转录组Cunninghamia lanceolata.雄性/雌性球果揭示了MIKC MADS-box基因与生殖器官发育的关系

背景

Cunninghamia lanceolata.（中国FIR）是针叶树家族山脉的成员，是中国木材生产最受欢迎的栽培树之一。正在持续研究进行改进c .生长状况育种价值。鉴于种子流产率高（胚珠和花粉发育失败的原因之一）c .生长状况，女性/男性锥体的正确形成可以理论上可以增加后代的后代数量。Mikc Mads-Box基因以其在花/锥体开发中的作用而闻名，并包括典型/非典型花卉开发模型，用于AgeniSperms和Gymnosperms。

结果

我们进行了转录组分析，以发现在一个精心确定的单一发育阶段，雌性和雄性球果之间的基因差异表达，重点是MIKC MADS-box基因。最终获得47个独特的MIKC MADS-box基因c .生长状况把这些基因分成不同的分支。47个mic MADS-box基因中有27个在雌球果和雄球果中有差异表达，大部分在叶片中不表达。在这27个基因中，大多数b类基因(AP3 / PI.)在雄球果中表达上调TM8基因在雌性锥体上调节。然后，没有明显的整体偏好AG)（C + D类别）基因在雌性/雄性锥体中，似乎这些基因似乎参与了两个锥体的发展。最后，少数基因如GGM7，高级副总裁，AGL15，这些基因在雌性/雄性球果中特异表达，使其成为性别特异性球果发育的候选基因。

结论

我们的研究发现了一些MIKC MADS-box基因，这些基因在雄性和雌性球果中表现出不同的表达c .生长状况，阐明了这些基因与c .生长状况锥的发展。在此基础上，我们假设了一种可能的锥发育模型c .生长状况．研究结果表明，雌球果和雄球果的基因表达存在差异，可用于研究与性别特异性球果发育相关的未知调控网络。

Cunninghamia lanceolata.（羔羊。）钩（中国冷杉）是中国南部最具商业中最重要的木材树之一。由于其杰出的木质性质和高增长率，它已经耕种数千年[1]，其种植面积占全国总种植面积的24% [2]．c .生长状况是一种单一的针叶树种类，具有分布在上冠和中间冠和中下冠和下冠中的阳锥体的雌锥[3.]．c .生长状况雌性/雄性锥体从经典的贪眼花很大（图。1一种）。具体地，雌性锥由苞片鳞片组成，其底部产生的胚珠。苞片鳞片将逐渐打开，然后将接受花粉以完成施肥（图。2c) [8]．在c .生长状况，雄球果聚集成一个复合结构，由几个球果组成，每个球果被许多小孢子叶包裹，其中包含花粉囊，花粉粒成熟后释放(图。2A和c) [8]．由于其较高的商业价值，c .生长状况由育种者不断改进。其中一个重要的繁殖目标是提高其繁殖效率;由于约50-70%的种子可能败育，这是其发芽率低的根本原因[9]．为什么种子中止尚未完全理解;两种可能的原因是花粉流产和异常胚珠发育[10]．因此，研究花球发育的分子机制是了解种子败育的潜在过程。

花卉发展是一种复杂的生物过程，受到遗传和环境因素的影响[11]．在Angiosperms中，经典的Homeicog ABC模型解释了局部基因表达如何能够控制花卉身份（A类基因，SQUA / AP1；B类基因,AP3，PI.；C类基因，AG))[12]．在最初的概念之后，ABC模型后来得到了扩展，增加了D类(D类基因，SHP，Stk.)[13]和E (E类基因，Sep1, 2, 3, 4)[14ABCDE模型，因为更多的基因参与其中。该模型的工作原理是，在发育中的花的特定区域中表达的每种同种异体基因(A到E)的独特组合，产生了特定的花组织类型[5]．例如，A和E类参与萼片形成，ABE的组合影响了花瓣发育，BCE控制雄蕊形成，CE影响CARPEL发育，DCE参与建立胚珠（图。1) (15，16]．然而，在裸子植物中，雌性和雄性球果的发育被认为仅受B类和C类蛋白质四聚体的控制[5，6]．然而，关于裸子植物花同种异体模式仍然存在两种不同的观点:B(C)系统(图。1b)和(A) b (C)系统，其中(C)代表C + D类，(A)代表A + E类[5]．

除了AP2基因，属于ABCDE模型的基因是MADS-box基因家族的成员，在花器官发育中具有重要的功能[17]．所有Mads-Box蛋白质都有一个高度保守的领域，疯狂的域，可以分为两个主要谱系：I型（SRF样）和II型（MEF2类似），基于序列保护[7]．这两种MADS谱系都可以在植物、动物和真菌中找到。然而，有一些特殊的结构，如K域，只有在植物的II型MADS-box基因中才发现(图1)。1c;从图重画。1（https://www.pnas.org/content/97/10/5328）“版权所有（2000）美国国家科学院，U.A.”）[7]．到目前为止，在植物花卉发展中，II型疯子箱基因已经更彻底地研究了它们的功能[18]．植物II型MADS-box基因的一个显著特征是，它们比I型MADS基因多包含三个结构域:介入(I)结构域、角蛋白样卷曲卷曲(K)结构域和C端(C)结构域(图1)。1c) (19]．高度保守的MADS结构域是该基因家族的主要特征之一，它决定了DNA的结合和二聚[20.]．K结构域可能介导蛋白质之间的相互作用，也可能参与与其他蛋白质的直接相互作用[20.]．MADS域和K域由一个短的中间I域连接[21]．在一些疯子箱中，C末端区域参与转录激活或三元复合物形成[22，23]．这些基因被归类为mikc型，是植物特有的[7]．

以前的研究c .生长状况主要关注形成层活性的调节[24， EST-SSR标记开发[25，26，27]，与生长和发展相关的基因[28]纤维素和木质素生物合成[29]和早期种子发育的蛋白质组分析[1]．到目前为止，关于其女性/雄性锥发育的分子机制很少。在这里，我们进行了RNA-SEQ转录组方法以鉴定差异表达在未成熟的女性和雄性锥之间的基因c .生长状况．本研究为裸子植物球果发育相关基因的研究提供了有价值的资源，并可能为今后杉木改良项目中增加种子数量的培育提供帮助。

植物材料

本研究于2月下旬在两棵不同的单株活树(3 - 15-31,4 - 9-31)上采集了未成熟的雌球果和雄球果c .生长状况克隆(6421)(24]．这些树种位于中国福建省杉木国家种质资源库洋口森林站。该站与南京林业大学有合作关系。为了避免样本差异的影响，雌/雄球果在树中以相似的状态和高度进行采样。雌球果的采集状态是被绿色鳞片覆盖，苞片稍开。2b），而阳锥是由几种斯特罗基（图。2a).此时胚珠已经出现，但尚未完全形成，花粉也是如此。样品的正式鉴定由作者郑仁华负责。然而，据我们所知，没有植物标本馆存放这一特定材料的凭据标本。为了进行转录组学分析，雌性/雄性球果立即在液氮中冷冻，并保存在−80°C，直到RNA提取。为了进行SEM分析，采集新鲜球果，用2.5%戊二醛(0.1 M PBS, pH 7.2)固定。所有材料均经许可获得。

扫描电子显微镜

用0.1M磷酸盐缓冲液冲洗2.5％戊二醛的雌性/雄性锥，使用一系列分级乙醇溶液脱水，使用临界点烘干机（K850，Emitech，England）干燥，在短柱上安装双面胶带，并在溅射涂餐（E-1010，日本，日本）中涂有耳云。在Quanta 200扫描电子显微镜（Fei，America）上观察样品[30.]．

RNA提取和mRNA图书馆建设

根据制造商的说明，使用乙醇沉淀方案和CTAB-PBIOZOL试剂纯化总RNA。总RNA由NanoDrop和Agilent 2100生物分析仪(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)进行质量控制和定量。用寡聚物(dT)附着的磁珠纯化mRNA。然后将mRNA片段化，然后使用第一链反应体系生成第一链和第二链cDNA。然后，将纯化的cDNA与特定的适配器序列连接。用PCR扩增cDNA片段，用Ampure XP Beads纯化。采用Agilent 2100生物分析仪和ABI StepOnePlus Real-Time PCR系统对样品库进行定量和质量控制。文库随后使用Illumina HiSeq 4000平台(华大基因深圳)进行测序(reads长度为151 bp)。测序后的reads保存在NCBI Sequence Read Archive (SRA)中，注册号为SRR10161401、SRR10161402、SRR10161403、SRR10161404。

转录组数据组装和功能注释

首先过滤原始数据以获得高质量的清洁数据。适配器序列，低质量读取（我们将低质量读取为具有超过10％的基础的低质量读数，并且从原始读取中删除了超过5％的基地的读数。然后通过FASTQC V0.11.7控制的质量清洁读数[31]．通过运行trinity（v2.0.6），通过序列之间的重叠延伸到contigs中的清洁读数[32]．然后，根据配对结束序列信息，将CONTIG组装成转录序列。

将装配后的unigenes的编码区域分别标注到多个公共数据库中，使用TransDecoder对其进行注释，然后使用blastp算法[33]对UniProt_sprot进行了运行[34]和HMMER数据库与pf - a。hmm(隐马尔科夫模型)[35]鉴定保守的蛋白质。

通过blast对蛋白质序列进行功能注释拟南芥，杨树trichocarpa，奥雅萨苜蓿，瑞士Prot [34]．最终基因本体论（GO）[36]注释结果合并来自两者的数据答:芥和p . trichocarpa．由于我们对转录因子(TFs)特别感兴趣，我们在注释过程中添加了一个基因类型参数。在所有情况下，BLAST算法[33]应用了不大于10的电子值参数⁻⁵．

差异表达分析

通过使用RSEM将清洁读数映射到Trinity转录程序组件来估计基因表达水平[37]对于每个样本。所有基因的丰富是通过FPKM方法使用唯一映射读数的标准化和计算的[38]．软件边缘器[39用于鉴定差异表达基因（DEGS）。所结果的P- 通过多次测试方法调整虚假发现率（FDR）的阈值[40]．筛选显著差异表达基因(上调和下调基因)的条件为FDR < 0.01和倍数变化> 2。一个R包用于可视化结果和阅读分散。显著的DEGs也通过TopGO R包进行了GO富集分析[41]．为了检测哪些转录因子家族在这个发育阶段显著富集(p值< 0.01)，使用卡方检验。

MADS-box转录因子和DEGs的鉴定及系统发育重建

识别c .生长状况MADS-box序列，两个报道的隐马尔科夫模型剖面SRF (PF00319)和K-box (PF01486)均来自Pfam [35]．使用hmmer软件[42]，并得到了过滤条件E-value≤1.0E-04的候选序列，然后使用SMART对序列进行进一步验证[43]．

为了准确地识别不同表达的MADS-box基因的雌/雄锥体c .生长状况，用edgeR分析包将低表达的MADS-box基因从DEG列表中剔除[39]，留下27个疯子箱子的unigenes。R包Pheatmap（1.0.12）和Mega 7.0用于分析表达水平并构建系统发育树，其显示为热图簇。一岁的叶子的序列原始数据[44]从NCBI Sequence Read Archive (SRA)数据库(SRX2586190)下载，作为营养器官表达比较。

MADS-box序列答:芥，o .漂白亚麻纤维卷和葡萄从植物转录因子数据库中获得（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php)，而序列日本柳杉粳稻，挪威云杉，Pinus Taeda.（http://congenie.org)分别从Futamura等人的三篇文章中获得[45， Carlsbecker等人[46和Chen等人[47]．所有引用序列在附加文件中列出1．随后，使用MAFFT对多个序列的全长进行对齐[48，之后的RAxML v8.2.11 [49]构建了PROTGAMMAAUTO模式和100个bootstrap复制的系统发育树。为了支持系统发育分析，对MADS-box基因M, I, K, C结构域进行比对葡萄球菌，冷杉杆菌，P. Taeda.，C. japonica.,c .生长状况被Texshade选中并显示[50]．

QRT-PCR分析

选择了几个疯狂箱基因以验证我们的DEG检测。使用生物植物总RNA提取试剂盒（RP3301）从未成熟的雌性/阳锥中获得总RNA（RP3301），仅通过CTAB替换裂解缓冲液。通过凝胶电泳（1％凝胶）测定总RNA完整性，使用NanoDrop-2000分光光度计（Thermo，Inc。）测定RNA浓度。使用Vazyme标记第1链CDNA合成试剂盒（R211-02）通过逆转录酶方法合成cDNA，然后使用QUBBit 2.0（Invitrogen）进行定量。使用vazyme aceq QPCR Sybr Green Master混合物（没有Rox）（Q121-02）在Lighcycler 480i（Roche）上一式三份进行定量实时PCR（QRT-PCR）反应。基于三次技术和生物学重复进行基因表达分析，并与参考基因标准化CleIF3．表达数据采用Livak计算方法计算，表示为log (2^-ΔΔct)[51]．

雌球果和雄球果发育于c .生长状况

种子流产是一个不可忽略的方面c .生长状况繁殖。提高品种的育种价值c .生长状况因此，有必要对球果发育的分子机制进行研究。更糟的是c .生长状况是一个裸子植物，其雌性/雄性锥的结构与高昂的花朵的大大不同（图。1一个和无花果。2)[52]．为了更好地了解其形态特征c .生长状况女性/雄性锥体，我们使用扫描电子显微镜（SEM）观察雌性和雄性锥，特别是观察胚珠和花粉。在我们采样的阶段，每种雌性锥体含有大量的苞片鳞片，在苞片尺度的底部处具有排卵，并且位于排卵等级的2-3个胚珠（图。3.b）。裂片，nucellus和整数（图。3.c）已经形成但尚未完全分化，每个胚珠的一个排卵尺度的一个叶子（图。3.c) (30.]．雄性锥由大量的微麦基组成，一个在中心位置和周围螺旋布置中的残留物。每个microclecophyll都携带2-3种花粉囊（图。3.d e)。每个花粉(无花果。3.f）含有花粉孔径。

序列组装和注释c .生长状况

接下来，我们进行了整个转录组的方法来鉴定差异调节的成绩单，在雌性和公锥体的发育过程之间进行差异c .生长状况．因此，我们从全雌性/阳锥体中分离出总RNA，并使用Illumina测序技术来确定转录组。我们总共获得了22,188,695（F3女性，从树3-15-31），18,114,397（F3男性，来自树No.3-15-31），18,731,606（F4女性，来自树No.4-9-31）和22,054,735（F4男性，来自树No.4-9-31）的每个图书馆的原始读取（表S1）.经过过滤和去除适配器和低质量序列后，22123838 (F3母序)，18051760 (F3公序)，18299131 (F4母序)和21990476 (F4公序)清除读取(表S1）保留了进一步的大会。总共产生24.14GB RNA-SEQ数据。我们总共组装了97,856名转录物，其葡萄藤N50长度为1925年的BP和63,223个unigenes，具有1721年的折叠N50长度（表S）2）.所有转录物和unigenes的中位数斑纹长度为784bp和620bp，所有转录物和unigenes的平均长度分别为1228bp和1066 bp（表S2）.所有63,223个组装的unigenes(表S2)，共鉴定出2117个转录因子(表S3.）.

雌性和雄性球果的差异基因表达

为了鉴定特异性差异表达的转录本c .生长状况雌球果和雄球果处于同一发育阶段。在所有组装的unigenes中，剔除了低表达水平的unigenes，得到18045个unigenes。我们以FDR < 0.01和Fold Change > 2为筛选标准筛选这些单基因。然后，我们进一步用GO术语和功能分类对这些基因进行了表征。我们发现5016个unigenes明显差异表达，其中2506个unigenes下调表达，2510个unigenes上调表达。4）.

致富集分析成功地将上调/下调的未经内衣2217/2168分为三个GO子组（图。5）.我们分别绘制了每个子组的前20个富集的阶段。下调基因（雄性<雌性，冷调）参与DNA复制（BP），核（CC），蛋白质结合（MF）等，而上调（男性>雌性，温调）基因参与花粉外膨胀形成（BP），细胞壁（CC），氧化还原酶活性（MF）等（图。5）.这些结果表明，雌球果在生长旺盛时期细胞分裂活跃，而雄球果则主要参与花粉发育。

专注于我们之前确定的2117c .生长状况我们发现三个基因家族显著富集(P< 0.01): AP2, myb相关，和MADS-box(表1）.MADS-box基因的显著表达c .生长状况在其他植物中，球果发育与花的形成过程是一致的，表明该基因家族在花的形成过程中起着重要的作用c .生长状况也

mikc mads-box转录因子c .生长状况

使用上面的方法，我们终于获得了47个独特的Mikc Mad-Box基因c .生长状况(表4）基于先前的研究，将这些基因分成几个分支（图。6一、表2和s4)[46，47，53，54]．同时，MADS-box蛋白结构域的比较结果C. Lanceolata，P. Abies，P. Taeda和V.Vinifera，使系统发育分析可用（图S1）.

中可以找到大多数MADS分支c .生长状况,就像AP3 / PI.（b级），9月(类E),AG)（c级），STK / SHP.（d级），参与花器官身份[16]．然而,树枝像FLC，BS.，富裕和AP1（A类）找不到。这可以通过在所选时期期间这些同源基因的低表达来解释。另一种可能的原因是c .生长状况基因组不含这些基因。由于没有某种典型的花卉结构，花器官身份相关基因，喜欢AP1这有助于在Agiospers中有助于萼片和花瓣形成，在进化时间期间可能会丢失。具体情况下这种潜在的基因损失需要进一步研究来说明。

相反，一些疯子分支，就像TM8基因，不是在拟南芥和赖斯，但可以在c .生长状况，C. japonica.［45]，V. Vinifera.［53]．这些结果表明TM8基因是在高血管植物和裸子植物的共同祖先中建立的，并且在一些植物谱系的相对近期的演化历史中，它们已经独立丢失了[55]．

我们还发现了少量的MIKC MADS-box基因，这些基因可以归类到GGM7分支中，而在被子植物中没有发现[46]．相比之下,AGL15和AGL12基因在c .生长状况,Pinus Taeda.［47]，以及服直者等答:芥［56),V. Vinifera.［53，表明这些基因可能在被子植物和裸子植物的花/球果发育中具有重要的功能保守性。与此同时，有一种基因不能被归入任何分支。我们在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）使用BLASTP并发现它是部分身份AG-like基因。然而，在我们的系统发育树中无法得到分类。因此，我们用它的编号命名它:MADS41，这使其成为一种新的候选基因。

mikc mads-box degsc .生长状况女性和雄性锥体

接下来，我们使用我们的差异基因表达数据来确定哪些MADS-box基因在雌球果和雄球果之间有差异表达，使用来自叶片的表达数据作为非生殖组织的比较。我们推断，参与生殖器官发育的基因应该在这些器官中更具体地表达。47个人中c .生长状况Mikc Mads-Box基因，27个基因在阳性和雌性锥体之间差异表达，其中18（27分）不在叶片中表达，9（27个）在叶子中没有显着表达。（图。6b及表S5）.大多数B级基因（AP3 / PI.）（4）在雄性锥上调节，类似于在其他植物物种中进行的先前研究中发现的内容[57，58),而TM8基因在雌性锥形的较高水平下显然表达，并且更有可能参与女性锥发育。

因为我们发现了一些AG)（C + D类别）基因在雌锥中的雄性锥和其他基因上上调，似乎这些基因似乎参与了任何锥体的发展。我们确定了三个9月（e）和四AGL6基因c .生长状况．然而,9月基因表现出非常低的表达水平，这是很难确定他们的差异表达在锥。然而，我们确实找到了两个AGL6在女性和雄性锥体中表达的基因。事实上，在我们收集的阶段，AGL6基因在雌锥中显示出更高的表达水平。

GGM7根据系统发育树，基因可以细分为2类：DAL10-like和DAL21-like．它们在雌性和雄性锥体中有不同的表达模式P. Abies.［46)，以及在c .生长状况．而在答:芥AGL15在叶、花序、花药和花粉中表达[59];高级副总裁表达于幼叶、花原基和早期共花期[60]，AGL15和高级副总裁的雄性和雌性锥体中都高度表达c .生长状况， 分别。除了，MADS41是一个特别的基因，没有明显分类。但其雌性锥体中的高表达水平，使其成为可能参与女性锥发育的候选基因。

的验证c .生长状况女性/男性锥体转录om

为了验证雄性和雌性球果库的差异，我们选择了有限数量的球果库c .生长状况来自差异表达基因名单的MIKC MADS-BOX基因（表S.5）在整个锥体RNA上进行QRT-PCR分析（图。7）.该组包括已知在模型生物中涉及Carpel或雄蕊发育的基因（AG) AP3 /π），以及在某些高昂（如拟南芥和米饭）（TM8）.

这些结果与RNA-SEQ数据密切一致，例如，表达水平ClMADS34雄球果的基因表达量约为雌球果的100倍ClMADS10在雌性球果中是雄性球果的近10倍，这与转录组数据的结果一致，提示了我们的转录组分析数据的可靠性(图1)。6b和无花果。7）.

作为一种重要的木材品种，c .生长状况再现一直是通过育种计划提高的特征之一。种子流产是一种常见的发生c .生长状况而不正确形成的胚珠和花粉可引起。在这里，我们研究了分子机制c .生长状况通过转录组分析的球果发育。

基于这些数据，我们进行了顺序分析，以确定女性和男性锥体之间的差异，然后我们专注于疯子箱基因家族c .生长状况揭示可能涉及的特定基因c .生长状况锥形发展与裸子植物中ABC模型的表现。

我们发现B类，C，D和E基因c .生长状况并且对于那些在雄性或雌性锥体中显着上调的那些基因，主要是在叶子中表达。B类基因，AP3 / PI.（ClMADS44, 45, 46, 47)主要在雄球果中表达上调，最可能影响雄性器官的发育。类似的结果在被子植物中也有报道Quercus Suber.［57和裸子植物C. japonica.［61例如，CjMADS1b型MADS-box基因在雄球果中表达C. japonica.．在挪威云杉中发现，b型MADS-box基因在雄性器官原基中具有活性[62]，与被子植物中的b类基因同源[63]．这些结果表明，b型基因在裸子植物和被子植物中都有保存，可能在整个种子植物中都有保存。

C类和d类基因不能被明显分离c .生长状况，并在两个生殖器官中表达。AG)在两个锥体中表达的基因P. Abies.［64),Gnetum gnemon［65)(裸子植物)。这与Quercus Suber.(被子植物)，其中c类基因在雄花和雌花中表达水平相似[57]．这些结果表明，这些C型基因可能在裸子植物和高管培养中起着类似的作用，这是女性和男性锥形/花开发的供应[4]．不幸的是，我们无法识别E-Class基因的表达，因为它们在雄性或女性锥体上没有显着表达。因此，我们推测在这种发展过程中没有必要的级别基因。

此外，我们确定了表达AGL6基因c .生长状况，在雌球果和雄球果中均有表达，在雌球果中表达量较高，但在叶片中不表达，与它们的同源基因的表达模式相似G. Gnemon.［65]．GGM7基因引起了我们极大的关注，因为它们只存在于裸子植物中[66]．在P. Abies.， 这GGM7分支包含2个基因:DAL10和DAL21．DAL10在球果和花粉球果中特别活跃[66),而DAL21在雄性锥或营养芽中未检测到，但在雌性锥体的排卵量表中。意味着，ClMADS 30,31,32，被分为DAL21在雌球果中表达量明显较高，而在雄球果和叶片中表达量不高，具有相似的表达模式那在P. Abies.．但当涉及到DAL10基因。DAL10基因（ClMADS 39、40)c .生长状况在雌球果和雄球果中均有表达，雌球果中表达更高。这反映了不同物种的基因既有功能保守性，也有功能分化性。

AGL15和高级副总裁基因充当花卉过渡的阻遏物答:芥［59，60),而在c .生长状况，AGL15和高级副总裁在男性和女性锥体中高度表达。这可能是一个有趣的研究问题，可能意味着中国冷杉中类似的抑制剂，限制了锥体的发展范围。

此外，我们鉴定了几种可能在女性锥发育中发挥重要作用的基因。我们检测到TM8在雌性锥体上全调节的基因，基本上没有用叶子表达。研究人员发现了大肠茅，EGTM8在早期和晚期的花蕾[67]．在番茄中，TM8可能对子房和果实的形成很重要[68]．Gramzow等人[69)表明,TM8基因可以在许多裸子植物中发现，但很少的研究揭示了它在裸子植物的器官开发中的功能。考虑到胚珠和花粉c .生长状况收集时仍处于发育阶段，我们推测这些基因很可能影响胚珠发育，可以进一步研究。

基于我们的研究结果，我们倾向于同意Theißen等人提出的裸子植物球果发育的B(C)模型[5)，其中A类和e类基因可能与球果发育无关。为了验证该模型的适用性c .生长状况，需要更多的实验来确认B（c）基因的功能，并排除其他基因（A，E-Class基因）的累积。以一般的方式，我们通过过表达和敲除该物种中的这种基因来研究基因功能。不幸的是，成熟的转基因系统c .生长状况尚未开发出来，并且在这种物种中进行转基因实验将具有额外的缺点，即木质植物的开花需要很长时间。因此，例如，应该考虑其他方法，例如，表达c .生长状况模式生物的b型基因拟南芥，从而研究这些基因的功能保存程度。但必须强调的是，基因功能研究最终将回归物种本身。然而，考虑到转基因裸子植物产生的困难和其漫长的代期，这些研究需要大量的时间和精力。

由于材料选择的限制，我们的结果仅限于一定发育时期的雌、雄球果差异基因。虽然通过我们的研究确实发现了一些值得注意的基因，但可能丢失了一些有关球果发育的信息，无法获得这些MADS-box基因参与整个发育过程。进一步的研究可以监测从球果起始到雌球果受精的整个发育过程，可能发现所有涉及的MADS-box基因，并进行更完整的解释。

综上所述，我们对雌性和雄性锥体进行了RNA-Seq分析c .生长状况并分析了雌性和阳锥之间的基因表达差异。我们确定了47个mikc mads-box基因c .生长状况，并鉴定了一些与球果发育相关的MADS-box基因c .生长状况，可能符合前一个B（c）型裸子植物模型。我们还确定了可能在女性/男性锥形发育中发挥重要作用的额外基因。此外，我们提供了一个基因数据库，其显示了女性和雄性锥之间的差异表达，可以用作在未来发现未知的监管网络的基础。

本研究中产生或分析的所有数据均包含在文件和NCBI SRA数据库(登录号SRR10161401、SRR10161402、SRR10161403、SRR10161404)中，可通过联系通讯作者(chenjh@njfu.edu.cn）.

FPKM:

每千碱基中的片段每百万次读取

RSEM:

期望最大化的rna测序

磨边机:

数字基因表达数据的实证分析。

作者希望感谢编辑和审稿人提供的有用的评论和建议。

该研究得到了江苏林业局（Lykj [2017] 42），江苏省重点研发计划，中国的自然科学基金（31770715），江苏省清兰工程，杰出教授项目（31770715）作者：王莹，江苏省高等教育机构与优先学术课程开发。这些融资机构没有在收集，分析，数据解释以及写作稿件中发挥任何作用。

隶属关系

1. 2 .南京林业大学华南林业可持续发展协同创新中心，林业遗传与生物技术教育部重点实验室，江苏南京210037

   丹丹王，赵东昊，小飞龙，威辉吴，冀士和金辉陈

2. 福建林业学院，福州350012

   仁华郑

3. 2 .合肥师范大学生命科学学院，合肥230601

   王展君

4. 2 .福建洋口林场杉木国家种质资源库，福建顺昌353211

   雪岩郑佳丹

5. 2 .南京林业大学生物与环境学院，江苏南京210037

   你们彭

6. 上海大学生命科学学院，上海市能源作物重点实验室，上海，200444

   向阳胡

7. 南京林业大学南京南京林业大学可持续林业联合创新中心，南京210037

   Guibin王

贡献

D.D.w为此工作数据分析，实验表演和写作做出了贡献。J.H.C和JS.S设计了这项工作并提供了修改建议。z.d.h写了分析代码，并使用x.f.l，z.j.w和y提供了编辑建议.P提供了锥结构标识支持。r.h.z，x.y.z和d.q.y执行了实地工作和收集的样本。W.H.W帮助数据执行。x.y.h和g.b.w提供编辑建议。所有作者都读过并批准了稿件。

相应的作者

对应于金汇陈．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

利益争夺

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

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