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba和附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．病因相关（PR）蛋白质是众所周知的植物防御蛋白，免受生物和/或非生物胁迫，特别是病原体感染[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba］．在这项工作中，我们发现了GydF4y2BaPR.GydF4y2Ba基因：烟草中PMMOV感染后，烟草叶片病毒（TMV）抗性蛋白基因和三种抗病蛋白基因（附加档案GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba). 尽管GydF4y2BaCaSTH2GydF4y2Ba在PMMOV感染时诱导（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba和附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba），前面的研究表明，转基因马铃薯植物中的STH2的过表达不会影响马铃薯病毒X感染[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]，建议GydF4y2BaCaSTH2GydF4y2Ba可能对辣椒植株抗PMMoV感染没有直接作用。植物抗病蛋白可与病原产生的特异性致病性蛋白间接相互作用。与其他抗性蛋白相比，RPP13不需要水杨酸积累，并且独立于ESD1和NSD1这两种独立的信号通路发挥作用，ESD1和NSD1是导致基因对基因抗性的两种独立信号通路GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba,GydF4y2Ba42GydF4y2Ba］．在这个研究中，表达GydF4y2BaCARPP13GydF4y2Ba在PMMOV感染后上调，旨在响应PMMOV感染的独立信号通路存在（图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba和附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)．许多TFs已被证明参与植物防御信号通路[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba］．在本研究中，有七种表达方式GydF4y2BaCaWRKYGydF4y2BaPMMoV感染后，发现有基因被诱导(图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba和附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba). 以前的研究表明GydF4y2BaWRKY3公司GydF4y2Ba,GydF4y2BaWRKY70型GydF4y2Ba和GydF4y2BaWRKY75型GydF4y2Ba参与植物与病原菌的相互作用[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba,GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］．因此，我们推测这七个GydF4y2Ba怀疑GydF4y2Ba基因也可能在辣椒对PMMoV感染的早期反应中发挥重要作用。GydF4y2Ba

近年来对植物自噬和病原菌侵染的研究揭示了自噬在病原菌侵染过程中的重要性[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba46GydF4y2Ba]. 其他研究也显示了自噬在消除哺乳动物细胞病毒方面的特殊作用[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba,GydF4y2Ba48GydF4y2Ba］．另一方面，一些植物病毒已经被证明可以抑制或利用自噬来促进它们在植物中的感染[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba49GydF4y2Ba,GydF4y2Ba50GydF4y2Ba,GydF4y2Ba51GydF4y2Ba］．本研究表明，自噬在辣椒对PMMoV感染的防御反应中起着重要作用。我们的结论是基于接种PMMoV后9天，辣椒植株中17个自噬相关基因的表达发生了改变，尽管有几个基因的表达变化不具有统计学意义(附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba). 值得注意的是，在14dpi进行的RT-qPCR分析显示，八个分析的自噬相关基因中有六个显著上调，一个显著下调（另一个文件）GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)表明自噬在辣椒对PMMoV感染的防御反应中起重要作用。在哺乳动物细胞中，有缺陷的ATG5或ATG7不能阻止自溶体的形成，而自溶体是由各种应激诱导的。建议巨自噬至少可以通过两种途径发生：一种是传统的ATG5/ATG7依赖性途径，另一种是非典型的ATG5/ATG7非依赖性途径[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba］．我们的结果表明PMMoV感染诱导的自噬可能是传统的ATG5/ atg7依赖途径。一些报告表明ATG8家族蛋白参与了自噬生物发生和货物招募[GydF4y2Ba53GydF4y2Ba］．在这项研究中，我们进一步确定了沉默GydF4y2BaNbATG3公司GydF4y2Ba,GydF4y2BaNbATG5公司GydF4y2Ba,GydF4y2Banbbeclin1.GydF4y2Ba,GydF4y2BaNbATG7公司GydF4y2Ba或者GydF4y2BaNbATG8a型GydF4y2Ba中的表达式GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba植物通过VIGS载体可增强PMMoV RNA的积累和病害症状的形成。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba). 为了探讨自噬在PMMoV感染中的作用，为进一步研究自噬与PMMoV的关系提供依据，我们分析了自噬对PMMoV病毒积累的生理意义。通过用3-MA或E64d处理抑制自噬途径，我们证明PMMoV感染激活了自噬，植物利用自噬抑制PMMoV感染（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．然而，这两种抑制剂对ATG8蛋白的积累具有相反的影响（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)．3 mA可以在自噬初期抑制自噬体的形成[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba]E64d能稳定空泡内的自噬体，防止其在自噬后期降解[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba]，这导致了ATG8蛋白的矛盾积累。综上所述，我们认为自噬在植物对PMMoV感染的防御反应中起着重要作用。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

作为III类PI3K复合物的核心组分，BECLIN1可以通过作为不同蛋白质的相互作用中心来调节自噬[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba］．而且，Beclin1/ATG6复合物在植物、人类和其他真核生物的自噬过程中是必需的[GydF4y2Ba57GydF4y2Ba］．刘和其他人之前的一项研究表明，沉默的表达GydF4y2Babeclin1.GydF4y2Ba和其他几个GydF4y2BaATGGydF4y2Ba基因GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba植物通过VIGS载体增强TMV感染[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba］．beclin1介导的自噬也可能通过与TMV编码RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)的相互作用抑制TMV感染。病毒RdRp是RNA病毒复制所必需的，所有已知的病毒RdRp都具有保守的GDD基序[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba]. 为了进一步探讨自噬对PMMoV感染的防御反应，我们通过酵母双杂交技术研究了PMMoV rdrp2和NbBeclin1中保守的GDD基序之间的相互作用。正如预期的那样，PMMoV rdrp2确实与NbBeclin1（附加文件）交互GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba)提示NbBeclin1可直接与PMMoV-RdRp-u2结合，抑制RdRp活性，抑制病毒感染。特别是，我们的研究结果进一步证明，通过Beclin1靶向病毒RdRp是植物中一种保守的抗病毒机制（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba). 同时，我们的结果显示PMMoV p126中的HEL基序可以与NbATG8f（附加文件）相互作用GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba)提示p126可能是一个新的自噬降解靶点，通过与NbATG8f结合（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)，有待进一步调查。GydF4y2Ba

总之，我们通过RNA-seq方法分析了辣椒对PMMoV感染的反应。我们的结果表明，几个负责信号转导或应激反应的基因可能在PMMoV感染的防御反应中发挥重要作用（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．此外，我们还证明了许多的表达式GydF4y2Ba自动液位计GydF4y2Ba在感染PMMoV后，辣椒植株中表达量呈上升趋势。进一步研究表明，PMMoV感染可诱导细胞自噬，自噬在宿主植物与PMMoV的“军备竞赛”中起抗病毒作用(图1)。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba). 这些结果将有助于我们更好地理解植物感染PMMoV的机理，并为抗病毒作物的育种提供更好的策略。GydF4y2Ba

质粒构建GydF4y2Ba

七个序列GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba基因：GydF4y2Banbbeclin1.GydF4y2Ba（加入号码AY701316），GydF4y2BaNbVPS15GydF4y2Ba（KU561371），GydF4y2BaNbATG9公司GydF4y2Ba（KX369399），GydF4y2BaNbATG3公司GydF4y2Ba(KX369396),GydF4y2BaNbATG5公司GydF4y2Ba（KX369397），GydF4y2BaNbATG7公司GydF4y2Ba(KX369398)和GydF4y2BaNbATG8a型GydF4y2Ba（kx120976）从Genbank数据库中检索（GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GydF4y2Ba)．全长GydF4y2BaNbATG8a型GydF4y2Ba基因的PCR扩增和克隆后GydF4y2BaeGFPGydF4y2Ba在pGD载体中表达GFP:NbATG8a融合蛋白。用于质粒构建的引物序列见附文件GydF4y2Ba9GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

植物生长与病毒接种GydF4y2Ba

种子GydF4y2BaCapsicum Annuum.GydF4y2BaL品种“尊拉1号”由丹星博士（贵州省农业科学院，贵阳，中国）提供。野生型GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba种子繁殖并保存在中国沈阳沈阳农业大学植物病毒实验室。所有的种子都生长在25℃的生长室内 °C和a 16和8 h（光/暗）光周期和60%湿度。PMMoV-HLD分离物来自先前报道的来源[GydF4y2Ba59GydF4y2Ba]在我们的实验室里，对于病毒接种，大约0.5 在磷酸盐缓冲液（PB，0.01）中匀浆感染PMMoV的叶片组织g M、 pH值 7.2）比例为1:5（w/v）。将粗叶提取物接种于4叶期辣椒植株上部两片幼叶上。9点 在接种病毒（dpi）后的第天，上部未接种幼叶（图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Baa、 红色箭头）收获，冷冻在液氮中，然后储存在− 80 °C，直至继续使用。只接种PB的植株也在9dpi收获叶片，作为未感染的对照。GydF4y2Ba

RNA分离和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）GydF4y2Ba

为了检测辣椒植株中的PMMoV感染，根据指示，使用RNAiso-Plus试剂（TaKaRa，大连，中国）从采集的叶片样品中提取总RNA。使用NanoDrop2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）监测分离RNA样品的浓度和质量。用1 μg总RNA，M-MLV逆转录酶（Promega，Carlsbad，USA），等体积的寡核苷酸（dT）和随机引物（2.5 μM），最终体积为20 μL，按照制造商的说明。PCR扩增在最终的25个体积中进行 μL含2.5 PrimeSTAR®Max DNA聚合酶单位（中国大连TaKaRa），1 μL每种PMMoV-CP基因特异性引物（10 μM）（附加文件GydF4y2Ba9GydF4y2Ba)和2 μL cDNA模板。PCR反应条件为98°C 10 s, 55°C 5 s, 72°C 20 s，共35个循环。GydF4y2Ba

RNA测序（RNA-SEQ）GydF4y2Ba

对于一种病毒接种实验，上幼叶（图。GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba合并来自至少15个单独的PMMOV感染和未感染的胡椒植物的红色箭头分别用于RNA-SEQ。在本研究中进行了三种独立的病毒接种实验。将来自每个样品的一个微图谱的总RNA用作RNA制剂的输入。使用Nebnext®ultra™RNA库预备套件（新英格兰Biolabs，Ipswich，USA）和NEB下一代多路复用寡核苷酸（新英格兰Biolabs）构建测序库，然后在Illumina Hiseq 4000测序平台上测序（Biomarker Biology Technology，北京，中国）按照指示。简而言之，使用Poly-T oligo附着的磁珠制备mRNA。在碎片后，合成CDNA，然后用具有发夹环结构的NEB下一个适配器连接。纯化得到的PCR产物，使用安捷伦生物分析仪2100系统评估文库的质量。GydF4y2Ba

清洁读数单独对齐参考基因组GydF4y2BaCapsicum Annuum.GydF4y2Ba. L_Zunla-1_发行版\u 2.0(GydF4y2Bahttp://peppersequence.genomics.cn.GydF4y2Ba)使用TopHat 2.0软件[GydF4y2Ba60GydF4y2Ba］．将一个特定基因上的clean reads数进行计数，然后使用Cufflinks [GydF4y2Ba61GydF4y2Ba］．利用DESeq软件对pmmov感染样本和非感染对照样本(Mock)之间的差异表达基因(DEGs)进行鉴定[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba］．根据平均日志单独排序。GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaFold Change（FC）和false discovery rate（FDR）Q值，然后使用FDR Q进行过滤 < 0.05和|对数GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaFC |≥1。基因函数根据以下数据库注释：基因本体（GO），基因和基因组的京都百科全书（Kegg），瑞士 - Prot和NCBI非冗余蛋白序列（NR）。使用Goseq R包基于Wallenius Noncentral Hyper.Crictric分布来确定DEG的富集[GydF4y2Ba63GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

逆转录定量PCR（RT-qPCR）GydF4y2Ba

为了验证RNA-SEQ结果，通过RT-QPCR选择12次并测试其表达。使用Hiscrip III RT Supermix试剂盒（南京，中国）使用QPCR扩增使用QPCR扩增使用QPCR Sybr Green Master Mix套件（vazyme）在Stepone加上实时QPCR扩增，用于CDNA合成。PCR平台（应用生物系统，美国福斯特城）。根据来自的基因序列设计QPCR扩增的引物GydF4y2BaCapsicum Annuum.GydF4y2Ba. L_Zunla-1_Release_2.0数据库（http://GydF4y2Ba胡椒序列.基因组学.cnGydF4y2Ba）和RNA-SEQ数据。该引物由中国上海的Sangon Biotech合成（附加档案GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba)．的表达水平GydF4y2BaC. Anuum泛素 - 缀合蛋白GydF4y2Ba基因(GydF4y2BaCaUBI-3GydF4y2Ba，AY486137）[GydF4y2Ba64GydF4y2Ba]或GydF4y2BaN. Benthamiana Actin.GydF4y2Ba基因(GydF4y2Ba肌动蛋白GydF4y2Ba(AY179605)分别作为内部控制。利用2GydF4y2Ba^{——ΔΔCTGydF4y2Ba}方法 [GydF4y2Ba65GydF4y2Ba］．对所有RT-QPCR实验进行三种生物学和三种技术复制。GydF4y2Ba

共聚焦显微镜和透射电子显微镜GydF4y2Ba

完全扩大的叶子为3周龄GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba用pmmov感染的粗叶提取物搓接植株。5 dpi后，接种叶片上方的第二叶被渗透GydF4y2Ba根癌农杆菌GydF4y2Ba菌株GV3101（ODGydF4y2Ba_600GydF4y2Ba= 0.6)，包含表达GFP的重组pGD载体:NbATG8a融合。在农业渗透(hpai)后48 h，在Olympus Fluoview FV3000共聚焦激光扫描显微镜(Olympus, Tokyo, Japan)下采集渗透叶面积并进行检测。激发波长为488 nm，发射波长为522 nm。GydF4y2Ba

在5 dpi，PMMOV或模拟接种的系统叶子GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba植物用100 μM E64d在DMSO溶液或单独使用DMSO溶液（模拟）中稀释10分钟 H然后收获处理过的叶子，并切成小块（1-2片） 毫米GydF4y2Ba^2.GydF4y2Ba)用于电子显微镜分析。组织固定、包埋、切片及透射电镜观察[GydF4y2Ba66GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

化学处理GydF4y2Ba

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA；Sigma，Darmstadt，德国）和E64d（Abcam，Eugene，美国）被用来研究自噬对PMMoV感染的影响。3-MA通过抑制Ⅲ类ptdins3激酶而干扰早期自噬体的形成，E64d可稳定液泡内的自噬体，抑制晚期自噬[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba,GydF4y2Ba55GydF4y2Ba]. 含二甲基亚砜（DMSO）的渗透缓冲液；或等量的DMSO和5 毫米3毫安或100毫安 μM E64d抑制自噬，渗入叶片10分钟 采集样本前h。GydF4y2Ba

免疫印迹分析GydF4y2Ba

如前所述，总蛋白从渗入的叶片中提取[GydF4y2Ba67GydF4y2Ba］．用BCA法测定不同样品的总蛋白浓度，然后用10% SDS-PAGE凝胶电泳。对于ATG8检测，变性蛋白在6 M尿素存在的15% SDS-PAGE凝胶上分离。western blotting将分离的蛋白带转移到0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore, Billercia, USA)。然后，用5% Difco™脱脂牛奶(Becton Dickinson and Company, Sparks, USA)溶液封闭膜，然后在4°C下用ATG8 (Agrisera, Vännäs，瑞典)或Rubisco (Abbkine, California, USA)特异性抗体探针过夜。在添加0.1%吐温20 (Tween 20, TBST)的tris缓冲盐水中冲洗几次后，将膜再次在室温下在辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG溶液(ZSGB-BIO，中国北京)中孵育1小时。在TBST缓冲液中冲洗几次后，按照指示将膜放在化学发光检测试剂盒中孵育，观察检测信号(Millipore)。GydF4y2Ba

病毒诱导的基因沉默（Vigs）测定GydF4y2Ba

对于VIGS分析，代表GydF4y2Banbbeclin1.GydF4y2Ba(343个基点),GydF4y2BaNbATG8a型GydF4y2Ba(265个基点),GydF4y2BaNbATG3公司GydF4y2Ba（329 BP），GydF4y2BaNbATG5公司GydF4y2Ba（317 bp）或GydF4y2BaNbATG7公司GydF4y2Ba(324 bp）进行RT-PCR扩增，并将其分别插入aGydF4y2Ba烟草响尾病毒GydF4y2Ba(和)的中收取向量。简单地说，这些片段是从一个GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba使用特异性引物通过PCR扩增cDNA(附加文件GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba)以及PrimeSTAR®Max DNA聚合酶（TaKaRa）。所得PCR片段用酶切GydF4y2BaBamh.GydF4y2Ba我和GydF4y2BaXHO.GydF4y2BaI限制性内切酶，分别克隆到pTRV2质粒中，分别产生pTRV2-Beclin1、pTRV2-NbATG8a、pTRV2-NbATG3、pTRV2-NbATG5和pTRV2-NbATG7。将这些新质粒和pTRV1质粒分别转化到大肠杆菌中GydF4y2Ba根癌农杆菌GydF4y2Ba菌株GV3101细胞。在传播之后，每个GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba培养物成球，然后在包含10 mM MES, 10 mM MgCl的渗透缓冲液中重悬GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba，pH7.2和150μm乙酰苯乙烯酮。GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba将含有pTRV1的培养物与等量的GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2BapTRV2-Beclin1、pTRV2-NbATG8a、pTRV2-NbATG3、pTRV2-NbATG5或pTRV2-NbATG7的培养。混合培养物分别为TRV-NbATG3、TRV-NbATG5、TRV-NbATG7、TRV-NbATG8a和TRV2-Beclin1。最终光密度(ODGydF4y2Ba_600GydF4y2Ba）每个混合GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba培养基为0.5，分别渗入4-5叶期叶片GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba使用无针注射器的植物。10点 农业入渗（dpai）后天数，上层未入渗GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba叶片接种pmmov感染的原油GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba叶子提取物或仅PB (Mock)。GydF4y2Ba

RNA-seq收集的原始数据可在国家生物技术信息中心(NCBI)获得:GydF4y2Bahttps://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/objects?linked_to_id=PRJNA631504&archive=biosampleGydF4y2Ba．SRA加入:PRJNA631504。本研究中使用和/或分析的数据集可在合理要求下从通讯作者处获得。GydF4y2Ba

自动液位计：GydF4y2Ba

自噬相关基因GydF4y2Ba

BSMV：GydF4y2Ba

大麦条纹花叶病毒GydF4y2Ba

CAMV：GydF4y2Ba

花椰菜花叶病毒GydF4y2Ba

CLCuMuV公司：GydF4y2Ba

棉花卷曲卷曲杂种病毒GydF4y2Ba

度:GydF4y2Ba

差异表达基因GydF4y2Ba

DMSO溶液:GydF4y2Ba

二甲亚砜GydF4y2Ba

Dpai公司：GydF4y2Ba

农药后的日子GydF4y2Ba

FPKM：GydF4y2Ba

每百万百万映射的成绩单每千碱基映射的碎片GydF4y2Ba

高性能人工智能：GydF4y2Ba

农药后几小时GydF4y2Ba

PCD：GydF4y2Ba

程序性细胞死亡GydF4y2Ba

PMMoV:GydF4y2Ba

辣椒轻度斑驳病毒GydF4y2Ba

PVDF:GydF4y2Ba

聚偏氟乙烯GydF4y2Ba

RdRp编号：GydF4y2Ba

RNA依赖性RNA聚合酶GydF4y2Ba

透射电镜:GydF4y2Ba

透射电子显微镜GydF4y2Ba

TMV公司：GydF4y2Ba

烟草花叶病毒GydF4y2Ba

TRV：GydF4y2Ba

烟草响尾病毒GydF4y2Ba

tumv：GydF4y2Ba

萝卜马赛克病毒GydF4y2Ba

我们感谢安德鲁博士。杰克逊（植物和微生物生物学系，加利福尼亚大学，伯克利，美国）提供载体PGD，于乐柳博士（生命科学院，清华大学，北京，中国）提供VIGS载体pTrv1和pTrv2。GydF4y2Ba

该研究由中国国家重点研发计划（2016年FD0201004）和辽宁高科技研发计划（2019H2 / 10200012）资助。这些融资机构在研究设计中没有作用;在收集，分析或解释数据;写作稿件。GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

1. 焦玉冰和安孟南对这一工作做出了同样的贡献。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 沈阳农业大学植物保护学院，沈阳，中国110866GydF4y2Ba

   焦玉冰，安蒙南，于曼，赵秀祥，夏子浩，吴元华GydF4y2Ba

2. 2 .国家林业和草原局林草病虫害防治总站，沈阳110034GydF4y2Ba

   小东李GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

YJ和MA进行了实验。ZX和YW参与了实验设计和协调。XL, MY, YJ采集样品。YJ和MA起草了手稿。MA, XZ, ZX, YW校对并定稿。所有作者已阅读并批准最终稿件。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba夏子豪GydF4y2Ba或者GydF4y2Ba袁华武GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

道德认可和参与同意GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

出版许可GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

作者宣布没有关于本文的出版物的利益冲突。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。GydF4y2Ba

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