转录组和代谢物分析揭示了Funneliformis Mosseae.在不断裁剪大豆的根部

背景

丛枝菌根真菌是最广泛分布的菌根真菌，可通过植物根系形成菌根共生，通过调节宿主代谢活动来增强植物应激性。在本文中，使用与串联质谱（MS / MS）技术偶联的RNA测序和超级性液相色谱（UPLC）研究了感染的连续种植大豆根的转录组和代谢物谱F. Mosseae.和F. oxysporum.．目的是探讨F. Mosseae.大豆根腐病的防治F. oxysporum.．

结果

根据转录组图谱，共鉴定出24285个差异表达基因（DEGs），并对苯丙氨酸解氨酶基因的表达进行了分析(朋友)、反式肉桂酸单加氧酶(CYP73A)，肉桂酰辅酶A还原酶(CCR.），chalcone异构酶（ch)咖啡辅酶o-甲基转移酶在感染病毒后表达上调F. oxysporum.; 这些变化是诱导大豆防御反应的关键。结果表明，大豆苷元和7，4-二羟基，6-甲氧基异黄酮（glycine）在根接种后表达上调，参与异黄酮代谢途径f . mosseae。此外，氨基酸、酚和萜烯代谢物丰度的实质性改变都导致了防御化合物的合成。对代谢和转录组数据的综合分析表明，在病原体感染下，大多数中间代谢物和酶的丰度发生了实质性的变化。这些变化包括大豆异黄酮生物合成途径，说明大豆异黄酮生物合成在大豆根系反应中起着重要作用。

结论

结果表明F. Mosseae.可减轻连作引起的根腐病。一些抗病基因和抗病代谢产物活性的增加可能是植物抗病能力的部分原因。本研究为AMF减轻大豆根腐病的分子机制提供了新的思路，对农业生产具有重要意义。

大豆(最大甘氨酸L．根腐病是一种分布广泛、危害严重、难以防治的作物病害。发病率可达75% ~ 90%左右，导致大豆产量和品质下降[39.］．导致大豆根腐腐的病原真菌包括尖孢镰刀菌,Fusarium Avenaceum，Fusarium solanacearum,梅毒镰刀菌,疫霉突变和最后腐霉[16］．F. oxysporum.是大豆根腐的主要真菌，它可以减少大豆荚的数量，产量为25％〜75％[57]. 研究表明，在温室试验中，杀菌剂可以控制病害的发生，但对田间增产没有影响[14］．

微生物对植物疾病的生物控制潜力（Babu等，[2.])。丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是一种专性的共生真菌，可与80%以上的陆生植物的根系形成菌根共生体。AMF不仅能增强植物对养分和矿物质的吸收，还能提高植物抵抗土传病害的能力，在植物进化和营养方面发挥重要作用[7.,19,36.］．Funneliformis Mosseae.AMF作为一种优势AMF，对植物根系抗病性具有积极作用。1968年，萨菲尔首次发现F. Mosseae.可以降低洋葱的发生率（洋葱根腐病由拟除虫菊科[42.]，后来的调查人员已成功应用于柑橘（白柑）， 桃子 （Amygdalus PersicaL.），草莓（草莓杜赫．），大豆和其他作物。例如，根腐烂引起的F. oxysporum.黄瓜(黄瓜L.）幼苗[47.]根腐病是由南方根结线虫和菜豆壳球抱鹰嘴豆[44.]以及地上植物白粉病等病害(erysiphe pisi.） 在大sibircus[10]以及镰刀菌在这种情况下已经研究了黄瓜中的枯萎[11］．

转录组可用于揭示分子水平在代谢调节的机制，并且已成为研究基因表达，RNA生物发生和代谢的不可或缺的方法[49,50]. 代谢组学是一门新兴的组学技术，用于鉴定和定量生物体或细胞内的所有代谢物，是系统生物学的组成部分[24.]. 这个工具是连接基因、蛋白质和表型的桥梁。到目前为止，代谢组学已逐渐应用于农业的各个领域，并被证明是通过有针对性或无针对性的分析来确定生物样品代谢谱的有力工具[22.］．Agudeloromero联合转录组和代谢物分析了葡萄的响应（葡萄在病原菌与寄主的相互作用过程中，对果实的反应有了新的认识[1.]. 通过整合蛋白质组和代谢物分析与细胞壁特性，Floerl S等人发现黄萎病longisporum可以通过对植物防御基因的诱导和表达产生负调节和延迟诱导和表达来提高自己的致病性[8.］．

由于对大豆的需求增加以及由于造成的作物损失的风险增强F. oxysporum.，必须尽快找到可在大豆生产系统中使用的疾病控制方式。本研究的目的是将转录组和代谢物分析结合以探索效果F. Mosseae.通过盆栽试验研究AMF对大豆根腐病的防治效果，探讨AMF对大豆根腐病的防治作用F尖孢菌-衍生的大豆根腐烂。此外，其他目的是降低大豆根腐的发生率，减轻持续种植的障碍，为阐明大豆根腐病的发病机制提供了试验基础，并为生物制剂的开发和应用提供了理论依据。

的影响F. Mosseae.对大豆根腐肥和殖民化率的处理

四十四 播种3d后，随机抽取各处理组大豆根系，检测根腐病发生率1.结果表明，随着大豆的生长发育，F组的病情指数增加。之后F. Mosseae.接种，AF组的疾病指数低于F组的疾病指数，表明F. Mosseae.可以减轻大豆根腐的症状。

如图。2.，未检测到amf的定植率，直到大豆生长40 d，并且整理率在所有组中增加。AF中的定植率明显高于CK和F组（N = 2.P = 0.044). After 58 d, the mycorrhizal structure that formed in the AF group gradually increased, and a large number of hyphae and vesicles appeared. Clearly, the colonization rate of F and CK was significantly lower than that of AF. We speculate that the roots infected in these two groups were by the spore transmission of fungi spores in the air.

的影响F. Mosseae.大豆根系转录组的处理

在根腐病高发期，对9个根样本进行了转录组测序，高质量的干净读取数占各组样本的98%以上（补充表S）1.）。这里获得的高质量清洁读数与已知的基因组进行了比较。在AF，CK和F治疗中检测到38,961,38,832和38,688个基因，并且在表中显示了每组中检测到的基因数量1.．

为了评价大豆DEGs文库的重现性，对9个分析样本的转录组进行了主成分分析。在PC1和PC2中，F组的离散度最好，其次是CK组。虽然CK3的分散度较大，但在PC1上的分散度在合理范围内。在房颤组，AF3成为异常值。为了提高三个样品之间的重复性，在去除AF3后再次对每个组分进行PCA分析（图。3.a） 是的。结果表明，各组分在PC1上的分散度（66.1%）基本一致，样品重复性好。RNA seq测序后，用edge R软件定量表达CK、F和AF，分析CK、F和AF组间的DEGs（图。3.b） 是的。三组表达模式的差异显示，F组和AF组之间的差异最大（4477个下调转录物和7085个上调转录物）。此外，当比较CK和F时，5728个转录物上调，4376个转录物下调。

根据基因本体，我们从生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）三个方面对DEGs进行了注释和分类。对照组和F组DEGs的GO术语分为44个主要功能组（图。4.一种）。在BP类别中，大多数DEG主要集中在代谢过程（12.67％）和细胞过程（10.57％）上。在MF类别中，DEG主要参与编码催化活性（11.80％），然后结合活性（8.92％）。在CC类别中，上调的次数主要与细胞部分（12.36％）和细胞器（4.24％）有关，而几次含量涉及细胞外基质（0.01％）和超分子纤维（0.005％）。这些结果表明，病原体通过破坏膜系统来侵入大豆根部的细胞，然后它们破坏大豆的代谢过程和一系列生理和生化反应。

在F组和AF组中，DEG的GO术语被分为46个主要功能组（图。4.b） 是的。在BP分类中，除代谢过程（12.68%）和细胞过程（10.54%）外，大多数deg主要集中在对刺激的反应过程（2.74%）和单个生物体过程（8.39%）。在MF类中，DEGs主要参与编码催化活性（11.45%），其次是结合活性（8.76%）。在CC类中，大多数DEG参与编码细胞器部分（6.47%）、细胞成分（9.94%）和细胞膜成分（7.04%），少数DEG与胞外区（0.23%）和超分子纤维（0.01%）有关。之后F. Mosseae.接种，DEG不仅以与膜系统相关的GO术语，而且还与大豆，排毒，抗氧化剂等的生长和发展相关的术语，从GO分类水平揭示了促进生长效果F. Mosseae.在大豆上。

基因不是独立发挥功能，而是相互协调，发挥一系列调控功能。以已鉴定的大豆根系基因为背景，对差异显著的基因进行KEGG富集分析，可以进一步阐明基因在代谢途径中的作用。CK组与F组和F组与AF组的DEGs分别在131和132 KEGG代谢途径中富集。用一个P.-价值< 0.05和FDR < 0.05，确定了具有显著变化的代谢和信号转导途径，并通过散点图直观显示了CK与F和F与AF组的前20条代谢途径（图。5.）。

在为CK与F显示的131个途径中（补充表S.2.)结果表明，DEGs含量最高的3个是代谢途径（990 DEGs，42.45%）、次级代谢产物生物合成（669 DEGs，28.69%）和核糖体（304 DEGs，13.04%）。其他与DEG高数量相关的GO术语为“苯丙烷生物合成”（155 DEG，6.65%）和“植物-病原相互作用”（104 DEG，4.46%）。我们发现与植物病原相互作用有关的基因，如致病相关蛋白1、丝裂原活化蛋白激酶激酶1和热休克蛋白90 kDa-beta表达上调。此外，编码反式肉桂酸单加氧酶（CYP73A）、肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的基因也在苯丙酸生物合成途径中上调，这表明F. oxysporum.侵染诱导了大豆的防御反应。

在针对AF的132个途径中（补充表S.3.)、“代谢途径”(1133个，41.49%)、“生物合成次生代谢物”(758个，27.76%)和“核糖体”(392个，14.35%)。此外，其他与高数量二磷酸脱氢酶相关的氧化石墨烯术语还有“抗生素的生物合成”(303个二磷酸脱氢酶，11.09%)和“碳代谢”(185个二磷酸脱氢酶，6.77%)。值得注意的是，控制苯基丙烷合成的基因，例如朋友,CYP73A,CCR.和咖啡辅酶O-甲基转移酶，与CK与F组相比，呈下调趋势。对控制硫酮异构酶的基因相同（ch）在植物 - 病原体相互作用途径中的黄酮类生物合成途径和基因中的合成。因此，可以推测，在AMF感染后，表达F. Mosseae.诱导抗性酶基因是上调的，并且通过作用减轻了连续的培养疾病F. Mosseae.因此，原本上调的基因表现出相反的表达趋势。

的影响F. Mosseae.代谢物谱的处理

显示多峰代谢物检测图的多响应监测（MRM）模式（补充图。S1.)显示可在样品中检测到的物质。OPLS-DA模型用于筛选具有显著变化的代谢物（补充图S）2.）。CK与F组和F与AF组分别在PC1中得分41和46。组分分散在每组中良好，样品之间存在强烈的相关性。由于多变量统计分析有时显示过度拟合，通过交叉验证和排列测试进一步验证了OPLS-DA模型。根据VIP≥1.0和| P（COR）| > 0.5 to the OPLS-DA model andP. value < 0.05 to the t-test, a total of 622 different metabolites were detected, as shown in Table2.共29类，包括有机酸（76）、氨基酸衍生物（53）、羟基肉桂酰衍生物（38）、异黄酮（17）、苯甲酸衍生物（14）、萜类（4）、儿茶素衍生物（4）等抗病代谢产物、化感物质和信号分子。

我们结合了对VIP的多元统计分析 ≥ 1来自OPLS-DA和t检验的单变量统计分析P.-价值< 0.05筛选不同对照组间代谢物的显著差异[41.］．表达差异显着差异的代谢物结果3.. 对照组与F组比较，11种代谢物表达上调，22种代谢物表达下调。与AF相比，F中上调和下调的代谢物分别为56和35。

在比较组之间的不同代谢物的数据标准化之后产生聚类分析和热图，这可以在视觉上显示组之间的差分代谢物中的累积差异（图。6.）。有30种不同的代谢物，包括烟酸及其衍生物，黄酮类化合物和苯甲酸及其衍生物。这些代谢物中的许多已被证明在植物防御反应中有效，包括萜类化合物和苯丙烷丙烷醇[13,51］．

所有的差异代谢物在代谢途径中富集，获得差异代谢途径。CK与F有38条富集代谢途径，其中氨基酸生物合成(42.86%)、代谢途径(78.57%)、次生代谢产物生物合成(57.14%)、单体生物合成(14.29%)、乙醛和二羧酸代谢(14.29%)显著富集。F组在精氨酸和脯氨酸代谢、酪氨酸代谢和精氨酸生物合成过程中，精氨酸和酪氨酸的表达显著下调。此外，F组在CoA和泛酸的生物合成过程中泛酸的表达也被下调。

F对AF共富集了38条代谢途径，其中嘌呤代谢(20.83%)、次生代谢产物生物合成(37.5%)、异黄酮生物合成(8.33%)、糖苷生物合成(8.33%)、赖氨酸降解(8.33%)、脂肪酸降解(4.17%)、泛酸和辅酶A生物合成(4.17%)显著富集。苯丙氨酸代谢(4.17%)等途径。AF组在磷酸肌醇代谢过程中d -葡萄糖6-磷酸表达上调。AF组4-羟基-2-喹啉酸在色氨酸代谢途径中表达上调。此外，在异黄酮代谢途径中，AF组大豆黄酮和7,4-二羟基，6-甲氧基异黄酮(甘氨酸)也显著上调。

从这些发现中，我们可以观察到病原体感染减少了大豆根中有机酸和其他代谢物和氨基酸含量的表达，导致植物疾病严重和差。F. Mosseae.能诱导和促进植物防御机制和生长调节剂的表达，提高作物抗性，有利于作物生长。

的影响F. Mosseae.大豆根系综合代谢产物及其转录网络的处理

诸如黄酮类化合物的次生代谢产物可有效帮助植物抗蚀性疾病，包括保护植物免受病原体，植物植物的运输和植物和微生物之间的相互识别和合作[5.,12,29.］．在菌根大豆，F. Mosseae.强烈促进了黄酮类化合物的积累，如黄酮酚，黄酮和花青素。在CK对F组中，类黄酮化生物合成相关基因ch，查尔酮合酶(CHS.)，反式肉桂酸4-单加氧酶，香豆酰奎宁酸（香豆酰莽草酸）3′-单加氧酶，咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶，类黄酮3′-单加氧酶和莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶上调。在F组和AF组中，大多数基因表达下调。在植物与病原菌的相互作用中，异黄酮类不仅是固氮细菌共生的信号分子，而且能抑制病原菌的侵染（植物抗毒素）[27.].. CHS和CHI是异黄酮合成的关键酶，在植物对各种病原的反应中起着关键作用。它们在植物中的表达效率直接影响异黄酮的含量。大豆含有CHS基因家族的9个成员，来自CHS1至CHS9，和CHS1有2份。虽然这个家庭的成员按顺序高度相似，但它们在植物开发中发挥着不同的作用。CHS7和CHS8主要参与异黄酮的合成和代谢途径[54］．有两种主要的类型ch,其中中国2只存在于豆类中。它能催化柚皮苷查尔酮和异甘草素分别成为柚皮素和甘草素。这一发现与异黄酮的生物合成是一致的[31.]. 在这项研究中，异黄酮是上调后，接种了F. Mosseae.减轻了根腐病（图。7.）。

大豆根腐病F. oxysporum.是一种典型的破坏性土壤疾病。已经表明，AMF可以增强植物疾病抗性并降低病原体引起的伤害。例如，一些作者表明所有AMF接种可以降低花生的发生率（花生Linn。）茎腐烂引起的Sclerotium rolfsii，包括接种丛枝菌根菌,Glomus Mossee,Glomus Clarum.,血管球caledonium,Glomus FasciCulatum.和Gigaspora Margarita.; 病情减轻37.8% ~ 盆栽试验条件下发病率为64.7%，病情严重程度降低30.6% ~ 现场测试47.2%[37.]. 刘设计温室试验，研究两种AMF的效果(g . intraradices和G苔藓科)对烟草抗病性的研究。结果表明，接种后烟草发绀的发病率和发病指数g . intraradices和G苔藓科与没有AMF接种的对照组相比减少[23.］．杰发现DNA水平F. oxysporum.在大豆植株根际和根际土壤样品中接种F. Mosseae.显着下降，表明这一点F. Mosseae.对此有很强的抑制作用F. oxysporum.[16］．目前，关于该机制的研究很少F. Mosseae.减轻根腐腐烂。在该研究中，大豆HN48（蛋白质类型）用作实验材料。研究如何机制F. Mosseae.减轻根腐，时间梯度取样方法用于计算和观察大豆根腐的发病率;有人发现F. Mosseae.有效降低了根腐病的发生率。这个结果与Gao是一致的[9］．

植物在受到各种病原菌和逆境因子的影响后，可以产生一定的防御机制来维持其正常的生长发育[48]. 植物抗病是一个复杂的过程，一些防御酶（如POD、PAL和SOD）的诱导是植物抗病最重要的生理生化机制。这些酶通过参与植物抗病次生生物量（如木质素、酚类和植保素）的代谢，或通过植物体内活性氧AOS的代谢，或直接抑制和杀死病原菌，使植物对病原菌产生抗性[6.］．POD活性的增加可以促进苯酚对醌的氧化，这对细菌有害。PAL是苯酚代谢的主要酶之一，它影响了酚类化合物的合成。SOD可以有效地清除氧自由基并保护细胞。在这个实验中，朋友用备受处理后上调局部生物合成途径的基因F. oxysporum.，这与Li和Ozlem的结果相似[21.,38.]. 然而朋友基因在用植物的根部下调F. Mosseae.．我们推测，当大豆根被病原体感染时，F. oxysporum.诱导神经递质表达上调朋友基因，但在效果之后F. Mosseae.，连作病害得到缓解，连作菌活性得到改善朋友基因减少。

异柠檬酸脱氢酶（IDH）可以催化异柠檬酸盐的氧化脱羧，以产生α-酮戊酸和二氧化碳，并减少氧化NAD（P）⁺它是三羧酸循环中的关键酶之一。它的活性对生物体的整个生命代谢有很大的影响。据报道，IDH在应对低温、干旱和盐胁迫中起着积极的作用[20.,25.］．在这个研究中，表达IDH公司TCA循环和谷胱甘肽代谢的基因在治疗后上调F. oxysporum.这与Leterrier等人对豌豆(Pisum一L.）在低温应激和机械损伤下叶，其中表达水平NADP-IDH分别增加了70和40% [20.]. 因此，我们推测IDH公司基因在植物抗逆性中起着积极的作用，保护细胞免受逆境胁迫可能是基因的重要生物学功能IDH公司．

本研究结果表明，病原菌对糖酵解、磷酸戊糖途径、TCA和氧化磷酸化等能量代谢均有影响。在外界环境应激下，磷酸戊糖途径的主要代谢功能减弱，其主要功能是调节碳源流向次生代谢途径，如合成植物抗毒素、木质素等次生代谢途径[18］．将6-磷酸葡萄糖脱氢酶（6-PGDH）吡唑纳温醇，并升高了磷酸磷酸盐途径中的2-脱氧-D-核糖1-磷酸和2-脱氧-1-α-D核糖磷酸盐，因此，我们推测，6-PGDH在植物疾病抵抗中的主要作用是将五种碳糖化合物赋予合成酚类化合物和其他抗性物质。此外，还提供了更多的NADPH降低功率，以改善植物抵抗致病性微生物感染[4.,35.]. 值得注意的是，这个结果表明F. Mosseae.通过增加ATP的生产加速了能量代谢。此外，观察到脯氨酸，2-氨基-3-甲基丁酸，精氨酸，甘氨酸，酪氨酸，葡萄糖-6-磷酸盐和各种有机酸的含量的积累。Compared with the CK and AF groups, there was a general decreasing trend in the levels of most amino acids in the F group, which indicated that the metabolic activity of the soybean roots was inhibited, similar to Van et al.’s study on the metabolic response of拟南芥(拟南芥根源[46.］．AMF能有效诱导大豆根系中氨基酸的积累。

植物通过一系列特定的受体和信号对病原体作出反应[28.］．偶联的丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）在从外部向电池内部传输信号时起着关键作用[3.］．研究表明拟南芥flg22的转录激活诱导受体样激酶1（frk1）、wrk22等下游靶点，从而引起自身防御[33.,40］．在该研究中，在CK与F组中显着调节钙依赖性蛋白激酶1，丝裂型蛋白激酶1和丝裂蛋白激酶1和丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶PBS1，表明F. oxysporum.可以诱导防御相关基因的表达并限制病原体的迁移，因此植物可以抵抗疾病。

本研究利用转录组学和代谢组学方法研究了连作大豆根系基因表达模式和代谢产物的变化。我们的结果显示F. Mosseae.显著降低了连作大豆根腐病的发生率，提高了这些作物的抗病性。此外，F. Mosseae.还可以促进抗性基因的积累，如PAL，CYP73A，CCR，CHI，和IDH公司和代谢物，如Daidzein，Isliquiritigenin，吡哆醇，异黄酮和其他代谢物。我们的结果不仅为揭示减轻大豆根腐腐蚀的AMF的分子机制提供了理论依据，而且还为生物药物的开发和应用提供了理论依据。

植物材料和接种方法

试验大豆种子（HN48）购自黑龙江省农科院（中国黑龙江省哈尔滨市），是黑龙江省广泛栽培的大豆品种。实验在中国黑龙江省哈尔滨工业大学糖业研究所实验站进行。大豆连作3年的土壤 实验中使用了年。

测试了F. Mosseae.我们的研究组被菌株分离，并储存在武汉微生物学研究所。中国。应变保存数量是否定的。CGMCC 3013.在种植之前，Alfalfa（苜蓿是用来繁殖F. Mosseae.紧张。被测病原体为F. oxysporum.是黑龙江省大豆土壤中的主要真菌，由黑龙江大学微生物科重点实验室提供。

样品处理和集合

实验用盆栽植物进行。土壤在121°C的高压灭菌锅中灭菌1小时，冷却至室温。用酒精擦拭大豆种子表面，5%次氯酸钠对表面消毒10min，然后用无菌去离子水冲洗4次，每次10 min。无菌种子置于50cm × 60cm花盆中5kg无菌土壤中。每个花盆里种了五颗种子，长大后保留了三颗幼苗。设置3个处理:(1)组(CK):在无菌土中播种大豆种子;(2) (F)组:在无菌土壤中播种大豆种子，播种后44天(大豆处于开花期)接种大豆种子F. oxysporum.根注射孢子悬浮液。（3）组（AF）：45克 F. Mosseae.接种剂与5 一公斤消毒过的土壤用来种植大豆，44公斤以后 天，大豆种子接种F. oxysporum.根注射孢子悬浮液。对于每种治疗，我们种植了20盆。从0-20cm的土壤深度从0-20厘米的土壤深度（播种后60天）收获大豆根。具体地，从每种处理中随机选择三种大豆根样品并储存在10ml离心管中并将其留到A-80℃的冷冻机中直至分子分析。

确定大豆根腐腐蚀的入射率和AMF的感染率

44岁 播种后第7天，每7天随机抽取不同根样 天。根据大豆根腐病分类标准计算根腐病发生指数，标准为：1级：散在病害；2级：散在性斑块；3级：病变面积占总根面积的25%；4级：病损面积占总根面积的30%，病损面积在茎周围连续，但根不坏死；5级：病变面积占总根面积的50%以上。根腐病发生指数计算公式如下：

酸性蛋白酶染色用于确定AMF定植率[30.]. 44岁 播种后第7天，每7天随机抽取不同根样 天。将大豆须根洗净，切成1 厘米，放在一个5 mL离心管。随机选取50～100根大豆须根进行染色、切片和镜检，观察各处理中AMF的定殖情况。定殖率的计算公式如下：

所有值表示为平均值±SD。通过分析方差（ANOVA）分析数据，然后使用SPSS 23.0进行Tukey的HSD测试，以确定不同治疗之间差异的意义（P < 0.05).

RNA提取和RNA测序分析

如Yu CJ等人所述进行RNA提取和测序分析。[56]. 采用Trizol法提取总RNA[32.]在大豆根腐病高发时期(播种后60天)。然后，用寡核苷酸(dT)富集真核mRNA，用Ribo Zero™Magnetic Kit (Epicentre)去除rRNA，富集原核mRNA。用片段缓冲液将富集的mRNA分段，随机引物逆转录成cDNA，合成第二链cDNA，用qiaquickly - pcr提取试剂盒纯化，末端修复，添加poly (A)，连接Illumina测序适配器。连接产物经琼脂糖凝胶电泳，pcr扩增，并使用基因Denovo生物技术公司(中国广州)的Illumina HiSeq™2500进行测序。

为了保证高质量的数据，对原始序列数据进行过滤，得到干净的数据，用于后续的信息分析。简言之，从测序序列中移除联合序列，并且移除所有A-碱基的读取；删除N比率大于10%的读取，并删除低质量的读取（质量值为Q的碱基数） ≤ 20人（占总阅读量的50%以上）。然后，每个样本的rRNA从读取中移除，并通过TopHat2定位到参考基因组（版本2.0.3.12）[17]分别是。校准参数如下：1）最大读取失配为2；2） 配对读数之间的距离是50 英国石油公司；3） 配对读数之间的距离误差为±80 英国石油公司[15］．使用边缘R包进行三组的差异基因表达分析（https://www.r-bogggers.com/its-easy-to-to-cite-and-reference-r/). 用FDR和log2FC筛选差异表达基因。筛选条件为FDR < 0.05和| log2FC| > 1.使用墨卡托网络工具对DEG进行注释[26.]然后加载到MapMan软件进行功能富集分析[45.］．之后，进行基因本体（GO）和基因组（Kegg）途径分析的基因本体（GO）和京都百科全书[34.,55］．

代谢组科分析

样品制备和代谢物提取

所有9种获得的样品（三种处理，三种生物重复）用于代谢组科分析。使用混合器轧机（MM 400，RETSCH）用氧化锆珠粉碎冻干样品，在30Hz下搅拌1.5分钟。然后，将100mg粉末称量，并在4℃下用1.0ml 70％甲醇水溶液萃取过夜，含有0.1mg / L利多卡因作为内标。在10000g离心10分钟后，吸收上清液并过滤（SCAA-104，0.22-μm尺寸;中国上海Anpel，中国，www.anpel.com.cn/)LC-MS/MS分析前。将相同体积的所有待测样品混合作为质量控制（QC）样品，以检测结果的再现性。

液相色谱电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS / MS）

使用LC-ESI-MS / MS系统（SCAA-104,0.22μm孔径，Anpel，Shanghai，China，China，China）分析提取的化合物分析www.anpel.com.cn/;Shim-pack UFLC岛津CBM20A，http://www.shimadzu.com.cn/;MS / MS（应用生物系统4500 Qtrap，http://www.appliedbiosystems.com.cn/）。将2μl样品注入水中Acquity UPLC HSS T3 C上₁₈柱（2.1mm * 100mm，1.8μm）在40°C下操作，流速为0.4 ml / min [58］．使用以下梯度分离化合物：95：5在0分钟的A /相B中;在11.0分钟的5:95期A /相B;5:95 A / PHIPE B在12.0分钟;95：5相/相b在12.1分钟;95：5期A /相B在15.0分钟[49,50]. 将柱出水连接到ESI三重四极线性离子阱（QTRAP）-MS。

点亮和三重四极（QQQ）扫描是在三重四极线性离子阱质谱仪（Q陷阱），AB SCIEX Qtrap6500系统上，配备了ESI-Turbo离子喷涂接口，以正离子模式操作并由其控制分析师1.6.1软件（AB SCIEX）。如Shahzad M等人所述设置的操作参数。[43.]. 监测模式设置为多反应监测（MRM）。

代谢产物的定性和定量分析

通过检索MassBank等公共数据库，对MS一级和二级数据进行定性分析(http://www.massbank.jp/），背包（http://kanaya.naist.jp/KNApSAcK/），HMDB（http://www.hmdb.ca/) [52]，motodb（http://www.ab.wur.nl/moto/）和梅林（http://metlin.scripps.edu/index.php) [59]（Zhu Zj等，2013）。k的重复信号⁺，na⁺，NH4⁺等大分子量物种在鉴定过程中被剔除。获得每个Q1（母体离子分子量）的精确m/z，以便于代谢物的鉴定/注释[53］．应用正交部分最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型的投影（VIP）评分的变量重要性用于在不同治疗之间进行最佳分化的代谢物。一种Pt检验值< 0.05和VIP ≥ 1用于筛选样品间的差异代谢物[49,50］．

在当前研究中生成的数据集可在NCBI序列读取档案（SRA）中获得，注册号为SRP240183。

上传：

超高效液相色谱法

MS / MS：

串联质谱

可见：

差异表达基因

AMF公司：

丛枝菌根真菌

开始：

基因本体论

Kegg：

京都基因与基因组百科全书

业务伙伴：

生物过程

曼氏硬度：

分子功能

CC：

细胞成分

CYP73A:

Trans-Cinamate单氧基酶

中央控制室：

肉桂CoA还原酶

朋友：

苯丙氨酸解氨酶

芝加哥：

Chalcone异构酶

CHS:

查耳酮合酶

豆荚：

过氧化物酶

草皮：

超氧化物歧化酶

AOS：

活性氧气

IDH：

异柠檬酸脱氢酶

6-PGDH：

6-phosphogluconate脱氢酶

地图：

丝裂原活化蛋白激酶

FRK1：

Flg22诱导的受体样激酶1

不适用。

本研究得到中国国家自然科学基金（31972502和3157048）的资助。资助机构编号31570487，支持在设计研究和收集、分析、解释资料及撰写手稿；但第31972502号文件的创始机构并未在其中发挥任何作用。

作者笔记

1. 吕成成和郭娜对这部作品贡献相同，共同为第一作者

从属关系

1. 黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省寒区生态恢复与资源利用重点实验室，哈尔滨，150080

   程程路、朝阳、孙海兵、蔡白燕

2. 黑龙江东大学食品与环境工程系，哈尔滨，中华人民共和国150086

   na guo＆bai-yan cai

贡献

NG和CL同样贡献这项工作并分享第一作者;NG构思，设计和执行实验;CL分析数据;CY和Hs画了图表;ng抛光稿件;BC写了这篇论文。所有作者阅读并认可的终稿。

通讯作者

对应于白燕蔡．

道德认可和参与同意

不适用。

同意出版物

所有作者都同意出版。

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

斯普林格自然保持中立，就管辖权的要求，在出版的地图和机构的联系。

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