跨膜蛋白表达的变化影响细胞的生长gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba通过改变生长素的反应gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

同一种植物可以表现出非常不同的大小和形状的器官，这是由基因决定的。研究植物形态多样性背后的遗传变异是进化研究的一个重要目标，它还有助于识别影响植物生长发育的基因功能。对诱变拟南芥群体的广泛筛选已经确认了多个影响器官大小和形状的基因和机制，但相对较少的研究利用自然群体的丰富多样性来确定涉及生长控制的基因。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们筛选了一个相对良好的表征集合gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba瓣尺寸变化的含义。关联分析染色体4上鉴定的序列和基因表达变化，对花瓣区域的差异进行了大量贡献。以4G16850的先前无特征化基因表达的变化（命名为gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba)通过影响细胞大小对器官大小的变化有重要作用。过度表达gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba导致更大的花瓣和更大的细胞，促进雄蕊特征的形成。已知的限制细胞生长的生长素应答基因的表达在对gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba过表达。ANT表达也减少gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba过度表达线，符合改变的花卉身份。减少了生长素的反应gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba过表达细胞，与生长素应答基因表达的变化一致。gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba因此可能会影响花瓣发育过程中的生长素反应。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

了解遗传变异如何影响植物生长对于进化和机理研究都很重要。我们使用了gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba为了鉴定拟南芥的启动子区域中的序列变异，其介导先前没有特征化膜蛋白表达的差异。这种变化有助于改变花瓣生长期间的毒素应答和细胞尺寸。gydF4y2Ba

细胞增殖和细胞生长相互协调，形成植物器官的特征尺寸、形状和功能。这种协调涉及多种细胞过程，包括信号机制，细胞分裂，膨大驱动的细胞扩张，细胞壁和蛋白质合成[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］.在形成叶片和花瓣等测定的植物器官期间，在器官形成的早期阶段发生细胞增殖，其次是细胞生长，细胞增殖，其发生以增加细胞尺寸，伴随着显影器官的分化达到最终特征尺寸和形状[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］.虽然有关其基本和应用，但众所周知，细胞增殖和细胞生长的空间和时间整合，以产生最终尺寸和种子的最终尺寸和形状。gydF4y2Ba

许多植物因其器官大小和形状的改变而表现出多种多样的形态，这反映了它们对自然环境的适应。一年生植物的自然分布范围gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba从斯堪的纳维亚北部到非洲，它表现出相应不同的表型[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，这样大多数遗传是表型不同的。然而，这种表型变异背后的遗传变异仍然鲜为人知。例如，在一次实验中建立的影响器官大小的基因功能的变异在多大程度上影响种群中器官大小的自然变异gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba尚不清楚。此外，影响器官尺寸和许多自然群体的许多其他特征的守恒程度也不充分记录。因此，对诸如器官尺寸的特征的自然变化的遗传基础的了解增加了将揭示天然遗传变异如何影响控制器官尺寸和其他特征的机制。gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2Ba在全球范围内适应各种栖息地，具有广泛的自然变化，反映了这些不同的生活历史[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］.虽然为了维持花的生殖功能，不同花器官的形状和大小是相互关联的[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba[拟南芥重组近交系数（RIL）群体鉴定了影响几种花卉形态特征的显着遗传变异性的遗传变异[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］.最近，QTL分析发现了6个影响花瓣形状和大小变异的独立位点gydF4y2Baerecta（er）gydF4y2Ba轨迹占该变异的51％[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］.32种附加的单倍型变化gydF4y2BaGA1gydF4y2Ba轨迹与花瓣，雄蕊和风格长度的变化相关联[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]. 在one of the few studies exploiting natural variation to identify a previously unknown growth regulator,BRXgydF4y2Ba被建立为根系生长期间细胞增殖调节剂[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]. 尽管有这些研究，在拟南芥器官大小的自然变异的鉴定和表征的例子还是有限的。gydF4y2Ba

拟南芥的基因组关联（GWA）映射越来越多地用于进入更广泛的自然遗传变异，以鉴定小效果等位基因，并更准确地映射基因型 - 表型关系[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］.它们的基因组的非常小的尺寸促进了大范围的重新排序gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba通过与装配的col0加入的比较，鉴定大量SNP和小indel变异[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］.在这一广泛的一系列中，来自瑞典的宽度相对良好，记录了[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]已被筛选用于过度越冬响应的变化[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]. 在itial inspection of this collection showed considerable variation in petal size and shape, therefore we conducted an association analysis of 272 Swedish accessions. We identified variation in the promoter of a hypothetical gene At4G16850, predicted to encode a 6-transmembrane (6TM) protein. Accessions with increased At4g16850 expression had larger petals due to increased cell growth. This was confirmed by transgenic lines over-expressing the coding region of At4g16850, which was calledKSKgydF4y2Ba．过表达At4g16850降低了几个调节花瓣细胞大小的生长素应答基因的表达，也降低了生长素应答。At4g16850的过表达也导致了花瓣向雄蕊类结构的部分同源性转化，这被认为是花器官发育基因表达的改变。gydF4y2Ba

识别影响花瓣区域的基因座gydF4y2Ba

我们测量了272的长度，最大宽度和花瓣区域gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba收集自瑞典南部和北部(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，并在控制条件下进行春化处理。额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba显示花瓣表型测量。所有的三个花瓣参数在采集的样本中变化很大。例如，平均花瓣面积从0.915毫米不等gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba(Hov1-10)到4.92毫米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba(Vår2-6)，相差537%。额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba显示来自这些加入的代表性花瓣，从Död1，中间尺寸进行比较。如图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA表明平均花瓣面积的变化形成了一个正态分布，因此适合于关联研究。使用GWAPP [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，采用加速混合模型，整合了250,000个SNPs的信息。该分析确定了第4染色体上花瓣面积的一个显著SNP关联(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab）。该地区最明显相关的SNP位于AT4G16830的基因模型中位于9,471,419bp的位置。该位置的标记是双等位基因的，其中载体在该基因座上携带的那些载体相对于携带替代“A”等位基因的花瓣区域的〜15％增加（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).该区域的连锁不平衡(LD)的程度是可视化的，使用所有SNP标记的信息，在+/−10 kb内的9471419 bp的位置，并根据所存在的等位基因进行颜色编码。然后将这些标记按染色体顺序按表型值进行排序。这确定了一个清晰的LD块(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad） 与花瓣较小的材料相比，花瓣较大的材料携带一组独特的等位基因。这个LD片段跨越了6个拟南芥基因模型，从At4g16820到At4g16850。改变这些基因活性的序列变异可以解释不同材料花瓣大小的差异。基因注释的评估显示没有已知的花瓣或器官大小的调节因子。在三个花瓣面积较小的材料和三个花瓣面积较大的材料的子集中，评估了LD定义的单倍型内的遗传变异对花瓣生长的影响（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae）。使用扫描电子显微镜（SEM）和图像J.在相对于载载等等位基因的载体中携带增加的T等位基因的探剂中观察到瓣膜释放表皮细胞面积显着增加（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae).因此，单倍型遗传变异的主要影响因素是花瓣细胞面积。gydF4y2Ba

At4g16850的表达水平与花瓣大小的数量变异相关gydF4y2Ba

为了评估6个候选基因在调节花瓣生长中的潜在作用，我们测量了col0突变体中可用的潜在功能缺失T-DNA的花瓣面积。除At4g16850(一个功能未知的小假设基因)外，所有高LD基因的T-DNA插入系都可以从母本中心获得。我们测定了这6个候选基因在不同花瓣大小的6个品种花组织发育中的表达。At4g16820 ~ At4g16845的T-DNA插入系与Col-0植株的花瓣面积没有差异(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC）。此外，在具有小且大花瓣的六种载体之间观察到这些基因在显影性方面的差异表达（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）。然而，对于AT4G16850，DJU-1，T1070和T880的较大花瓣的持续性较大的瓣膜转录水平增加（gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.001)(图gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）。在这些较大的花瓣加入的幼苗中，AT4G1650表达也增加了（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)与第0列相比。gydF4y2Ba

At4g16850基因区多态性gydF4y2Ba

增加的花瓣区之间的关系和所选载体中的AT4G16850的增加表达表明，锯切之间的序列变化可能影响到4G16850表达。检查可用基因组序列读取[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]与Col-0组合相比，Dju-1、T1070和T880的单核苷酸多态性范围有限，编码区和侧翼序列可能存在较小的indel变异。为了鉴定更广泛的启动子序列变异，一个区域2 用PCR方法扩增了3份A等位基因减少的材料（Roed-17、Lis-3、Had-1）和3份T等位基因增加的材料（Dju-1、T1070、T880）的At4g16850上游kb，克隆并测序，以确定At4g16850启动子区的准确位置和序列变异类型。在所有材料的保守区设计引物。上游区域很容易从三个较小的花瓣材料中扩增出来，并且被发现与携带减少A等位基因的材料中的Col-0启动子序列非常相似（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac），与其相对小的花瓣表型一致。因此，由于小花瓣附加和轨迹的Col-0之间的高水平序列节约，因此选择COL-0作为“小花瓣”参考基因组。但是，没有从任何大的瓣涂层中产生全长启动子扩增子。因此，我们产生了来自未扩增的DNA模板的Illumina序列的全基因组组件[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]对At4g16850进行序列变异分析。一个深渊重新组装产生了一个跨越dji -1线的At4g16850上游区域的大邻域。与col0小花瓣序列进行比较，确定了多个变异(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa和附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba). 值得注意的是，Col-0和Dju-1启动子有一个共同的23 bp-dA:dT富集区扩大了30% Dju-1启动子中的bp，使一个大约50 Dju-1中的bp-dA:dT富集区。这种dA:dT富集可能阻碍了大型花瓣材料全长上游区的PCR扩增。也有许多其他启动子多态性，包括在Dju-1的基因间区与Col-0相比另一个大的富含dA/T的插入，以及在5'UTR内含子中与Col-0相比Dju-1的缺失（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa） 是的。gydF4y2Ba

At4g16850编码一个具有3个非细胞质结构域和4个细胞质结构域的6-跨膜结构域蛋白(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab）。DJU-1和COL-0组件的比较揭示了预测的蛋白质在这些大型和小花瓣中的高度保守，在这些大型和小型瓣膜中，在横膜区域4和C末端细胞质中仅具有两个非保守氨基酸变化域名（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).为了评估At4g15850编码蛋白的预测亚细胞定位，将其编码区在c端与GFP融合，并在col0发育的花瓣原生质体中与已知的跨膜受体样激酶TMK4一起瞬时表达[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]融合给RFP。共聚焦成像显示AT4G16850-GFP融合蛋白与RFP标记的TMK4膜蛋白共同定位（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC)，表明它可以定位于质膜。胞质结构中也发现了At4g16850-GFP融合蛋白。gydF4y2Ba

过表达At4G16850增加了花瓣的大小，因为增加了细胞的生长gydF4y2Ba

对花瓣面积高度变异的不同材料的At4G16850表达的分析表明，差异表达可以解释受试材料花瓣大小变异的76%（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).为了确定At4g16850的这种变异是否导致了花瓣大小的变化，在转基因拟南芥col0植物中，从构成型35S启动子中表达了col0的At4g16850的编码区。Col-0的花瓣相对较小，在相关单倍型中遗传了At4G16850低表达的减少等位基因。因此，Col-0是观察过表达At4g16850后花瓣大小的任何预期增长的合适加入。通过比较转基因株系和未转化的Col-0植株的花瓣面积发现，所有过表达At4G16850的转基因植株(下图)的花瓣面积均显著高于Col-0 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba≤0.01)(图gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).因此，At4g16850表达量的增加导致花瓣面积增加约125%，说明材料之间At4g16850表达量的变化直接影响花瓣面积。在At4g16850表达增加的供试材料中，细胞面积增加。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae).过表达At4g16850的转基因株系的花瓣细胞面积也增加了约175%(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).这表明在较大的花瓣中，较大的细胞较少。综上所述，At4g16850表达的增加促进了拟南芥花瓣细胞的生长。要考虑到这个信息关于一个以前未知的基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba我们给这个基因命名gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba（Kronbladstorlek，瑞典花瓣大小）。gydF4y2Ba

表达增加gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba减少限制花瓣细胞生长的基因表达gydF4y2Ba

之前的研究已经确定了几个影响拟南芥花瓣细胞生长的基因。gydF4y2BaBPEp公司gydF4y2Ba［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba] 和gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba一起函数[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba来限制花瓣细胞的生长gydF4y2BaFRL1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]也抑制花瓣细胞的生长。用Q-RT-PCR方法检测过表达At4g16850的转基因col0株系和未转化的col0株系花瓣发育过程中这些基因的表达情况gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba可以通过这些基因影响花瓣细胞生长。虽然只有一个转基因线显示出显着减少gydF4y2BaBPEgydF4y2Ba在花瓣中表达(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa），持续减少gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba和gydF4y2BaFRL1gydF4y2Ba在发育中的转基因花瓣中可见表达(Figs。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab，c）与Col-0相比。这表明了gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba可以通过降低这些花瓣细胞生长基因的表达来促进花瓣细胞生长。gydF4y2Ba无性生殖的gydF4y2Ba减少BPEp表达式[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)和gydF4y2Baag-1gydF4y2Ba功能突变体的丧失具有更大的花瓣[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]，与BPEp功能丧失突变体中较大的细胞和花瓣大小一致。虽然我们没有观察到gydF4y2BaBPEp公司gydF4y2Ba言论自见述gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba我们测试过表达的转基因株系是否gydF4y2BaAG)gydF4y2Ba影响gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba表达式。gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba表达式加倍gydF4y2Baag-1gydF4y2Ba丧失突变(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaD)与模型相符gydF4y2BaAG)gydF4y2Ba被压抑的gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba表达，导致gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba和gydF4y2BaFRL1gydF4y2Ba表达及相应减少的花瓣细胞大小和花瓣总面积。gydF4y2Ba

过度的gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba导致花瓣向雄蕊结构的部分同源异型转化gydF4y2Ba

除观察到花瓣细胞生长显著增加外gydF4y2Ba35s :: ksk.gydF4y2Ba过度表达的线条，我们还观察到部分器官身份在所有八个鲜花中发生变化gydF4y2Ba35s :: ksk.gydF4y2Ba转基因植物(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.带器官身份的鲜花在第二轮中具有额外的花瓣状结构。这在第二螺纹的外边缘中显影，并显示了诸如部分花粉囊的韧带特征的变化范围（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa)和气孔，一个细胞类型没有观察到在col0花瓣(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab）。在这些花的第三轮的雄蕊数和发展正常。在花瓣表皮表面上的存在也已经看到gydF4y2Ba蚂蚁gydF4y2Ba缺陷转录因子的突变体gydF4y2BaAintegumenta.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］.使用QRT-PCR，我们评估了gydF4y2Ba蚂蚁gydF4y2Ba表现在发展中的三个花瓣gydF4y2Ba35s :: ksk.gydF4y2Ba表达过度的线条。显著减少gydF4y2Ba蚂蚁gydF4y2Ba在过度表达的花瓣中观察到表达gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).这表明gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba表达水平有助于决定花器官特性的途径涉及gydF4y2Ba蚂蚁gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

减少在表达线上的生长素应答gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba

一个共同的特征gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba和gydF4y2BaFRL1gydF4y2Ba表达，被过度表达所抑制gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba，是这两个基因的表达在对生长素的反应中都增加了[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］.因此，我们测试了wt Col-0和wtgydF4y2Ba35s :: ksk.gydF4y2Ba过度表达。DII- n3venus报告蛋白是生长素依赖的DII degron与核定位的Venus报告蛋白编码区融合的产物。通过降低的Venus荧光检测生长素水平相对于突变型mDII-ntdTomato，该突变型在生长素存在下不会降解[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］.这种双生长素报告物，称为R2D2，适用于单细胞检测，因为不同的转化效率可以通过核定位的维纳斯和番茄荧光蛋白的相对荧光来解释。从col0和a的发育花瓣中分离到原生质体gydF4y2Ba35s :: ksk.gydF4y2Ba转基因线过度表达gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba转染R2D2质粒。16h后，原生质体被0 nM或1000 nM IAA处理。原生质体在IAA处理后1 ~ 2 h成像。两个荧光团的核定位如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad,而无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaE显示MDII-番茄/ DII-venus的相对荧光。COL-0原生质体中，MDII-番茄与DII-venus的比例显着增加，表明瞬时表达的花瓣原生质体相对于稳定的转基因植物，响应于添加的植物蛋白[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]. 相反，在gydF4y2Ba35s :: ksk.gydF4y2Ba转基因原生质体中，维纳斯荧光与番茄荧光的比值并没有降低到Col-0的水平，这说明该转基因系的生长素反应可能降低。这一解释是通过测量两个生长素反应基因的表达水平来验证的(gydF4y2BaIAA1gydF4y2Ba和gydF4y2BaIAA9gydF4y2Ba）在Col-0的花瓣中和gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba表达过度的线条。它们的表达减少了（图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaF, g)，支持生长素反应降低的解释gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba过度表达。gydF4y2Ba

超过7000gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba已系统地收集了1000份材料，并对其中的1000份进行了测序，以获得广泛的基因组多样性[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］.我们使用了全基因组关联分析[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]对瑞典收集的一组特征相对较好的品种进行了研究[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]识别影响花瓣尺寸的序列变异的主要来源。现在称为血浆膜蛋白的先前假设基因表达的变异，现在称为gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba在这组材料中，对花瓣大小的变化有重要贡献。R2D2报告基因测定的生长素反应减少gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba这表明KSK膜蛋白可能直接或间接影响生长过程中生长素的反应或水平。gydF4y2Ba

KSKgydF4y2Ba预计将跨膜蛋白与跨越膜，3个非细胞质结构域和4个细胞质结构域的6个短螺旋域编码跨膜蛋白（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab）。KSK-GFP融合蛋白局部定位于质膜（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC）。KSK蛋白质序列在几组植物中具有合理高度保守，并且在拟南芥中没有密切的家庭成员，仅通过互惠BOSTP搜索检测到的AT1G31130的非常部分蛋白质对准。AT1G31130是位于Golgi，内体和质膜的321AA预测的6TM蛋白。预计6TM蛋白质结构存在于许多具有不同功能的拟南芥蛋白中存在，包括水蛋白，电压门固定离子转运蛋白和线粒体载体蛋白[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］.膜蛋白相互作用的思维数据库[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]确定与之间的相互作用gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba和AT1G07860，编码预测的受体样细胞质激酶VII（Rlck VII）家族成员。该家族的成员在病原引发的免疫和生长途径中的作用[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]包括相对良好表征的RLCK VII BIK1，其通过N-肉豆蔻酰化被膜锚定[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]. 在gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba通过瞬时表达生长素报告基因R2D2检测，过表达的生长素反应减少(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae）。这可能是由于减少了胃辘应答，合成或改变的运输。KSK-GFP的膜定位表明对养肝转运的潜在影响。然而，预测的6TM跨膜组织在膜中的KSK的组织不同于所有已知的养蛋白摄取和流出血浆膜和型液体膜转移器的不同之处不同gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

结果表明，小花瓣镶度colo和大花瓣镶度Dju-1之间存在多个启动子多态性(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa和附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.相比之下，这两种材料的蛋白质编码区只有两个非保守的氨基酸变化(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab） ；一个位于预测的非细胞质结构域，另一个位于预测的C-末端非细胞质结构域。虽然这些可能会影响gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba对Dju-1的大花瓣表型进行了表型复制，结果表明，在筛选的材料中，增加表达的启动子变异很可能导致大花瓣表型。Dju-1启动子区的一个有趣的特征是50个以上的dA:dT富集区的积累 英国石油公司。这种长度的多态性在拟南芥基因组组装中非常常见[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]，并且在许多真核生物基因组中过度表达，它们可能是通过复制滑移产生的[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］.启动子中的dT束通过形成部分支架附着区(SARS)和引入影响转录因子和核小体通路的DNA曲率，在调节基因表达方面发挥了明确的作用。gydF4y2Ba

KSKgydF4y2Ba过表达导致表达减少gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba和gydF4y2BaFRL1gydF4y2Ba，两个对花瓣细胞大小产生特定负面影响的基因（图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA，B，C）。gydF4y2BaFRL1gydF4y2Ba编码一种影响内复制的固醇甲基转移酶[gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]. ARF8是一种生长素应答转录因子，与bHLH转录因子BPEp形成转录复合物[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]. BPEp还特别限制花瓣中的细胞扩张。BPEp在花瓣发育后期高表达，ARF8则普遍表达，但在花瓣发育后期表达更高。两者的表达gydF4y2BaFRL1gydF4y2Ba和gydF4y2BaARF8.gydF4y2Ba响应于植物因而增加[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]，生长素反应在gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba过度表达的线条（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae），有可能gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba过表达可能降低这些生长素响应的花瓣细胞大小的负调控因子的表达，导致花瓣细胞大小的增加和花瓣面积的总体增加。的下调gydF4y2Ba蚂蚁gydF4y2Ba表达gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba过表达线（图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC)与随着生长素增加而减少的生长素反应相一致gydF4y2Ba蚂蚁gydF4y2Ba基因表达 [gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba蚂蚁gydF4y2Ba编码影响多个花卉发育阶段的AP2 / ERF转录因子，包括花式器官身份的规范。花瓣gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba过度表达的线通常表现出肌韧带特征的部分转化，并且还具有气孔，一种通常在花瓣中发现的细胞类型（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa、b)。gydF4y2Ba蚂蚁gydF4y2Ba突变体的花瓣细胞特征也被改变以形成气孔[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，支持这样的结论gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba调制gydF4y2Ba蚂蚁gydF4y2Ba表达，也许是通过改变促进的响应性，导致花瓣将瓣膜的众所周不可转化为茎状特征。这种转换与另一个功能一致gydF4y2Ba蚂蚁gydF4y2Ba在排除中，与一起gydF4y2BaAP2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba艾玛（AG）gydF4y2Ba第二轮开始的表达式[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］.AG激活gydF4y2Ba无孢子/喷嘴（SPL/NZZ）gydF4y2Ba，促进微孢子发生的转录因子[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba］.这种限制的放宽gydF4y2BaAG)gydF4y2Ba因此，表达可以想到导致肌瓣素特征发展gydF4y2BaKSKgydF4y2Ba过度表达花瓣。gydF4y2Ba

花的形态在植物的适应性中起着重要的作用，例如吸引特定的传粉者。在gydF4y2Ba芸苔栗鸟gydF4y2Ba作物，降低的花瓣尺寸是一种重要的特征，因为它可以通过致密的檐篷增加光渗透。在野生种群中gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba在美国，人们还不清楚花瓣面积变化的适应意义(如果有的话)。虽然gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba主要是自花传粉，一些种群表现出更高的异交，特别是在物种丰富的农村环境[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］.不同的昆虫访问拟南芥的花，是潜在的传粉者[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]，因此，我们可以合理地推测，花瓣大小的遗传变异可能在确保瑞典群体异交系中起适应作用。用大花瓣选择的三个线条来自瑞典南部的不同位置(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba），所有这些都有不同尺寸的花瓣的港口庇护。花瓣大小的自然变化gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba因此，可以通过吸引不同类型的昆虫游客来促进多元化的机会。gydF4y2Ba

植物材料和表型gydF4y2Ba

272gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在John Innes Centre的Caroline Dean获得了牧师。这些是1001种基因组联盟研究的一部分gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba可从拟南芥生物资源中心获得，注册号CS78942[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］.在5℃下48小时分层后，在生长室中的含量，转基因植物和T-DNA突变体在生长室的土壤中生长在生长室中，在22℃下在22℃下进行。gydF4y2Ba

为了量化花瓣的长度、宽度和面积，研究人员从第一组完全开放的花中，从每个基因型的3个生物重复中分离出10个花瓣，以减小任何发育差异。花瓣被安装在黑色的硬纸板上，并用层压来保护花瓣。花瓣以200dpi分辨率扫描，花瓣长度、最大宽度和面积用图像J测量。gydF4y2Ba

GWAS公司gydF4y2Ba

GWAS使用开源GWAS软件GWAPP进行:gydF4y2Bahttps://gwas.gmi.oeaw.ac.at/gydF4y2Ba使用250k SNP数据集。使用AMM功能进行分析。gydF4y2Ba

DNA构建体gydF4y2Ba

xha-at4g16850 p35区域::3gydF4y2Ba转基因系是通过克隆的方法建立起来的gydF4y2BaAT4G16850gydF4y2Ba使用附加文件中描述的引物将cDNA导入pENTR TOPO-D载体(Thermofisher, UK)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．的gydF4y2BaAT4G16850gydF4y2Ba使用LR Clonase mix II (Thermofisher, UK)将CDS转入35S PB7HA二元载体。将pAt4g16850::At4G16850-GFP基因的启动子和编码区克隆到pENTR TOPO-D载体中，利用LR克隆酶将目的序列转入pEARLYGate 103载体中。所有结构在使用前都进行了测序。的gydF4y2BaP35S :: 3xHA-AT4G16850gydF4y2BaConstruct被转化为gydF4y2Ba农杆菌肿瘤术gydF4y2Ba菌株GV3101和拟南芥gydF4y2Ba列-0gydF4y2Ba使用花卉DIP方法转化植物[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

拟南芥T-DNA系的基因分型gydF4y2Ba

使用引物设计工具设计的基因特异性引物对从诺丁汉拟南芥种子中心（NASC）获得的序列索引T-DNA插入系进行基因分型gydF4y2Bahttp://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html.gydF4y2Ba引物序列在附加文件中gydF4y2Ba7gydF4y2Ba. 根据制造商的说明，使用TAKARA EX taq（TAKARA Bio，美国）进行基因分型。gydF4y2Ba

cDNA合成，PCR和基因组测序gydF4y2Ba

使用SPECTRUM Total Plant RNA kit (Sigma, UK)从发育中的花蕾或12天幼苗中分离出正在发育的花瓣，提取RNA。1 μg RNA经RQ1 RNase-Free DNase (Promega, USA)孵育后再合成cDNA。使用GoScript逆转录(Promega, USA)和OligoDT。cDNA样本在使用前用水1:10稀释。Q-RT-PCR使用SYBR绿色mastermix (Thermofisher)和Lightcycler 480 (Roche, Switzerland)进行。额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba描述用于Q-RT的引物 - [gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]聚合酶链反应。引物效率和相对表达量的计算依据。所有的q-RT-PCR检测至少重复两次。根据制造商的说明，所有PCR反应均使用Phusion高保真DNA聚合酶（新英格兰生物实验室）进行。毛细管测序由GATC生物技术公司（德国）进行。对于材料Dju-1、T880和TI070的全基因组组装，使用Qiagen柱和如上所述制备的无PCR索引的Illumina文库制备高分子量DNA[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba］.QC后，为每个文库生成了约50 m的150 bp的对端reads (Novagene, Hong)。使用ABySS v1.3.6 [gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba)和一个gydF4y2BakgydF4y2Ba- 75的大小。基因组组件与使用肌肉V3.8.31的AT4G16850的基因组区域对齐[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba］.在ENA（PREJB28030）提供了三种载体的组件。gydF4y2Ba

扫描电子显微镜gydF4y2Ba

解剖，固定和临界点在SEM成像之前干燥。化学固定在0.05M的Cacocylylate，pH 7.4中为2.5％戊二醛。进行真空渗透直至花瓣在4℃下在固定剂中留过夜之前沉入。在漂洗后两次然后水两次，每次25分钟，通过乙醇系列脱水30分钟，每次在30,50,70,90,100和100％干燥乙醇中脱水30分钟，然后用Leica EM干燥临界点CPD300 system (Leica Microsystems Ltd., Milton Keynes, UK) according to the manufacturer’s instructions. Dried samples were mounted on the surface of an aluminium pin stub using double-sided adhesive carbon discs (Agar Scientific Ltd., Stansted, Essex). The stubs were then sputter coated with approximately 15 nm gold in a high-resolution sputter coater (Agar Scientific Ltd) and transferred to a Zeiss Supra 55 VP FEG scanning electron microscope (Zeiss SMT, Germany). The samples were viewed at 3 kV and digital TIFF files were stored.

拟南芥原生质体中的瞬态表达gydF4y2Ba

利用分离的原生质体进行瞬时表达分析gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba0列展开花瓣[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba］.用Qiagen plasmid Maxi Kit (Qiagen)纯化的5μg质粒DNA转化原生质体。在20°C孵育过夜后，收集转染的原生质体并使用共聚焦显微镜成像。将R2D2质粒(Addgene 61629 pGreenIIM rps5a - mdi - ntdtomato / rps5a - di - n3venus)转染到从col0或col0中分离的花瓣原生质体中gydF4y2Ba35s :: ksk.gydF4y2Ba植物。过夜培养后，原生质体经0或1000 nM IAA处理1-2 h后成像。徕卡SP5用于12位分辨率的光子计数，用于转染的原生质体成像。番茄荧光增重设定为50%，金星荧光增重设定为10%。Venus在514 nm处被激发，在524-540 nm处被检测;Tomato在561 nm处被激发，在571-630 nm处被检测。ImageJ用于计算核内荧光的平均灰度值。gydF4y2Ba

序列读取的gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2BaENA（PRJEB28030）提供Dju-1、TBA_01和TI-070。植物材料可从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

深渊:gydF4y2Ba

短序列装配gydF4y2Ba

FDR：gydF4y2Ba

错误发现率gydF4y2Ba

GWAS：gydF4y2Ba

全基因组关联研究gydF4y2Ba

LD:gydF4y2Ba

连锁不平衡gydF4y2Ba

瑞来斯:gydF4y2Ba

重组自交系gydF4y2Ba

q-RT-PCR:gydF4y2Ba

定量逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba

QTL:gydF4y2Ba

定量特质基因座gydF4y2Ba

SEM：gydF4y2Ba

扫描电子显微镜gydF4y2Ba

SNP:gydF4y2Ba

单核苷酸多态性gydF4y2Ba

我们感谢顾本国博士进行的Q-RT-PCR实验，感谢约翰英纳斯中心卡罗琳·迪安小组成员对瑞典品种的协助，感谢约翰英纳斯中心园艺服务的工作人员对植物进行专家维护。gydF4y2Ba

这项工作得到了ERA-CAPS Grant ABCEED对MWB的支持。MWB还得到了生物和生物技术科学研究理事会(BBSRC)研究所战略拨款GRO (BB/J004588/1)和GEN (BB/P013511/1)的支持。JD得到了bbsrc资助的CASE PhD奖学金的支持。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 细胞和发育生物署John Innes Centre，诺威奇研究园，诺威奇，NR4 7UH，英国gydF4y2Ba

   夏洛特N。米勒、杰克·杜梅尼尔、付浩路、卡罗琳·史密斯、尼尔·麦肯齐、沃罗德迈尔·查普曼、约书亚·鲍尔、马修·博克斯和迈克尔·贝文gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

CNM、JD、MB和MWB构思实验，MWB指导实验，CNM、JD、F-HL、CS、NMcK、VC和JB进行实验，CNM和MWB撰写论文。作者阅读并批准了最后的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba迈克尔·贝文gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

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