配子体和胚胎生细胞：了解生殖日历gydF4y2Ba塞浦哌米日本人gydF4y2Ba研究。(杓兰科，兰科)，东亚特有的一种女鞋兰gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

属gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2BaL.是杓兰亚科的五个属之一，其中的成员通常被称为女鞋兰。gydF4y2Ba塞浦哌米日本人gydF4y2Ba是一种多年生草本植物，原产于东亚，特别是中国、日本和韩国。由于其有限的分布，该物种被列入世界自然保护联盟红色名录的濒危类别。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们研究了配子体的发育，包括完整的胚胎发生gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba．完整的生殖周期是根据我们的观察提出的。花药在土壤下开始发育，花粉母细胞减数分裂在开花前3周开始，可能在4月初。大孢子母细胞在5月初授粉后发育，6月中下旬成熟。胚囊形成模式为双孢型，有6个核:3个形成卵器，2个极核和1个反足细胞。三次受精产生胚乳核，当原胚达到8 - 16细胞阶段时，胚乳核退化。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

配子体与胚胎发育特征的总体比较gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba建议以前关于胚胎学的报告gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba不足以表征整个属性。基于可用信息，已经制备了一种生殖日历，显示出导致胚胎形成的关键生殖事件。gydF4y2Ba

兰科和菊科是开花植物中最大的科之一[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．兰花分类群表现出一种不寻常的胚胎发展模式，悬浮船的多样性形态是全家最鲜明的特征之一[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．兰科植物的胚柄发育、多胚模式和巨配子体发育的多样性为研究兰科植物胚胎学的植物生物学家提供了持续的兴趣[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．兰花中的悬浮症形态的异常不同模式激动人心的游戏[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]构思兰科的胚胎发育分类方案。此外，花药通常比兰花种类中的胚珠更早地发展;在授粉，当含有完全开发的营养和生成细胞的花药释放成熟花粉颗粒时，胚珠尚未产生兆多孔母细胞（MMCS [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba])。有人认为，授粉激活了胚珠的发育，之后植物需要数周的时间来产生雌配子[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．张和奥尼尔[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]认为，兰科中普遍观察到的胚珠发育时间较长使得兰科成为胚胎学研究的一个有趣的课题。gydF4y2Ba

属gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2BaL.是塞浦路斯亚科的五个属之一，俗称女式拖鞋[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba]．栖息地破坏和覆盖率都有人口统计影响，导致人口的下降和区域灭绝gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Baspp。gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba]．另一方面，鲜花的低转化率仍然是现有种群生殖生态的主要问题gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Baspp。gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba]．该组的所有物种都有一个像袋状的唇，两个肥沃的雄蕊，盾牌类雄蕊和具有融合的侧萼片的Synsepal，并且这种特定的花卉形态并不为粉丝器提供轻松奖励。Cypripedioideae兰花的独特特征是单向陷阱花，它提供了传授师的固定和单向路线（见[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba])。尽管有固定的传粉路线，但对传粉者而言，鞋兰在食物模仿特征，如气味、颜色和花朵大小等方面表现出了显著的多样性[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

属gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba包含大约45-50种，主要在北半球的温带区内发现，主要是在亚洲和北美的温带地区，延伸到喜马拉雅地区和中美洲[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．东亚是该属植物多样性的中心，共报道38种;尤其值得一提的是，仅中国就有这种植物的惊人多样性，有36种，其中25种是特有的[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．许多种类的gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba在过去的几个世纪里，由于过度开采和非法贸易，北美和欧洲已经变得罕见[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]. 的状态gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba在东北亚没有什么不同。二十四个亚洲人gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba目前包含在IUCN红色列表的濒危或批判性濒危类别中[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]．此外，“濒危野生动物群和植物群（CITES）的国际贸易公约目前列出了所有gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2BaCITES附录II的物种[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

塞浦哌米日本人gydF4y2Ba研究。是濒危的东亚鞋兰的特有种，分布在中国、日本和韩国。它生长在森林中潮湿和腐殖质丰富的土壤中，或在海拔1000-2000米的沟壑荫凉的山坡上。由于其在自然栖息地的有限分布和小种群数量，该物种在韩国被列为极度濒危物种(尽管它在全球范围内处于濒危状态)[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba]. 相应地，在中国和日本，由于栖息地的丧失和人为活动，如出于园艺和医疗目的过度采集，该物种面临灭绝的高风险[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

植物生殖生物学的经验知识，特别是稀有兰花，可以帮助我们确定补充周期的不足是否控制了成功繁殖和抑制种群增长[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba]．最近努力研究授粉生物学和生殖特征gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．在二十世纪初，节奏[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]在属中写了一篇全面的施肥叙述gydF4y2Ba塞浦保纤维，gydF4y2Ba虽然gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba还没有经过验证。后来，Sood和Rao [gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba研究…的胚胎学gydF4y2Ba塞浦哌克丁gydF4y2Ba并证实，该物种中的胚胎学特征和果皮结构是典型的兰基类型。虽然大多数兰花遵循胚囊发育的一次孢子模式[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]，双斑模式已被描述为gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba和gydF4y2BaPaphiopedilumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]．而Pace的反足细胞没有进行结构或发育检查[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba报告，Poddubnaya-Arnoldi [gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]描述了在一些中经历二次乘法的良好的脱脂细胞gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba种此外，大多数兰花未能形成一个功能胚乳，虽然在一些物种中有一定程度的胚乳发育具有多核阶段的报道[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．这种不能形成三倍体胚乳是兰花种子发育的独特特征之一。近年来，针对不同兰花品种的胚胎学进行了多项研究[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．但是，对胚胎和生殖生物学知之甚少gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba．对配子体，胚胎和种子发展的知识对于了解这种濒危兰花中的成功繁殖并制定恢复策略至关重要。gydF4y2Ba

我们对这种流行的女鞋兰的胚胎学和种子形成过程进行了详细的研究。本研究的主要目的是(1)研究人工授粉过程中雌雄配子体的发育情况gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba；（2）了解施肥，胚胎和种子开发过程gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba；(3)建立一个完整的物种繁殖日历，显示导致种子发育的关键繁殖事件。gydF4y2Ba

Microsporogenesis和microgametogenesisgydF4y2Ba

花药分两瓣，四孢子囊状(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一种）。在成熟之前，花药壁包含五个或六层：表皮，内皮，两三个或三层中层和绦虫（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab）。不幸的是，由于缺乏年轻的花药，我们无法确认花药墙发展的过程。Tapetum是腺体，其细胞在整个发育过程中没有内核（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB，D）。中间层同时脱果，孢子四纹/多亚也产生自由孢子（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaF）。同时，径向膨胀之后是内皮细胞中纤维增厚的发展，并且个体细胞变得高度稳定（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf).与此同时，内皮细胞的细胞核开始退化，当花粉粒进入双核期时，这一过程完成(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag、 h）。当花药膨胀时，表皮细胞切向伸长，其细胞核在孢子形成之前或之后退化。表皮和药室内壁都是持久的（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag、 h）。在成熟花药中，表皮具乳突，在花期外表面变得发亮和粘稠，边缘呈深褐色（田间观察）。gydF4y2Ba

孢子素细胞在花药叶中形成弧形结构，其区分为微孔母细胞（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa, b).小孢子母细胞进行减数分裂，产生小孢子。小孢子四分体的胞质分裂始终是同时进行的，所形成的四分体是四面体、等边体、t形体或线性体。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac, d, e).小孢子有丝分裂不均匀，生殖细胞较小，呈椭球形，营养细胞较大，细胞核圆形;因此，花粉粒在开花期是双核的(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba虽然有些花粉粒在花药内发育成花粉管，但也有可能在授粉前不发生进一步分裂(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bai） 是的。花药开裂发生在同一裂片的两个腔之间的一个共同的纵向狭缝中（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaG）。gydF4y2Ba

胚珠gydF4y2Ba

在子房的胎心脊中，每一个分枝的珠心丝由大约4到7个珠心细胞组成，被一层珠心表皮所包围。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。最顶层的Nucellar Cell被扩大并用作拱起的细胞。同时，整形表开始于Nucellar Welament中启动。胚珠原基中的整形器的起源是皮肤的（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab, c).内被首先分化，形成两层细胞，最终在受精前形成珠孔。外被皮分化稍晚，但与内被皮的方式相似，受精后生长在内被皮以外。在此期间，珠心丝有规律地增殖并开始向胎盘脊向后弯曲，最后表现出倒生状态。因此，成熟胚珠在性质上是细珠心，双珠心，倒生的。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB，D）。gydF4y2Ba

巨孢子发生和MegagameTogenesisgydF4y2Ba

单个拱起的细胞尺寸增加并且直接用作MMC（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）。进一步扩大MMC之后是减数分裂分裂的第一阶段以形成两个二元细胞，其中仅脱氨基细胞是官能的（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaD-F）。Dyad的微囊细胞很快退化，可能在第二减数分裂划分之前或之后，并且整个胚囊发育发生在二元的苔类细胞中。与微囊细胞的退化一起，Dyad的功能性脱氨基细胞变大并伸长（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaG）。二氧化碳的丘脑细胞中的第二个减数分裂分裂产生两种原发性兆孔核（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaH）。第二减数分裂分裂紧接着，然后通过将核转移到细胞的相对极（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bai).功能大孢子在孢子内萌发过程中形成一个大液泡，导致细胞核向两极移动。初发珠孔核和合点核的第一次有丝分裂发生在核完全移向另一端后，形成一个四核胚囊，每一端有两个核(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).在这个阶段，两个珠孔核进行第二次有丝分裂，形成四个核，但两个合点核没有进一步分裂(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).因此，成熟的胚囊包含6个核(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC）。四个微囊核形成卵细胞，两个合酶和一个极性核，而两种脱氨基核形成极性核和抗映核细胞（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad）。gydF4y2Ba

授粉和施肥gydF4y2Ba

花药比胚珠早成熟得多。成熟的花药呈黄色，表皮外壁有光泽，有粘性。这些花于5月2日至5日进行人工传粉。花药的粘性表面帮助花药附着在柱头上。授粉时，花粉粒为双核，花粉管开始发育。相比之下，珠心丝要么刚刚准备好，要么还没有准备好组织原孢子细胞。生殖核可能在花粉管内分裂，形成两个雄配子。传粉后，花粉管沿花柱生长。我们不能观察花柱管中花粉管的生长。授粉后第21天，胚囊进入2个核阶段，胚叶上出现大量花粉管。 An entangled mass of pollen tubes remains near the placenta cells until megasporogenesis is complete. Fertilization occurs almost 7–8 weeks after pollination (WAP). Fertilization is porogamous: the pollen tube enters the ovule through the micropyle, resulting in a diploid embryonic zygote by fusion of one male gamete with an egg and a triploid endosperm zygote after the fusion of one male gamete with a diploid polar nucleus (Fig.3.gydF4y2Bae，f）。单一的抗双子细胞在自然界中是短暂的，受精后很快退化（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baf).胚乳受精卵分裂一次，成为双核;然而，在胚胎占据整个空间之前，它不会进一步发育和退化。gydF4y2Ba

胚胎发生gydF4y2Ba

受精卵是胚胎形成的前体，呈球形。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).受精卵的第一次分裂总是横向的，产生大小相等的珠孔细胞和合点细胞。有丝分裂后珠孔细胞迅速伸长，形成大液泡;合点细胞保持不变，细胞质致密(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).同时，胚乳受精卵也发生分裂，双核胚乳一直存在，直到胚发育到球形阶段(图)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba两个细胞都横向分裂，产生一个四细胞的线状原胚(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC，D）。在两个微囊细胞中没有观察到另外的分裂，其直接用作悬浮体，而两种小族种子细胞，在一系列分裂后，产生整个胚胎体。在两个小藻嗪细胞中，横向分裂发生在下电池中，并且纵向分裂发生在上部细胞中，并且这四个最终产生胚胎适当的胚胎（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae，f）。在胚胎细胞的两层细胞中的一系列分裂适当导致10纤细的，然后是16克细胞的proembryo（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bag，h，i）。来自16型细胞促胚的外层的蠕虫划分导致Protoderm（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baj，k，l）。悬浮液不显眼并由两个细胞代表。正常丝分裂发生在悬浮体中，最初形成缺乏任何特殊修改或开发的细胞，并且直接用作悬浮体。也观察到聚镁烯丙基，尽管其频率非常低（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa - c)。gydF4y2Ba

种子外套gydF4y2Ba

胶囊gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba拉长，纺锤形到纺锤形。9月初，种子从干燥和成熟果实的纵向狭缝中散布。成熟的种子呈褐色，细小，窄椭圆形，弯曲。大小范围为长2.5±0.3 mm，宽0.15±0.07 mm(以连续3年15粒种子，每年5粒种子，每个种子至少100粒种子为基准)。在成熟之前，种皮有四到五层细胞。种皮由两层或三层细胞组成，被盖层由两层细胞组成。最外层的外睾丸细胞比较大，横截面呈圆形或椭圆形或不规则。外胚层依次是肠系膜和内胚层。这两层都是由类似于外种的细胞组成，但尺寸更小。最里面的两层为被盖层，被盖层的细胞在横切面上较小且拉长(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaD-G）。在成熟期间，Exotesta成为乳头状物，剩余的层退化，并且整个籽涂层由薄的纸质层表示。gydF4y2Ba

生殖的日历gydF4y2Ba

繁殖周期gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba从土壤下开始。基于本研究中提出的观察，生殖历gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba是准备。所有发育阶段随时间的变化情况见图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa，b和补​​充文件sgydF4y2Ba1gydF4y2Ba．花药发育开始于三月中旬，那时整个植物都在土壤表面以下。初生孢子产生细胞直接作为花粉母细胞，这一过程发生在3月下旬至4月上旬。花粉母细胞减数分裂在4月中旬形成不同形状的花粉四分体。花粉核在4月下旬进行有丝分裂分裂，5月上旬花粉准备授粉。在我们研究的种群中，授粉的最佳时期是5月2-7日。授粉前约2周，卵开始发育。原孢子细胞在4月的第三周出现，大约持续到5月中旬。授粉后5 ~ 7天观察到MMC，持续到5月最后一周。授粉后2周开始减数分裂(WAP)，近4周发生珠孔细胞变性和核分裂。 The second and third nuclear divisions occurred 36–45 DAP. Thus, inC. japonicum，gydF4y2Ba雌配子体成熟6-7周。受精时间为6月下旬至7月上旬，约7-8wap或45-55dap，而合子在7月上旬开始分裂，约55-60dap形成2-4细胞线性原胚。在四细胞原胚中持续的细胞分裂产生了一个八细胞的球形胚，然后是16细胞的球形胚，大约65dap。在72-80dap内，整个种子内部充满了胚。成熟种子收获90dap。gydF4y2Ba

本研究提供了濒临灭绝的拖鞋植物的完全概述gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba．在自然界中，这种没有回报的兰花通过有性繁殖和营养繁殖的方法进行繁殖。然而，一般发生在无回报的兰花，包括gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba，在自然条件下非常低[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．这是可以理解的，这种非传递物种往往受到粉刷限制的挑战，因此在自然中表现出低生殖成功[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]．在属内，一些濒临灭绝的物种，如gydF4y2BaC。gydF4y2BafargesiigydF4y2Ba和gydF4y2BaC. macranthum，gydF4y2Ba表现出极低的鲜花转换率为果实[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba]， 然而gydF4y2BaC. Calceolus.gydF4y2Ba，gydF4y2BaC. Montanum.gydF4y2Ba， 和gydF4y2BaC. parviflorum，gydF4y2Ba由各种各样的蜜蜂授粉，表现出水果设定百分比高达45-85％[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba]．但是，伊斯岛梅尔等人。［gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba]和伯恩哈德斯和伊甸园[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba]认为除了传粉者的限制之外，一定还有其他基于遗传和/或环境的压力阻碍了成功传粉后果实或种子的成熟。须津和福岛[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba发现水果设定的百分比gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba通过天然授粉仅为14.9％，并且Sun等人研究的样本中的值甚至更低（即，仅5.2-7.7％）。［gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．虽然我们在研究群体中进行了人工传粉，但在我们取样点附近的自然传粉群体中，我们发现坐果率非常低(≤5%)，这与Sun等人的结果几乎一致[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]．本试验点人工传粉群体坐果率明显高于自然传粉群体(60-65%)，是自然传粉群体的12倍以上。人工传粉实验已经证实了gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba];然而，我们在相同和不同群体的个体之间进行了异花授粉。gydF4y2Ba

小麦小孢子发生和小配子发生gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba与其他兰科gydF4y2Ba

大多数最近的兰科胚胎学研究集中在胚珠、胚和柄的发育上。兰花花粉和雄配子体发育的研究很少，对兰花花粉和雄配子体发育的研究也很少gydF4y2Ba螺旋树gydF4y2Ba和gydF4y2BaOphrys.gydF4y2Ba物种 [gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba]．Sood和Rao [gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba的胚胎学研究gydF4y2BaC.辣带gydF4y2Ba．本研究试图从花药结构和雄配子体发育等方面对黄芪的胚胎学进行全面的阐述gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba．在gydF4y2BaC. japonicum，gydF4y2Ba花药发育发生在很早的时候(可能在3月中旬)，即使整个植物还在冻土表面之下。在以往的研究中，一些兰花的花药壁形成为单子叶型[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba];但是，由于早期发育阶段缺乏花香，墙体开发gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba在这里看不到。然而，从小孢子母细胞发育开始到小孢子发生结束，花药壁呈六或七细胞层状。这与Sood和Rao的发现一致[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]他在书中提到了六到八层gydF4y2BaC.辣带gydF4y2Ba，尽管Wirth和Withner [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]报道了大多数陆地兰花的五个细胞层状花药墙。相比之下，Aybeke [gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba)只发现了四层花药壁gydF4y2BaOphrys Mammosa.gydF4y2Ba．在本研究中，我们发现绒毡层为单层，除在周周有少量细胞分裂的位置外，均为两层。在两个小孢子囊之间的区域有部分两层绒毡层gydF4y2BaOphrys Mammosa.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]．相比之下，Sood和Rao [gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]中描述有两层或三层绒毡层gydF4y2BaC.辣带gydF4y2Ba这对大多数兰花来说并不常见[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．更有趣的是，陈旧和饶gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]在成熟的花药壁中发现了一个双层的药室内壁gydF4y2BaC.辣带gydF4y2Ba，由内皮癣和最外层层形成。但是，在gydF4y2BaC. japonicum，gydF4y2Ba在成熟花药中，只有内皮层发生这种增厚，其余中间层均不存在。而且，之前的作品都没有提到家族中有双层内膜[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba]．在墙壁层的性质和数量中这种差异使得这一特征是兰科的有价值的分类和胚胎发育标准[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

早期研究表明，小孢子胞质同时分裂是兰科植物的特征[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]）;然而，在这个家庭中也经常观察到连续类型[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]．在本研究中，我们发现了一种同时发生的小孢子发生gydF4y2BaC. japonica.gydF4y2Ba．这与Sood和Rao的发现一致[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba和Poddubnaya-Arnoldi [gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]，谁描述了其他微孔发育gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba物种，尽管Guignard [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]之前报道过该属的连续模式。细胞分裂的这种变异gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba物种可能并不令人惊讶，因为这两种类型的胞质分裂都在gydF4y2BaSpiranthes sinensisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba]在少数其他高昂，如gydF4y2BaRauvolfia canescensgydF4y2Ba［gydF4y2Ba53gydF4y2Ba],gydF4y2BaRauvolfia serpentinagydF4y2Ba［gydF4y2Ba54gydF4y2Ba),而gydF4y2BaCatharanthus pusillus.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]．我们观察到所得花粉四胞胎是异形，四面体，线性或T形，其是家庭中常见的四种类型，尽管仅观察到官方，异文件和四面体类型gydF4y2BaC.辣带gydF4y2Ba［gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．成熟花粉粒为单细胞双细胞gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba，如其他gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Baspp。gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

大孢子发生和大配子发生gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba与其他兰科gydF4y2Ba

胚珠、胚囊和巨配子体的发育gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba遵循其他orchidaceae中描述的通常模式。在此期间，在MMC下方的核心丝的两种真皮细胞变得扩大并且由横壁分开。因此，两个整形器都是如此原产地，如上所述gydF4y2BaC.辣带gydF4y2Ba［gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]，内被通常参与珠孔的形成。奇怪的是,Poddubnaya-Arnoldi [gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]报道了1个单胚珠gydF4y2Ba塞浦保米徽章gydF4y2Ba这在属中并不常见，甚至在家庭兰科西雅gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．最初，MMC的划分通常会导致平等大小的二元;然而，在这种物种中，只有脱氨基二烷增殖并且变得官能，导致整个胚囊的发育，而微米细胞很快地退化。步伐[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba他观察了四种胚胎的受精和发生gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba物种，描述了四核的自扑胚囊作为属的特征gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba因此被称为"gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba胚囊类型'。然而，这后来被其他研究人员纠正了，他们在不同的地方发现了5到8核的双孢子胚囊而不是4核的gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba物种 [gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]．这项研究的结果与后一种结果相对相似，因为我们观察到六核育的运动成熟胚囊囊。在这种情况下，抗映验由单个电池表示，因为来自每侧的一个核移动到胚囊的中心，并形成三重融合后产生胚乳的中央细胞。在迦太基核中随后的核划分失败被称为“罢工”现象。虽然在一次血液和自育兰花中观察到这种特征，但兆甘油癣中核的数量和抗双峰细胞的性质在各种属于家族中显然是独立的特征。在一些单体兰花中，脱碱细胞中连续有丝分裂的失败最终导致在成熟胚囊中没有抗双相细胞[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]．另一方面，在比什兰花如gydF4y2BaPaphiopedilumgydF4y2Ba四核期胚囊的一个珠孔核和两个合点核不能分裂，成熟胚囊由五个核组成[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

授粉与受精gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba与其他兰科gydF4y2Ba

花粉管通过微米进入，施肥可能发生在7到8个WAP之间。尽管施肥过程延迟，但风格的花粉管的生长并未以相同的速度发生gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba当花粉管团在胎盘细胞附近生长时21 授粉后几天。这一时期可能与Duarte等人观察到的时期一致[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba)的研究发现，花粉管在胎盘裂片上的传播时间为20 - 25dapgydF4y2BaAcianthera johannensisgydF4y2Ba. 以前的研究gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba建议将花粉管输送到胚珠不是同步过程，而是在15个DAP后的一系列天中连续发生[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba]，我们研究的结果与这一发现一致。另一方面，授粉和施肥之间的这一延长时间是兰科的常见常见，甚至可以通过许多edicatyledons进行独立演变[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]．这种延迟施肥有两种类型的解释：Sogo和Tobe [gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]描述了授粉时不完全的大孢子发生，而wrh和Wrthner [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]和arditti [gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]证实在兰科中胚珠发育较晚。基于我们的研究结果，大孢子发生的晚可能是这种延迟受精的正确解释gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba［gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba]．我们证实，双重施肥和三重融合明显发生gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba，虽然初生胚乳是双核和短命的。胚乳核的变性发生在胚胎达到16细胞阶段之前或之后。以前,速度(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]解释了两个（或很少有四个）胚乳核在胚乳中的常见现象gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba但是没有观察到三联融合。根据Pace [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]中，初生胚乳是由极核、一个助细胞和一个雄性核融合而成，但基于本研究，我们拒绝了这种可能性gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba．后来，Sood和Rao [gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]中也发现双核初生胚乳gydF4y2Bac . cordigerumgydF4y2Ba虽然poddubnaya-arnoldi [gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]记录了一种六核胚乳gydF4y2Bac .徽章gydF4y2Ba．本科记录的最大胚乳核数为12英寸gydF4y2Ba香草gydF4y2Ba16 in.gydF4y2BaGaleola Septentrionalis.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]．此外，一些先前的研究在兰花中有争议的双重施肥。例如，根据Savina的说法[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]， 在gydF4y2BaListera ovata.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOphrys OishiferagydF4y2Ba，只有一个雄性配子用鸡蛋保存，但第二个雄性配子不融合二次核;因此，没有发生三重融合。相应地，Maheshwari和Narayanaswami [gydF4y2Ba68gydF4y2Ba报道，只有一个雄性配子从花粉管中释放gydF4y2Ba杜拉利斯螺旋塔里斯gydF4y2Ba；因此，在该物种中极核的受精是不可能发生的。Tarasaka等人[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]提示花粉生殖细胞分裂失败，导致只有一个精细胞gydF4y2BaS. Sinensis.gydF4y2Ba因此没有雄性配子可以进行三次融合;然而，这后来被Battaglia争议[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]．近年来，花粉通过离体萌发gydF4y2BaS. Sinensis.gydF4y2Ba， Wang等人[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]在花粉管中发现了两种雄性配子，并建议预期该物种中的三重融合。gydF4y2Ba

比较胚胎发生gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba与其他兰科gydF4y2Ba

胚胎发育过程中最显著的特征之一gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba是缺乏精心制作的胚柄细胞。胚柄很可能是双细胞的gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba. 以前的研究表明，胚柄gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba要么完全缺席[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba或由一两个不显眼的细胞代表[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]．有趣的是，大多数关于兰科胚胎发育的结构研究都集中在胚柄发育上;甚至专家的gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]胚胎分类理念是基于悬挂结构。根据Swamy的五个胚胎类别，基于兰科的悬浮液形态，gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba属于I类类型，其中初始悬挂单元不会经历任何划分，但仍然没有多大伸长率。类似于调查结果gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba物种，Prakash和Lee [gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba]和tohda [gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]报道了单细胞和退化的胚柄gydF4y2BaSpathoglottis plicatagydF4y2Ba和gydF4y2BaLecanorchisgydF4y2Ba分别spp。。此外,在gydF4y2BaHetaeria shikokiana,gydF4y2Ba单细胞胚柄通过珠孔发育成一个长长的突出物，扭曲，进入胎盘组织[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]．兰花独特的液泡胚柄的功能仍不确定，尽管Lee等人[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)发现了可能存在“转移细胞”形态的特殊结构特化gydF4y2BaPaphiopedilum delenatiigydF4y2Ba．然而，这对诸如此类的分类群份尚不清楚gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba缺乏专门的悬念。因此，要了解这类植物胚柄的结构专一性，需要进一步研究胚柄的超微结构。gydF4y2Ba

受精卵的第一次分裂gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba遵循常规图案，形成终端电池和基底细胞。Swamy [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba基于胚胎细胞分裂模式，将兰花胚胎分为三种类型。根据Swamy的报告，gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba基于显影胚胎和I型基于悬浮形态的细胞分裂模式属于A组。但是，秀丽和饶[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba的胚胎发生分类gydF4y2BaC.辣带gydF4y2Ba根据Swamy的B组[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba[分类，陈述成熟胚胎组织中基底细胞的份额更大。在Swamy的分类之前，卡尔森[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba[报告了一个封闭的悬崖gydF4y2Bac . parviflorumgydF4y2Ba单独从末端细胞发育基底细胞和整个胚胎。我们的研究结果与卡尔森的研究结果基本上是一致的[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]而不是Swamy [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和Sood和Rao [gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]，因为基础细胞不参与形成胚胎质量的形成gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba．最引人注目的发现之一gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba即第二次和第三次分裂在终端细胞中也发生横壁形成，形成五细胞线形原胚。纵分裂发生在五细胞原胚的末端细胞，形成两个并置的细胞。同时，珠孔细胞横向分裂，形成双细胞柄。基于本研究的结果，我们证实gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba不遵循前面描述的胚胎和悬浮型开发的模式。gydF4y2Ba

保护的角度gydF4y2Ba

在自然界和体外条件下，低的坐果率和不规则的萌发是珍稀濒危兰花保护的主要瓶颈[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]．减少人口的主要威胁之一gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba授粉机制复杂，自然条件下坐果率低，萌发不规则。虽然离体种子的萌发受到了不同的关注gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba种，没有成功的体外萌发方法已被建议gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba．一些报道表明，未成熟的种子在体外萌发比成熟的种子在体外萌发更好gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba物种 [gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]．据de Pauw和Remphrey说明[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]在8 WAP收集的种子表现出三个急剧下降的萌发百分比gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba物种。最近，Jiang等人[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]发现了最佳的发芽率gydF4y2BaC. Lentiginosum.gydF4y2Ba从90-105 dap收集的种子，此时胚胎在球状阶段患者患者。在gydF4y2BaC. japonicum，gydF4y2Ba在9-10 WAP或65-75个DAP中观察到球状术后胚胎到球状阶段。因此，在此期间收集的种子可用于该物种的体外种子萌发。希望本研究中展示的生殖循环对于未来的研究将是用于选择适当的萌芽实验的胚胎阶段的研究。gydF4y2Ba

本研究介绍了濒危兰花的全面胚胎学特征gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba并为物种提供生殖日历。虽然先前的某些研究报告了该属的许多胚胎功能gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba，有关的数据gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba这项研究是全新的。我们对配子体和胚胎发育特征的总体比较表明，以前的报道gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba胚胎学不足以表征整个属。此外，一些先前报告的特征是含糊不清的，因此需要通过新的研究来纠正。本研究有助于澄清以前的报告中的一些矛盾调查结果。鉴于这些方面，本研究的结果肯定有助于未来的研究，并将为该属的胚胎数据提供基本的参考gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba兰科植物也是如此。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

塞浦哌米日本人gydF4y2Ba是一个20-40厘米高的陆地兰花，在中国，韩国和日本的山坡上成熟和连续的落叶林中增加了成熟和连续的落叶林[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]．这些物种也被发现在日本低地的竹林林下[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]．几块gydF4y2BaC. japonicum.gydF4y2Ba生长在由韩国国家植物园(Korea National Arboretum)建立并保护的篱笆内，该篱笆靠近生长在韩国的六个自然种群之一(见Chung等人[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba])。植物的正式鉴定由一群植物分类家，包括韩国国家植物园的Sungwon Son（作者之一）。gydF4y2Ba

手授粉gydF4y2Ba

塞浦哌米日本人gydF4y2Ba是一种无回报的兰花，这种植物的繁殖成功率明显较低[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]．太阳等。［gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba嫌疑人不常见的授粉是这种物种中水果生产的原因。因此，为了确保具有高水果设定率的实验的足够样品，通过将花粉传递到另一个花的柱头上，手动交叉花粉，努力不将交叉授粉限制在同一丛中。共计连续三年的130-170棵开花植物被计算并在所有团块中授粉。用尖销设定的花粉从一朵花脱离，在使用前用70％乙醇冲洗，并附在另一朵花的柱头上。为了避免昆虫的不需要的授粉，授粉的花朵被精细网尼龙袋覆盖。gydF4y2Ba

采样gydF4y2Ba

植物材料在3月至9月期间连续三年（2016 - 2018年）收集，韩国国家植物园许可，实验后剩余的样品保存在种子测试实验室中。标本和种子样本（凭证号码.KNASB 17,562-17,573）沉积在韩国国家植物园的种子库中。对于常规研究胚胎学，在常规时间，每周，授粉之前和后，将开发花和水果收集。每周收集至少三到五个代表所有发育阶段（授粉之前和授粉之前和授粉）的样本。当新芽开始出现时，在3月底开始样本收集（挖掘地下花蕾），直到9月下旬，当水果完全成熟时，水果墙开始破裂种子分散。关于时间（在数周内）和相应的发展阶段的细节在补充文件S中提供gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．在早期的收集中，特别是3月份那些主要用于研究雄性配子体发育的3月份，所有显影芽都在土壤表面下面。所有收集的样品在福尔马林/乙酸/ 50％乙醇（FAA）中以90：5：5 / 100mL的比例固定在至少3-5天，并保存在50％乙醇中[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

光学显微镜gydF4y2Ba

将保存好的花蕾、开放的花和果实在乙醇(50、70、80、90、95和100%)中脱水，每个阶段至少24小时。样品完全脱水后，通过酒精/Technovit (3:1, 1:1, 1:3, 100% Technovit)的渗透溶液，然后包埋在由Technovit 7100树脂原液与Technovit 7100硬II混合而成的聚合溶液中。用histblock和Technovit 3040对每个嵌套材料制备组织学块，以便去除模具并对材料进行切片。使用带有一次性刀片的徕卡RM2255旋转切片机(徕卡微系统有限公司，德国)切割4-6 μm厚度的连续切片，将其粘在组织切片上，并使用电动切片加热器烘干12小时。0.1%甲苯胺蓝O染色60-90 s。染色后，用自来水冲洗载玻片，再用电热载玻片烘干6小时以上以除去水分[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba]. 使用Entellan（默克公司，德国）进行安装，安装的载玻片用金属块压制几天以去除气泡。在AXIO Imager A1光学显微镜（卡尔蔡司，德国）下观察这些永久性载玻片，并使用显微镜中附带的摄像系统拍摄显微照片。为了记录孢子发生和配子发生的所有发育阶段，每个阶段至少有5个样品被切片和观察。gydF4y2Ba

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。gydF4y2Ba

我们感谢Choi Go-Eun、Lee Hayan、Yum Dabin和Jeong Hyunjung博士在该领域的重要贡献。作者感谢匿名审稿人对这篇手稿的早期版本的深刻评论和建议。gydF4y2Ba

本研究得到了韩国森林植物种子迁地保护项目（KNA1–2-29）的资助。该项目的经费包括实地考察、实验、出版和第一作者的工资。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 森林生物多样性部，韩国国家植物园，宝川，11186，韩国gydF4y2Ba

   Balkrishna GhimiregydF4y2Ba

2. 植物资源分工，韩国国家植物园，永春，12519，韩国gydF4y2Ba

   孙成元、金在贤和郑美珍gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

JMJ和BG构思了这项研究。BG进行了大多数实验和数据分析。SSW和KJH帮助实地考察。BG和JMJ写了稿件。KJH和SSW编辑了稿件。所有作者都读过并批准了稿件。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2BaMi晋宋gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有利益冲突。gydF4y2Ba

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