节省时间维护可靠性：一种用于量化的新方法GydF4y2BaTetranychus荨麻疹GydF4y2Ba拟南芥的损伤整个玫瑰花属GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

模型物种GydF4y2BaTetranychus荨麻疹GydF4y2Ba在田野中产生重要的植物伤害和经济损失。拟南芥中蜘蛛螨损伤的当前可接受的方法是占用的造成型玫瑰花，并且需要诸如突变筛选或定量遗传分析的大规模研究的瓶颈。在这里，我们通过设计自动协议来描述现有方法的改进版本。新增强方法的准确性，精确度，再现性和相应性在具有相反损伤表型的拟南芥中验证。结果与当前可用的手动方法进行了比较。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

图像采集实验表明，自动设置加入亮度和黑色背景的值是通过软件程序特定识别蜘蛛螨伤害的最佳条件。在不同的测试方法中，基于机器学习的Ilastik-Fiji串联是能够量化维护差异范围的差异范围之间的损坏的最佳过程。此外，Ilastik-Fiji串联方法在不同的照明或背景周围环境下的一套条件和最高稳定性上显示了最低的变化。Bland-Altman的一致性结果指出了Ilastik-Fiji的负值，这意味着与手动标准方法相比损坏的次要估计。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

利用Ilastik和斐济程序的新方法对拟南芥整个莲丛中蜘蛛螨损害的具体定量进行了很大的改进。所提出的基于交互式机器学习的方法的自动化消除了先前手动协议的主观性和评分者间的可变性。此外，该方法为节省时间和避免其他方法观测到的损伤过高估计提供了一个健壮的工具。GydF4y2Ba

两个斑点蜘蛛螨GydF4y2BaTetranychus荨麻疹GydF4y2Ba科赫(壁虱GydF4y2Ba：GydF4y2BaTetranychidae）是一种植物植物植物，导致重要的植物损害和产量损失[GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba］．气候变化下蜘蛛螨的预测扩张，其极端的多食性特征与超过1100个文献记载的宿主植物和其发展农药抗性的能力使GydF4y2Bat .测定了GydF4y2Ba农业中最显着的害虫之一[GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．植物螨虫刺穿杀菌植物细胞使用Stylets吸吮它们的营养，主要在叶子上产生严重的萎缩，导致作物产量的减少[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．GydF4y2Bat .测定了GydF4y2Ba是螯合食草动物中的模型，其小基因组测序和广泛的工具和协议开发了[GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]. 此外，螨类对模式种的摄食能力GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba为植物螨互动的功能研究提供了杰出的机会[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

植物损伤的量化GydF4y2Bat .测定了GydF4y2Ba当作物损坏与产量损失有关时，对决策者尤为重要;用于植物育种方法，其中各种牧草，种质，品种和/或品种需要评级;对于害虫管理决定[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba］．同样，它是一种有价值的工具，用于了解生物学中的基本过程，例如植物害虫共存[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．在过去几年中，量化损害所产生的GydF4y2Bat .测定了GydF4y2Ba拟南芥[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba已经使用Cazaux等人描述的方法测量。[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．该方法基于使用Adobe Photoshop程序和MM以后像素的后续变换的氯化斑点的手动识别GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba受损区域。本手册方法非常主观，因为评估者（人类专家）必须区分由其他浅色或背景区域喂养的螨虫产生的褪绿斑，例如毛状物或早期衰老症状。即使该手动方法提供准确且精确的量化，它也耗时，需要内在和帧内间变异性[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]. 对于由病原体或咀嚼昆虫引起的症状，受损/未受损区域之间的高对比度有助于使用自动程序（如Fiji）实现结果的可重复性和再现性[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba或APS评估[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba］．相比之下，以细胞为食者(螨或thrips)和以韧皮部为食者(蚜虫)会产生难以被自动软件程序识别的细微症状。在之前的工作中，软件CompuEye [GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]，ilastik [GydF4y2Ba24GydF4y2Ba/或斐济[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba已被用来量化吸入馈线产生的细胞损伤。这些方法已被用于评估分离的叶子或一片已知区域的叶片造成植物损伤，但不是在整个植物中应该提供更现实的措施。因此，我们决定在手动注释（Photoshop）并行测试三个自动程序（评估，Compueye和Tandem Ilastik-Fiji）的有效性，以估算拟南芥玫瑰花纱上的蜘蛛螨造成的损害。基于软件的可用性，其用户友好的平台及其在批处理模式下处理的容量大量图像来选择这三个自动程序。软件选择涵盖了良好的记录方法，具有识别微妙的生物应激，采用策略，如简单的阈值（评估和Compueye）和现代机器学习技术（Ilastik）等策略。选择的另一个重要的考虑功能是非计算机科学家的方法的可访问性，因此可以使用它们而无需诉诸编程专业知识或高计算机处理能力。另外，已经分析了背景期间的背景和所选择的照明条件的效果以优化该过程。与手动方法相比，我们的比较分析突出显示了各种方法的优缺点，并证明了串联ILastik-Fiji方法是最可靠的。通过使用现代机器学习方法的程序自动化，消除了帧内帧内帧内变异性，大大减少了量化过程时间，避免了对手动方法固有的损坏的高估。GydF4y2Ba

选择和优化所研究的方法GydF4y2Ba

为本研究选择了三个自动软件程序，评估[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]，compueye [GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]和串联的Ilastik斐济[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］．这些程序被确定为以前用于损坏量化，可能会自动歧视由此产生的细微损坏GydF4y2Bat .测定了GydF4y2Ba侵扰。作为参考，我们使用了手动注释[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba目前用于量化拟南芥的蜘蛛螨伤害。对于评估2.0的分析，使用了经典面板。探讨了每个颜色平面上的阈值以区分从背景中的玫瑰华丽区域。通过在每个平面上探索阈值，在莲座区域进行损伤分析。一旦确定所需的平面和阈值（附加文件）GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba：表S1），宏指令（宏）被设计为自动处理图像（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：宏S1）。通过测试四种可用系统中的每一个进行Compueye分析。测定不同程度的灵敏度以正确识别受损区域。一旦确定了系统/灵敏度的组合（附加文件GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba：表S2），分析了大部分侵扰和非侵染植物图像。由于结果不佳，未使用本程序的自定义检测系统。GydF4y2Ba

关于Ilastik，程序被训练来识别受损组织，并使用这些信息分割原始图像。分割后的图像在斐济进行处理（附加文件）GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:宏S2-S4)。利用控制莲座图像选择像素聚类大小阈值来区分背景噪声。一个37像素的簇大小被检测为平均值，在这个平均值下损害被忽略为最终的测量(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图。S1）。整个分析过程的工作流程显示在图2中。GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba以及方法部分中的详细说明。GydF4y2Ba

所有的自动方法都需要为每个照明和背景条件确定特定的阈值。此外，对照花环被用来校正自动方法的平均误差。由于存在与幼叶、毛状体或早期衰老相关的浅色相关的混淆区域，这种错误存在于对照花环中“受损”组织的鉴定上。GydF4y2Ba

扫描条件优化GydF4y2Ba

为了分析照明变化对用于识别损伤的方法的能力的影响，将6种亮度/对比度组合和2种背景应用于每个玫瑰图案(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．对手动参考方法的自动方法的数据闭合和测试中的各种方法和条件中的可变性支付了注意力（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

在此之前，使用对照花束对数值进行校正。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)，在评估和CompuEye计算的所有光照条件和背景测试值上检测到明显的损伤高估和变异。黑色背景下的损伤值是参考方法计算的3 / 4倍，白色背景下的损伤值是参考方法的9倍。Ilastik-Fiji串联法获得的值更接近参考方案的结果，仅在黑色背景A2和白色背景A2和A6条件下高估。当数据被纠正时，使用控制玫瑰的损伤(图。GydF4y2Ba2 bGydF4y2Ba)，在黑色背景下，Assess和CompuEye高估降低了，并且在测试的大多数条件下保持了高可变性。Ilastik-Fiji串联体估算的损伤再次接近参考方法，显示出对A1、A2和A6条件的低估。当校正应用于在白色背景下拍摄的图像时，通过Assess和CompuEye进行量化的损害显示出显著的减少或缺失值，这是由于控制组比感染的玫瑰组识别出更多的损害。对于Ilastik-Fiji串联，损伤仅在A6条件下被高估，该条件下的值更接近参考程序计算出的值，且具有可接受的内部和互变性(附加文件GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba:表S3)。用GLM进行统计分析，发现不同程序对背景的损伤有显著差异(χGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba= 29.99，GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.001)和照明条件(χGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba= 63.85，p <0.001）。在不同背景下的相同照明条件下估计的损失没有差异（χGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba= 5.14，GydF4y2BaP.GydF4y2Ba= 0.27)(附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：表S1）。具有最接近Photoshop参考方法的程序是Ilastik-Fiji串联，特别是对于条件A3，A4和A5，其也具有低标准偏差（SDS）和变异系数（CVS），并且表现得同样行为两个背景（附加文件GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba：表S3）。在相同的三种条件下，assessment在黑底上也有损伤值，低SDs和CVs接近Photoshop标准。A3、A4和A5以外的任何光照条件都会导致自动方法高估或低估损伤值，并在对照花环上产生高可变性或过度损伤识别。由于三个自动程序中有两个的结果准确，选择A3、A4和A5条件进行后续分析。GydF4y2Ba

每种方法的准确度和精密度GydF4y2Ba

为了测试每种方法的精度和准确性，将两种另外的基因型，KON和BLA-2添加到先前实验中使用的COL-0中。镰刀植物对蜘蛛螨的攻击感到高敏，呈现出更多的氯化区域，而BLA-2具有高度耐受污染玫瑰花的症状。尽管COL-0有点耐受虽然COL-0耐受的响应非常相似，但BLA-2玫瑰花螨对蜘蛛螨的响应非常相似[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．通过分析基因型在植物损伤规模中的位置和计算Kon/Col-0平均损伤之间的商来评估准确性[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．对于在两个背景测试的每个照明条件下，除了条件B3上的kon基因型外，所有方法计算的平均损伤在标准之外，除了条件b3上的kon基因型（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．最低点亮的B1条件发生了最糟糕的精度方案，其中评估和Compueye丢失了这些信息，因为它们在控制上检测到比在侵染的玫瑰花的更多“损坏”区域（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．由于某些信息损失，Compueye和条件下的评估结果也是误导性。在条件W2和W3中，Compueye结果是预期比较三种附加（Kon> Col-0〜Bla-2），但SDS和CVS非常高（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba;附加文件GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba：表S4）。关于Ilastik，六条条件中五个出现的损坏区域保持了每个基因型的平均损伤（Kon> Col-0〜Bla-2）之间的标准已知关系。但是，它们的值始终低于手动注释（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba;附加文件GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba：表S4;附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:表S2)。Ilastik结果更好地再现基因型之间已知关系的条件是黑色背景上的b3。在上述条件下，敏感基因型(Kon)与抗性基因型(Col-0)的关系达到4.5(表1)GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba），它配备了先前的手动获得的数据，其中商Kon / Col-0在2.5和4.5之间[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

该值表示两种基因型，kon和bla-2之间的关系，在蜘蛛螨电阻谱的相对端上。GydF4y2Ba

另外，与其他自动方法相比，ILASTIK方法具有较少的数据变化，其SDS和CVS（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba;附加文件GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba：表S4）。所有方法都显示了kon的更多分散值，而不是其他两个基因型（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba;附加文件GydF4y2Ba1克ydF4y2Ba：表S4）。GydF4y2Ba

背景和光照影响方法的重现性GydF4y2Ba

为了评估自动方法的再现性，在两个背景上使用三个照明条件进行损伤估计。进行GLM以检测统计差异和与Bonferroni校正的一对比较分析以定位它们。为每种方法生产B＆A图，以比较背景之间的估计变异性（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．还计算重复性系数以分析背景和照明条件的效果（表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．正如预期的那样，对基因型检测统计差异（χGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba= 72.11，GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.001)，照明条件(χGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba= 21.8，p <0.001）和程序（χGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba= 76.01，p <0.001）（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:表S3)。照明条件可根据程序估算的损坏（χGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba= 42.95, p < 0.001)。不同基因型的损伤计算程序之间也存在差异(χGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba= 29.22，p <0.001）。GydF4y2Ba

根据B＆A图和重复性（CR）值的系数，ILASTIK估计与不同的背景更加可重复。与每个基因型分析的其他两个自动方法相比，ilastik显示了较窄的协议限制（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．不同照明条件的CR值（表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)和背景变化(表GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)与其他两种自动检测方法相比，Ilastik的检测率普遍较低，尤其是Bla-2和Col-0基因型。GydF4y2Ba

除了所有先前的数据外，Ilastik生成的损伤量化图像具有最高的视觉精度（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

一致性分析GydF4y2Ba

制作B&A图，研究每种损伤量化方法与Photoshop标准程序的一致性。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．差异表示为值的百分比[（方法A - 方法B）/平均值）]。由于条件W1和B1的结果的准确性差，仅针对条件W2，W3，B2和B3生产的图。在Ilastik-Fiji /手动注释图中分析了更多的重复，因为在控制校正期间损失了较少的样品。与标准相比，所有方法都被偏置以识别较少的损坏，除了在黑色背景上的条件B3下的Compueye之外（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．与其他方法相比，上述的例外也是唯一的一种情况，即CompuEye的协议范围更窄。Ilastik的协议限制通常是最狭窄的。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba），随后是评估的人，这表明这两个估计程序更加一致。然而，与其他两种方法相比，伊利克偏见识别较少受损区域的偏差较大。平均而言，ilastik检测到1.36％（28毫米GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba）损坏的区域比Photoshop更少，而评估达到0.37％（17毫米）GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba)和CompuEye高估达到0.58%(53毫米GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba)(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)．通过Lin’s一致性相关系数(CCC)和Spearman相关系数的计算，分析了自动方法与标准方法的一致性。当相关系数识别方法之间的关系时，Lin的CCC也能够检测恒定的偏差并相应地进行惩罚。关于Spearman系数，相关是显著的(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba<0.001）对于分析的所有方法。当图像被拍摄在所有自动方法的黑色背景上时，与参考方法的相关性更高（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)．当使用Lin’s CCC进行分析时，自动方法和手动标准方法之间没有发现完美的关系。除了黑色背景上的CompuEye(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba），其余方法显示出与标准相比低估损坏的趋势。在黑色背景中评估最高CCC（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）表示更好的一致性，尽管其大部分的价值观低于一致性。正如之前的B＆A Plot结果从之前的B＆A Plot结果，伊利克对两个背景的CCC值最低，虽然黑色背景较高。该方法被突出显示为具有B＆A图中最大偏置的方法（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)，由于CCC惩罚了这种倾向，它的数值是最低的。GydF4y2Ba

对照葫芦损伤检测的比较分析GydF4y2Ba

由于对照玫瑰花的尺寸较大，与侵染器相比（t = 25.291，df = 1054.2，GydF4y2BaP.GydF4y2Ba- value <0.001），混杂区域在这些玫瑰花中更丰富。为了控制这种效果，对照玫瑰花纱中的受损区域表示为玫瑰花区总面积的百分比。当使用GLM分析对照玫瑰花纱的损坏区域的百分比时识别出差异（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：表S4）。最高的相互作用指示在不同的照明条件和背景下分析基因型的百分比统计学差异（χGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba= 120.6，GydF4y2BaP.GydF4y2Ba<0.001）（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：表S4）。通常，当在白色背景上扫描它们时，对照玫瑰花的损坏区域值增加了（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

每个背景上的灯光变化并没有在损坏区域造成统计学上的显著差异(附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：表S5）。与Kon相比，assessment和CompuEye在白色背景下检测到更多Bla-2和Col-0基因型的基底损伤。基因型的这种行为通常表现为侵染植物的低损伤面积值，导致在应用控制校正时信息丢失。CompuEye是一个在对照花环上发现更多损伤的软件（高达50%），其次是评估（高达40%）。事后分析强调Ilastik是一种在对照花环上识别较少损伤区域的方法（高达10%，另附文件）GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：表S5）。误差，例如Compueye的鉴定和叶柄作为损坏的评估（图。GydF4y2Ba10GydF4y2Ba)，都被控制在黑色背景下。GydF4y2Ba

在过去的几年里，已经努力改善了对对蜘蛛螨的拟南芥抗性的分子基础的理解[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．由于筛选植物阻力需要适当的植物损伤量化方法，因此蜘蛛螨社区的大多数研究人员使用了一种基于手动注释量化叶片损伤的方案[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．该程序允许鉴定针对蜘蛛螨患者涉及拟南芥防御的基因，它们在对农作物中的蜘蛛螨虫的作用，以及对不同植物主持人的螨虫改编的存在[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba］．然而，这种方法有一些弱点。它是主观的，依赖于人眼，耗时的耗时，并呈现出高的间间和帧内变异。在这种情况下，为了建立使用整个玫瑰花的拟南芥血液伤害的有效和自动定量的替代程序，是使用整个玫瑰花。在已经描述的不同自动程序中，选择了植物损伤，评估，Compueye和Ilastik方法，因为它们以前用于量化类似植物细微症状的量化[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba］．测试了不同的条件和参数，以确定建立可靠的自动方法的最佳设置，以高精度，精度和一致性地常规使用GydF4y2BaA. Thaliana-T。荨麻疹GydF4y2Ba互动研究。GydF4y2Ba

背景和亮度GydF4y2Ba

众所周知，扫描条件和图像质量会影响数字方法计算的损坏的量化[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．这些分析需要特定的阈值、训练和敏感性，以正确识别和量化损害[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．在拟南芥中，由于蜘蛛螨喂养而导致的叶片症状被鉴定为淡黄色或白色的叶斑或小区域[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba，在白色背景上高亮显示。事实上，当测量在白色背景上进行时，作为参考的人工方法通常检测到更多的损伤。这一特征表明，植物组织周围明亮的环境改变了人眼对损伤的检测。同样地，我们的发现也支持了评估和计算机眼程序在白色背景下拍摄图像时，也能识别出控制组受感染的蔷薇花簇更大的损害。最明亮的环境能产生最高的检测损伤组织的能力，但同时，由于颜色相似和反射，错误率也最高[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．因此，对照玫瑰花中蜘蛛螨损伤的高估导致校正施加校正时的数据损失，并在侵扰后没有任何信息的整个基因型。为了避免过量的错误并避免螨虫损伤，富含幼虫的地区和早期衰老症状之间的误解，还测试了黑色背景上的图像的收购。在这些条件下，评估和Compueye计划对控制玫瑰花纱中受损区域的估计显着低于白色背景下测定的值，避免了已知误差，例如叶柄的损伤[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]. 此外，光照条件对图像分析的重要性促使我们评估对比度和亮度在植物损伤量化中的组合。正如预期的那样，亮度的极端条件是自动方法的障碍[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．根据Kirk等人。[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]中等设置的子集呈现出最可靠和稳健的结果。这些设置是由扫描仪提出的自动条件，以及高于和低于该值的10个亮度变化点。对这三种光照条件的分析提供了每个背景的混合结果，而Ilastik程序生成的结果变量较小，大多数测试条件的再现性较高。GydF4y2Ba

准确性，精确和一致性GydF4y2Ba

精度是指对特定值的测量的接近，而精度表示彼此测量的近距离。在评估基于计算机图像处理来量化植物损伤的任何自动化方法的评估中，这两个概念都是强制性的。标准的近距离受到背景的调光条件极大地影响。因此，如前所述，不建议自动检测下的亮度降低[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］．在我们的研究中，Compueye方法在其他程序具有积极结果的条件下表现差。由于对照玫瑰花的过度损坏估计，它未能在白色背景上的BLA-2，COL-0和KON附加物中的损失范围从黑色背景上的一些基因型丢失数据。此外，它在B＆A图上具有更广泛的协议限制，尽管其偏差是最低的。这些结果同意其估计的高可变性。它也是唯一受过高估的方法，以及受照明和背景条件的变化影响最大。评估方法中的主要障碍是对控制COL-0玫瑰花的损害估计。该方法在几个COL-0对照植物中一致地识别多于侵扰的植物，导致数据丢失。此外，通过该方法在kon登录的白色背景上获得的损坏值是最具变量的。这些结果同意其依赖于光变异的RGB模型[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba］．相反，ILASTIK方法发现的可变性通常类似于除了kon基因型的标准值，除了kon基因型，其高度可变数据在条件和所用软件上独立地检测到。ilastik结果也始终如一地复制了kon> col-0GydF4y2Ba〜GydF4y2Ba无论条件如何，BLA-2关系。上述值与基因型之间的关系，小标准偏差和关系的均匀性鉴定了在黑色背景（条件B3）上测试的最亮条件，作为ILASTIK程序的最佳条件。ILASTIK方法的平均损伤Kon / Col-0的必要性为条件B3的4.5，类似于Santamaria等人报告的结果。[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．kon / col-0中发现的损害关系的再现性是ilastik可靠性的良好指标。GydF4y2Ba

在一致的条件下，它定义了两种不同测量之间的相似性，和谐或一致性，评估和Compueye方法对参考方法相同。但是，评估和Compueye程序的更广泛的协议限额在与伊利伊克相比，其估计区域之间的变化较高，后者显着低估了偏差。同样，尽管相关系数对于所有方法都很重要，但是林的CCC值对于评估和Compueye方法优越。作为CCC通过分析通过起源45°的线路的关系来评估两种方法之间的协议[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba[Ilastik方法的CCC值由于其偏差较大而受到严重惩罚。通过评估，Compueye和标准方法之间的相关分析和CCC检测到的密切关系可能是由于它们类似的检测受损区域的策略。GydF4y2Ba

标准方法借助于损坏区域的红色点涉及手动分割，该损坏的区域将被推断并求和为平方区域0.25 * 0.25 mm [GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．除了主观性或rater经验产生的测量的变化之外[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]，这种方法也招致了与选拔程序有关的内在过高估计。当一个区域被选择为损伤时，健康组织和褪绿组织的混合物经常被包括在选择中(图。GydF4y2Ba11GydF4y2Ba)．这种现象发生在受损区域内部，但在受损区域的界限中更频繁地频繁（图。GydF4y2Ba11 cGydF4y2Ba)．结果，将健康组织计数为受损。每次新的选定广场都有这些特征时，错误增加了，这发生了适中频率。由于总伤害增加，但误区的错误率也增加，特别是如果区域蔓延。在易受敏感的基因型（如Kon），其中受损区域广泛且分散，发病率较高。GydF4y2Ba

assessment和CompuEye方法的表现类似于在Photoshop上执行的手工方法，也倾向于高估受损区域，因此，它们的一致性更高。评估软件的经典阈值面板上的分割程序利用一个简单的阈值程序，在选定的颜色空间内选择一个像素范围[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41GydF4y2Ba］．所选区域有两个固定的边界，其中包含感兴趣的像素。然而，由于花环的复杂性，受损区域包括像素的独立范围，而不一定是一个单一的范围。当选择一个单一的广泛范围时，健康组织也包括在选择中，如幼叶，毛状体丰富的区域和叶边缘。错误识别的程度取决于混淆区域的存在，而混淆区域在不同的莲座之间是不同的。另一方面，CompuEye的分割程序也依赖于一个简单的阈值程序。现有的系统已预先设定程序，以识别绿色的缺失，并通过调节灵敏度来扩大其范围[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba］．与手工方法一样，图像被分割成选定大小的正方形单位，识别程序一次分析每个正方形，计算平均颜色[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba］．选择固定颜色/像素值的策略作为下面完成损坏选择的阈值，与评估程序类似，并携带相同的缺点。GydF4y2Ba

与先前的两个自动化技术不同，Ilastik方法使用更复杂的方法来识别损坏，这可能是其低调的原因[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba］．它结合了主动学习和机器学习技术，能够识别复杂纹理图像中的像素受损区域[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba］．最初由用户提供的识别的像素信息被引导。随后，输入用于构造各个决策树，并且通过随机林分类器进行整个图像的像素分类的像素[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］．通过随机森林进行分类被认为是最有效的学习机技术之一，并且在使用小样本尺寸训练时被报告为强大的[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba那GydF4y2Ba47GydF4y2Ba］．此外，当用于鉴定植物的生物应激时，与其他监督机器学习技术相比，它已被确定为优越[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba］．该软件还指导用户通过添加额外信息来对用户进行削弱地区来进行分类。不是一个固定区域或像素阵列，作为评估和Compueye使用的先前策略，ilastik程序允许选择性地选择更好代表用户识别为损坏组织的那些像素。这种选择允许更精细地估计对诸如玫瑰色图像的复杂视觉环境上的损坏。此外，所有先前的过程都发生在用户友好的界面中，该界面不需要来自用户的任何编程知识。GydF4y2Ba

本研究开发期间发现的自动程序的一些主要局限性与其对光和背景条件的敏感性有关。因此，本研究确定了这些照明和背景条件，程序往往具有最佳结果。ILASTIK方法的高灵敏度突出显示为最佳选择。然而，它阻止了在某些拟南芥中使用训练有素的模型，以识别另一个造成伤害，这导致了测试每个生态型的各个模型的培训。作为基于机器的基于机器的软件，ilastik需要培训数据能够有效地识别健康组织的损伤。由于其复制限制，这是本实验设计的挑战。然而，在可用人工智能技术的阵列中，ilastik使用的策略优化了可用培训数据的使用，从而降低所需的总金额，如下所述。GydF4y2Ba

Ilastik作为一种机器学习方法GydF4y2Ba

如前所述，识别玫瑰花丝中受损区域的Ilastik背景算法被视为监督机器学习。这种技术识别模式的能力使其在科学任务中有用，例如通过特定算法检测和测量疾病症状[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba]. 当以自动化方式提供新信息时，运行上述技术的软件也会得到改进，而不考虑原始数据的底层模型的知识[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba］．在应用于图像分析的机器学习技术中，深度学习方法是Ilastik所采用的监督机器学习的替代品。他们使用用户提供的重要数量的图像来识别像素。因此，这种替代方案探讨了大量的原始图像，并提供标签并将图像区域与他们联系在没有人为干预的情况下[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba］．图像分析的深度学习方法，如卷积神经网络，非常强大。但是，它们需要大量的培训数据，正是训练数据规模的减少，这方法的主要研究领域之一[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

另一方面，监督机器学习涉及通过人类指导算法参数化，允许从提供的样本中提取有意义的模式[GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba］．与深度学习不同，ILASTIK使用的机器学习方法基于显着更少的图像要求提供分类结论。图像复制取决于培养到生长室的玫瑰花的数量，其能力通常有限。另外，拟南芥玫瑰花纱必须逐一地用几十个小型螨感染，必须在扫描过程之前用手移除。结果，表型实验通常在6重复的范围内[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．这是对利用深度学习技术的强烈挑战，并使他们使用不实验性，因为训练阶段需要数百到数千个图像[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba］．与深度学习技术不同，Ilastik采用的策略将特征空间缩小到用户选择的像素，仅使用训练数据来识别决策面[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］．因此，该方法允许精度，简单性和速度之间的平衡，并显着降低培训和分析过程所需的数据量[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］．此外，深度学习需要沉重的处理能力和训练阶段的大量时间，通常涉及编程能力[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba］．由于本工作的主要目标之一是提供可访问和可重复的方法，因此这些要求也将作为约束。GydF4y2Ba

Ilastik使用的机器学习技术的另一个优点是在给出更多信息时提高其性能。在这方面，将进行未来的测试以验证和增强这种方法。应该检查的问题是在富集训练样本时获得的结果，通过控制图像和专家组分段图像的误差减少，以及在不同拟南芥生态型中的受损区域之间的关系维持关系。此外，由于监督机器学习方法的可塑性，目前的协议也可以应用于鉴定诸如真菌，病毒或细菌感染等不同应力的损伤。同样地，本方案也可以转移到其他植物物种，进一步扩展其适用性谱。作为可以应用于目前损害识别要求的未来方法是新兴学习策略，如数据增强，转移学习或域适应。上述机器学习方法利用不同的策略，以便在保持疗效和特异性的同时改善培训数据要求。这是由于目前研究的图像可用性限制而导致其使用吸引力的功能。GydF4y2Ba

在这项工作中，提出了一种新的和自动自动的垃圾量，由拟南芥喂养的蜘蛛螨饲料整个玫瑰花。我们的调查结果是目前接受的可用手动方法的明确提前，以量化侵扰植物的损害。在测试的方法中，串联使用的Ilastik和Fiji的组合是最准确，精确和可重复的程序，用于量化拟南芥玫瑰花纱菌造成的蜘蛛螨损伤。一致性分析显示了通过ilastik程序获得的结果，该偏差揭示了揭示使用其他方法产生的损坏的高估，包括参考文献。此外，研究了在损伤量化中的图像扫描条件的影响，以选择适当的照明和背景条件，以评估所识别的系统下的植物损伤。因此，基于机器学习的这种自动化方法，非主观性，不耗时，没有间隙和帧内帧内变异性可以被认为是研究植物蜘蛛螨生理相互作用的不同方面的增强和适当的方法。GydF4y2Ba

植物材料及生长条件GydF4y2Ba

所有的种子GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba沃基斯拉夫博士（加拿大西部，加拿大西部大学）和最初从Abrc（拟南芥生物资源资源中心）提供了加入。GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba植物从哥伦比亚（Col-0），Kondara（kon）和blanes（bla-2）不同的易感性GydF4y2Bat .测定了GydF4y2Ba[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba使用过。GydF4y2Ba

种子被种植并在4℃下孵育5天 °GydF4y2Ba然后在控制条件下(23GydF4y2Ba°GydF4y2BaC±1 °GydF4y2BaC，> 70％的相对湿度和16 h / 8h日/夜光过周期）。GydF4y2Ba

蜘蛛螨维护GydF4y2Ba

殖民地GydF4y2Bat .测定了GydF4y2Ba伦敦毒株（蜱螨亚纲：叶螨科），由加拿大安大略省西部大学的Miodrag Grbic博士提供，是用豆类饲养的(GydF4y2Ba菜豆GydF4y2Ba）在25°C±1°C，> 70％相对湿度和16 h / 8h日/夜光周周期下保持在增长室（三洋MLR-350-H，Sanyo，Sanyo，日本）。GydF4y2Ba

侵犯议定书GydF4y2Ba

A. Thaliana.GydF4y2Ba用50或20次小心地感染了三周的植物 t .测定了GydF4y2Ba每植物的女性成人使用精细刷子来优化条件或方法比较。使用了三到八个重复。GydF4y2Ba

图像获取和处理GydF4y2Ba

在侵染4天后，小心地从玫瑰花条上仔细取出螨虫，使用HP ScanJet（HP Scanjet 5590数字平板扫描仪系列）切割并扫描整个玫瑰花。使用毫米纸作为尺寸参考（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．为了评估背景和照明变化在损伤估计中的效果，在六条条件下的白色和黑色背景上拍摄图像：i）Cazaux等人使用的照明条件。[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba];ii）扫描软件建议的自动亮度和对比度水平;iii）两个条件，包括在自动阈值下加入和减去10个亮度值，保持对比度;最后，iv）两个极端的照明条件。所有测试条件都概述在表格中GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba．来自三个独立玫瑰花的三个生物复制同时被用作单独的重复。GydF4y2Ba

在识别产生最低变异性和最接近的结果的条件之后，研究了这些方法的准确性，精度，再现性和协调性，包括分析中的BLA-2和kon拟南芥基因型。这两个上述载体位于拟南芥易感谱的相对端。KON是最容易影响的，因此，蜘蛛螨最损坏，BLA-2受到这种植物痤疮的最具抗性或更少的损坏[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．先前的信息被认为是重要的，以评估测试方法的可靠性。在最优光照条件下，在黑白背景下拍摄拟南芥Col-0、Kon和Bla-2基因型的图像。测试条件汇总在表中GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba．来自八个独立玫瑰花的八个生物重复，同时被用作单独的重复。GydF4y2Ba

所有图像采用Adobe RGB颜色模式，分辨率为1200 dpi，并保存为tiff文件。使用Adobe Photoshop程序从原始图像(复制/重命名)中分离出单独的玫瑰花簇，保留大小和分辨率，并保存为tiff文件(图。GydF4y2Ba1 bGydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

损害量化GydF4y2Ba

植物损伤被鉴定为蜘蛛螨喂养后检测到的氯化斑点的总面积。使用Adobe Photoshop CC 2018 V20.0进行饲料损坏的图像处理和定量[GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba]，APS评估V2.0 [GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]，compu眼睛（GydF4y2Bahttp://www.habsoft.com/compueye/leafsarea/GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]或ilastik 1.1.3（GydF4y2Bahttps://www.ilastik.org/GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]后跟斐济软件（GydF4y2Bahttps://fiji.sc.GydF4y2Ba) [GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba］．根据Cazaux等人的Photoshop程序，通过Photoshop程序进行了手动识别。[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]，并用作将结果与自动程序进行比较的标准方法。简而言之，在原始莲塞图像上产生层，并且将相同的方形尺寸的网格应用为导向器。通过使用点覆盖它们来手动识别受损区域。每个点对应于由栅格形成的小正方形。计算最终的点数并乘以正方形区域以获得总受损区域。GydF4y2Ba

对于这三个自动方法，附加文件中描述了主要后续步骤的摘要GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba．根据Bakr使用Compueye软件[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba］．简而言之，第一步是使用玫瑰花带扫描的毫米纸引导来校准系统。在不同的光照条件和背景下，对四种可用系统和软件的敏感性进行了测试。还尝试了自定义检测系统。系统/灵敏度组合，更好地匹配Photoshop中突出的区域，并用于批处理图像。在APS评估软件的情况下，以前的协议[GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba)，以特异性检测叶螨植物损伤。所有的分析均采用经典面板进行，并选择了能更好地再现标准区域的彩色平面和像素范围的组合。编写宏程序对不同光照条件和背景下的各基因型图像进行批处理。GydF4y2Ba

Visschers等人使用的方法的修改。[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba还测试了。上述方法使用Ilastik作为段图像的交互式机器学习工具[GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba］．使用由控制和处理的玫瑰花丝组成的图像训练该软件以识别受损组织。为每个特定照明条件和背景扫描的每个基因型进行培训，随机选择了六到七个受损和控制玫瑰花的图像。在训练阶段，标记了与背景，健康组织和受损区域相对应的像素。软件的特性来立即模拟图像的未标记区域，允许通过使用未标记的像素作为测试数据集来评估分类性能。修改了计划的错误确定的区域，这允许基于增加的培训标签的重新培训程序。软件指示的不确定区域被注释，以帮助结果的稳健性。重复先前的步骤，并在培训过程中向软件提供信息，直到在性能下没有检测到显着改善。通过将结果与由同一图像上的专家进行的手动分段进行比较来发生进一步的评估。使用来自培训过程的信息，在ILASTIK中打开图像（图。GydF4y2Ba1 cGydF4y2Ba)，分批分割(图。GydF4y2Ba1 dGydF4y2Ba），并导出斐济为8位图像（图。GydF4y2Ba1 eGydF4y2Ba)．然后，在斐济重新打开图像并转换为黑白（图。GydF4y2Ba1 fGydF4y2Ba)．为了区分噪声损坏，损坏区域被校正，从控制玫瑰色簇频率图中选择的簇大小阈值（图。GydF4y2Ba1克GydF4y2Ba)．设计了宏并处理了图像批处理。使用Ilastik-Fiji Tandem拟南芥玫瑰花纱的蜘蛛螨损伤的议定书在附加文件中详述GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba．我们的研究中心网站提供培训文件（GydF4y2Bahttp://www.cbgp.upm.es/files/ilastik_paper.php.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

数据纠正GydF4y2Ba

在通过自动方法损坏量化之后，使用无螨虫中识别的损坏来校正值。非侵染植物用于评估通常预期的受损组织的错误识别，这是由于玫瑰花的视觉复杂性。为此，在与其处理的对应物中使用的相同阈值和条件下分析每个基因型的控制玫瑰花纱。基于受损区域和总玫瑰花布区域计算每个对照植物上受损组织的百分比。根据以前的值计算平均百分比，该值乘以每个侵扰玫瑰花的总面积。然后通过减去平均百分比的均值通过每个总玫瑰花区的值来修改未校正的值。通过使用以下公式计算对照玫瑰花中检测到的受损区域的平均值：GydF4y2Ba

\（{\ ovline {x}} _ c \）GydF4y2Ba占对照玫瑰花纱中受损区域百分比的平均值;GydF4y2Ba达GydF4y2Ba_CI.GydF4y2Ba表示每个独立花环中的损坏区域(GydF4y2Ba一世GydF4y2Bath);GydF4y2BaTA.GydF4y2Ba_CI.GydF4y2Ba代表了总面积GydF4y2Ba一世GydF4y2Ba玫瑰花;和GydF4y2BaNGydF4y2Ba帐户占重复的数量。纠正数据通过：GydF4y2Ba

一种GydF4y2Ba_{一世GydF4y2Ba}占纠正损坏区域的GydF4y2Ba一世GydF4y2Ba玫瑰花;GydF4y2Ba达GydF4y2Ba_{“透明国际”GydF4y2Ba}代表未经矫正的受损区域GydF4y2Ba一世GydF4y2Ba玫瑰花;和GydF4y2BaTA.GydF4y2Ba_{“透明国际”GydF4y2Ba}治疗的总面积GydF4y2Ba一世GydF4y2Ba玫瑰花。GydF4y2Ba

在测试的每个照明/背景条件下，为每个基因型独立地进行先前的校正程序。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

为了评估自动方法的性能并与标准手动方法进行比较，评估准确性，精度，再现性，一致性和偏差的概念[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba］．通过广义的线性模型（GLM）分析来自照明条件的优化的数据。使用伽马分布和逆链接功能进行上述测试，以使用模型损伤〜程序*背景*条件分析照明和背景效果。通过用指数分布和逆链接功能改变照明条件和背景以及由GLM评估的数据来测试再现性，并应用最佳的拟合模型损伤〜程序*条件*基因型。Bland-Altmann（B＆A）图也用于视觉上识别可变性以及重复性系数（CR）。通过使用表达差异作为值的百分比的差异来比较一致性。还通过计算LIN的一致性系数（CCC）和Spearman相关系数（SCC）来展示协议。控制玫瑰花中的自动方法识别的损害表示为总面积的百分比，并使用GLM分析与伽马分布和最佳拟合模型损伤〜程序*条件*基因型的逆链接功能进行比较。用于分析所有GLM模型的Chi-Square分布试验。通过使用Bonferroni校正的一对比较分析来识别差异。 Rosette area for control and infested plants were compared by t-test. For all tests, results havingP.GydF4y2Ba值≤0.05被认为是显着的。所有统计和数据分析都是使用R软件3.5.3版进行的[GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

所有相关的支持数据集包含在文章中，其补充文件和GydF4y2Bahttp://www.cbgp.upm.es/files/ilastik_paper.php.GydF4y2Ba．在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。GydF4y2Ba

APS：GydF4y2Ba

美国植物病理学会GydF4y2Ba

宏：GydF4y2Ba

宏指令GydF4y2Ba

glm：GydF4y2Ba

广义线性模型GydF4y2Ba

SD：GydF4y2Ba

标准偏差GydF4y2Ba

简历:GydF4y2Ba

变异系数GydF4y2Ba

今敏:GydF4y2Ba

Kondara.GydF4y2Ba

BLA-2：GydF4y2Ba

布莱恩斯2GydF4y2Ba

今敏:GydF4y2Ba

Kondara.GydF4y2Ba

COL-0：GydF4y2Ba

Columbia-0GydF4y2Ba

b和a:GydF4y2Ba

平淡无二GydF4y2Ba

信用证：GydF4y2Ba

系数的可重复性GydF4y2Ba

CI：GydF4y2Ba

置信区间GydF4y2Ba

CCC：GydF4y2Ba

一致性相关系数GydF4y2Ba

RGB：GydF4y2Ba

红-绿-蓝GydF4y2Ba

鳞状细胞癌:GydF4y2Ba

Spearman相关系数GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

这项工作是项目Bio2017-83472-R和RamónyCajalGrant Ryc-2017-21818的财务支持，来自Ministerio deCongromíay竞争对手，并为“Ayudas Para LaRealizacióndeproyectosde i + d ParaJóvenesInvestigores en En ElMarco del CompinioPlorreual Entre La Comunidad de Madrid Y La UniversidadPolitécnicade Madrid“（Apoyo-jovenes-sur69-22-ytfc3z）。Programa Propio UPM Cofound Mes Ramon Y Cajal Somell。博士学位来自“GydF4y2BaLa Caixa“GydF4y2BaFoundation（ID 100010434）融资DOM（LCF / BQ / IN18 / 11660014）。该项目已收到欧洲联盟地平线2020年的资金，根据MarieSkłodowska-Curie Grant协议提供的第713673号。该资助者在研究设计，数据分析和解释或写作中没有作用。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas, Universidad Politécnica de Madrid - Instituto Nacional de Investigación y Tecnología农业与食品，马德里，西班牙GydF4y2Ba

   Dairon Ojeda-Martinez, Manuel Martinez, Isabel Diaz和M. Estrella SantamariaGydF4y2Ba

2. Dealtamento debiotecnología-biología植物，塞尔维拉·塔尼卡高级伊埃纳里亚·阿格隆莫里卡，Altiventia y de Biosistemas，大学MotitécnicadeMadrid，马德里，西班牙GydF4y2Ba

   Manuel Martinez＆Isabel DiazGydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

MES构思了这项研究。DOM进行了大部分实验研究。MES，DOM，MM和ID参与了数据的设计，获取，分析和解释，并为稿件的最终版本做出了贡献。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2BaM. Estrella Santamaria.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

本研究没有人类受试者。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商说明GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

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