硝酸种子硝酸盐同化和酚类抗氧化剂对磷酸盐途径的刺激，三种饲料植物物种的硝酸盐减少gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

硝酸盐对土壤和水的污染在世界范围内日益严重。政府也提出了相关的治理政策，大量学者研究了化学物理等去除水中硝酸盐的方法，但成本巨大。研究发现，包括草在内的种植系统有可能去除硝酸盐。然而，对其生长早期硝态氮连接途径和硝态氮同化的研究却很少。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们已经评估了三种不同的饲料植物物种与三个水平的过夜种子硝酸盐处理以及控制。通过测定2周龄新梢不同酶的活性，了解硝酸盐胁迫下这些植物脯氨酸相关戊糖磷酸途径、硝酸盐同化和酚类抗氧化反应系统。三种饲料植物在萌发期和生长早期均表现出较高的硝酸盐耐性。结果表明，在高硝酸盐处理下，三种饲料植物的可溶性酚类物质和总抗氧化活性均较高。在高硝态氮处理下，紫花苜蓿的G6PDH活性高，SDH活性低，其碳通量可能发生变化。苜蓿中这些酶的活性较高，SOD和GPX活性也较高。紫花苜蓿耐硝酸盐胁迫的有效机制还与较高的光化学效率有关。多年生黑麦草在高硝酸盐处理下也表现出良好的潜力，通过采用有效的机制对抗硝酸盐诱导的氧化胁迫。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

在硝酸盐处理条件下，3种饲料植物的发芽率均较理想，且具有良好的酶活性，具有去除硝酸盐的潜力。gydF4y2Ba

在二十一世纪，随着全球人口迅速增加，安全饮用水供应成为一项重大挑战。卫生条件差，五分之二的人口遭受差，五分之一的人无法进入世界上安全的饮用水[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]. 地下水污染的主要来源是家庭、工业和农业利用含有大量合成、无机和地质化合物的可再生淡水[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．地下水硝酸盐污染主要来源于氮肥、污水灌溉、有机肥和畜牧业。一项对不同污染物的一般性调查发现，硝酸盐(NOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba(¯)被认为是世界上最广泛的地下水污染物。在过去的几十年里，许多发展中国家和发达国家的地下水硝酸盐浓度都出现了大幅上升[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．为了提高单位面积作物产量和一般农产品，以满足人口逐步增长的需要，需要在土壤上施用大量化肥。氮(N)被认为是决定作物在土壤中的生产力和产量的一种不可或缺的投资[gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba]．每个人每年通过摄入蛋白质摄入大约4.5公斤的氮。据统计，目前世界人口每年增加约28吨蛋白质- n [gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

美国环境保护署（EPA）规定，饮用水中硝酸盐的最大污染水平（MCL）可为0.71 毫米（10 百万分之 = 10 NO毫克gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba¯-N升gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}）.地下水中的高硝酸盐浓度可能导致形成N-亚硝基化合物，该化合物已知是消化系统中的致癌物质，可能导致潜在的健康风险，如甲基喹啉症（蓝宝综合征），特别是在婴儿中gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba]．此外，牧草中硝酸盐的积累也会导致反刍动物硝酸盐中毒[gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba]．当硝酸盐污染地下水时，所涉及的水生植物的多样性将减少[gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba]．Zhang等人在华北平原69个调查点发现约52%的地下水样品硝酸盐超标[gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba]．Cretell等人。在连续盆地中记录了一个深度为180米的地下水样品，其中硝酸盐氮浓度超过45mg / l [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．在我国北方盆地2000多口浅层地下水监测井的地下水样品中，80%的主要污染物含有硝酸盐。此外，在许多浅层和深层地下水系统以及岩溶地貌中，发现硝态氮的中值浓度超过了最大持续浓度。受影响最严重的地区是靠近渤海的沿海地区[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]. 我们知道，目前去除硝酸盐的情况主要集中在化学、物理和生物策略上，但其中许多策略复杂且昂贵。相反，以植物为基础的高耐硝酸盐植物体系无论是在温室还是在田间或荒地条件下都是一种有效的策略，与其它领域有很大的差距，但目前应用前景广阔。与未种植湿地相比，种植不同健壮植物的湿地表现出较高的脱氮能力[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．草捕作物也减少N矿化，最重要的是有效减少硝酸盐淋溶[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]．制备硝酸盐去除策略的关键是通过筛选选择合适的饲料植物物种和品种。gydF4y2Ba

了解这些植物吸收和同化硝酸盐的生化机制，包括不同的途径调控具有重要意义。植物对硝酸盐的吸收是一个蛋白质介导的过程，而硝酸盐的同化需要三种酶依赖性的转化。过程如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．驱动戊糖磷酸盐途径可以为硝酸盐同化提供能量（NADPH），并提供植物所需的生长调节剂和酚。酶是这些方法的必需催化剂，例如SDH，其促进TCA过程中NADPH的产生。首先是硝酸盐（没有gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba¯）减少到亚硝酸盐（没有gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba¯）通过硝酸还原酶（NR），接下来，亚硝酸盐（没有gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba¯）被转化为铵（NHgydF4y2Ba_4.gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)，最后用谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶将铵还原为氨基酸[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．植物对吸收硝酸盐的有效利用很大程度上依赖于硝酸盐转化为铵和铵转化为氨基酸的效率[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．在硝酸还原酶的合成中，光是调节该过程中还原剂供应的最重要因素。许多研究报道说，由氧化戊糖磷酸磷酸盐途径产生的NADPH可以作为减少硝酸盐减少的替代的替代方法[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba那gydF4y2Ba17gydF4y2Ba那gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．Fd作为硝酸还原酶的电子供体，必须从NADPH中找到电子来还原Fd。硝酸盐(NOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba¯）同化是依照葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的FD-Thioredoxin依赖性活化，氧化戊糖磷酸磷途径的调节酶[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba那gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]．碳水化合物的氧化通过氧化戊糖磷酸途径也提供了还原亚硝酸盐(NOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba减少 [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

戊糖磷酸途径可以产生NADPH，其可用于硝酸盐降低胞质溶胶。通过G6PDH转化为核糖丝 - 5 - 磷酸盐以及NADPH的产生是第一个磷酸磷酸盐途径的第一种提发步骤[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]．戊糖磷酸途径作用于Seakimate和苯丙醇型途径，通过直接产生或调节植物积累酚类植物化学物质[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba那gydF4y2Ba23gydF4y2Ba那gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]．微生物相互作用过程中的脯氨酸合成和脯氨酸类似物处理驱动NADPH的利用，并提供NADP+，这是G6PDH的辅助因子[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba那gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．因此，它可能改善细胞NADPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ NADPH比率，可以刺激G6PDH。结果，磷酸磷酸磷酸盐途径的放松可以刺激合成的合成梭菌-4-磷酸酯，用于生物合成和苯基丙醇代谢物[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba那gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]．同时，脯氨酸作为减少当量，代替NADH，通过线粒体中的氧化磷酸化来合成ATP [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba那gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]．酶与氮同化和戊糖磷酸途径的关系如图2所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

根据生物合成外源肉毒杆菌酚类物质的相关性。gydF4y2Ba

植物抗氧化酶的物质和反应，提出了一种植物蛋白的作用模型[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba那gydF4y2Ba24gydF4y2Ba那gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．通过采用更有效的策略，水和土壤中的高硝酸盐浓度也可以产生类似的植物和植物的反应可以耐受应力。早期的生长期对硝酸盐应激的任何植物至关重要，尤其是萌发到前两片叶子的发育。在早期生长阶段，硝酸盐同化与脯氨酸相关的戊糖磷酸途径联合的植物可以提供更好的防硝酸盐浓度的防御策略。我们预测了三种饲料植物物种的研究，包括苜蓿（gydF4y2Ba紫花苜蓿gydF4y2BaL.)、高羊茅(gydF4y2BaFestuca arundinacea.gydF4y2Ba)和多年生黑麦草(gydF4y2Ba多年生黑麦草gydF4y2Ba揭示了这些饲料植物硝酸盐同化与脯氨酸相关磷酸戊糖途径的关系和保护高浓度硝酸盐的机制。gydF4y2Ba

植物吸收硝态氮的有效利用在很大程度上依赖于硝态氮还原为铵态氮和铵同化为氨基酸的效率，而氨基酸与硝酸还原酶活性密切相关。由于光在硝酸还原酶的合成中起着重要的作用，光化学效率已被选定。碳水化合物通过氧化戊糖磷酸途径氧化产生还原能力，G6DPH是这一过程中的调节酶，因此G6DPH是亚硝酸盐（NO2′）还原的关键因素。鉴于脯氨酸可作为还原剂清除活性氧，脯氨酸连接的磷酸戊糖途径可刺激总可溶性酚的生成，而总可溶性酚在对抗氧化应激中起重要作用，本研究测定了脯氨酸含量和总可溶性酚含量。SDH与TCA循环有关，TCA循环可以产生NADH作为还原剂。在硝酸盐胁迫下，脯氨酸可以刺激SOD、CAT、GPX等关键抗氧化酶的活性。在检验植物对土壤中硝酸盐和地下水硝酸盐去除效率的总体策略中，我们测量了总可溶性酚含量、硝酸还原酶活性、G6PDH、脯氨酸含量、SDH、关键抗氧化酶活性和光化学效率，探讨了这些饲料植物对高浓度硝酸盐的防御机制，以及硝酸盐同化与脯氨酸相关戊糖磷酸途径的关系。gydF4y2Ba

硝酸盐浓度对发芽率的影响gydF4y2Ba

用不同浓度硝酸盐处理的三种饲料植物物种的发芽率显示在图2中。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba. 在各浓度下，多年生黑麦草种子在实验室条件下的发芽率最高，紫花苜蓿种子的发芽率最低。在无硝酸盐处理的情况下，三种饲料植物种子的发芽率均在95%以上。硝酸盐浓度越高，三种植物的发芽率差异越明显。当硝酸盐浓度达到25 三种植物的发芽率差异最为明显。此时苜蓿的发芽率最低，仅为65%。但总的来说，随着硝酸盐浓度的增加，三种饲料植物种子的发芽率显著降低(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

种子硝酸盐处理后三种饲料植物种类的总溶解酚类和总抗氧化活性gydF4y2Ba

与对照相比，在硝酸盐处理后，在所有三种饲料植物物种中观察到酚类生物合成的刺激（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一种）。三种植物物种之间存在显着差异（gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)，紫花苜蓿的基线总可溶性酚含量较高，高羊茅次之，多年生黑麦草次之。随着硝酸盐浓度的增加，总可溶性酚含量大幅增加(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。苜蓿的总可溶性酚含量增加到0.80毫克gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba.F.W。1.00 mg.ggydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba.F.W。那一个n increase of 25%, while the content of perennial ryegrass’s total soluble phenol increased from 0.40 mg.g^-1gydF4y2Ba.F.W。0.50 mg.ggydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba.F.W。也增加了25%。采用自由基清除- ABTS法测定植物芽的抗氧化活性。与总可溶性酚含量相似，与抗氧化活性相关的自由基在三种植物之间存在显著差异(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)，苜蓿最高，高羊茅次之，黑麦草次之。从5毫米到10毫米知道gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba浓度，ABTS变化不大。但是从10毫米到25毫米的KNOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， ABTS显著增强(gydF4y2BapgydF4y2Ba < 0.05) (Fig.3.gydF4y2Bab).其中，苜蓿和高羊茅的ABTS增加速度快于多年生黑麦草。苜蓿的ABTS提高35%，高羊茅提高50%，多年生黑麦草则略有提高。gydF4y2Ba

硝酸种子处理后三种饲料植物的硝酸还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性gydF4y2Ba

在苜蓿中观察到硝酸还原酶（NR）活性，其显着高于其他两种植物的活性，随着硝酸盐浓度的增加而逐渐和显着增加（gydF4y2BapgydF4y2Ba < 0.05), when the nitrate concentration was 5-25 mM, the NR activity of alfalfa was twice that of other two plants (Fig.4.gydF4y2Baa） 是的。多年生黑麦草的NR活性在硝酸盐处理下表现出相似的变化趋势，但在25℃下的NR活性最高，只有苜蓿的一半 硝酸盐浓度。而高羊茅则没有明显的变化，始终在0.6μmolNO左右gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．ggydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba.F.W。HgydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba．结果表明，在这三种植物中，硝酸盐的浓度对苜蓿硝酸盐还原酶的活性具有更大的影响，以及对高氟乙酸的硝酸盐还原酶的活性有点影响（gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性在25mm KNO条件下均有提高gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba治疗(图。gydF4y2Ba4.gydF4y2Bab).值得注意的是，高羊茅葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性变化趋势差异较大，在10mm KNO时达到峰值gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba处理，与其他两种相比。与多年生黑麦草相比，苜蓿和高羊茅G6PDH含量显著高于多年生黑麦草(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。TCA (Kreb’s)循环中另一种重要的酶琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，琥珀酸脱氢酶)在不同硝酸盐处理下也表现出显著差异。gydF4y2Ba4.gydF4y2Bac).多年生黑麦草的琥珀酸脱氢酶活性低于其他两种，高羊茅的琥珀酸脱氢酶活性最高，其次是苜蓿(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。随着硝态氮浓度的增加，高羊茅和紫花苜蓿在硝态氮浓度为10 mM时达到最低gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba而多年生黑麦草处理则形成鲜明对比。这3种重要酶的研究结果表明，硝酸盐处理下3种不同饲料植物的途径调控存在差异。gydF4y2Ba

硝酸种子处理后三种饲料植物的总脯氨酸含量和脯氨酸脱氢酶活性gydF4y2Ba

三种植物在不同硝酸盐处理水平下的总脯氨酸含量如图所示。gydF4y2Ba5.gydF4y2Baa.但3种植物之间存在显著差异，其中苜蓿的总脯氨酸含量较高，高羊茅次之，多年生黑麦草次之(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。与对照相比，在高硝酸盐处理下，在高硝酸盐处理中，在多年生黑麦草中也显着增加了总脯氨酸含量和脱氢酶活性（图。gydF4y2Ba5.gydF4y2Bab).多年生黑麦草在10 mM KNO下PDH活性最高gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba治疗，接近17个单位.mggydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba蛋白质。与总脯氨酸含量不同，多年生黑麦草的PDH显著高于紫花苜蓿和高羊茅(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。高羊茅的PDH活性在3unit.mg之间略有变化gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba蛋白-6单位.mggydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba蛋白质在不同水平的knogydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba治疗方法。gydF4y2Ba

种子硝酸盐处理后三种饲料植物物种的超氧化物歧化酶，过氧化物酶活性gydF4y2Ba

测量不同的抗氧化酶以在早期生长阶段确定硝酸盐处理对这些饲料植物种类中的抗氧化酶反应系统的影响。超氧化物歧化酶活性在较高的硝酸盐处理下具有常年黑麦草和苜蓿的显着增加，而在高高的杂物中没有显着变化（图。gydF4y2Ba6.gydF4y2Baa).硝酸盐浓度为25 mM时，多年生黑麦草的SOD活性约为高羊茅的5倍。苜蓿和多年生黑麦草超氧化物歧化酶活性的升高可能是两种饲料植物在高硝酸盐处理下对活性氧(ROS)的应对措施。从图中可以看出。gydF4y2Ba6.gydF4y2Bab多年生黑麦草和高羊茅的过氧化氢酶活性均高于苜蓿(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。当硝态氮浓度为5 mM时，多年生黑麦草的过氧化氢酶活性增加了一半，而其他两种植物的CAT活性则没有增加的那么快。硝态氮摄入后，浓度的变化对3种植物(gydF4y2BapgydF4y2Ba> 0.05)。在硝酸盐处理下，苜蓿的愈缩菌过氧化物酶（GPX）活性显着增加（gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)(图gydF4y2Ba6.gydF4y2Bac).当硝态氮浓度为0 mM ~ 10 mM时，多年生黑麦草GPX活性显著降低(gydF4y2BapgydF4y2Ba<0.05），而高杂交的GPX活性不会显着增加（gydF4y2BapgydF4y2Ba> 0.05)。当硝态氮浓度为10 mM时，两种植物的GPX活性基本相同，为7.5 nmol.mggydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba蛋白质。当硝酸盐浓度从10%变化时，三种植物的GPX活性均显著提高 毫米至25毫米 毫米(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

种子硝酸盐治疗后三种饲料植物种类的光化学效率gydF4y2Ba

叶绿素荧光（FV / FM）[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba可用于指示植物响应氮胁迫的生理状态。通过使用FV / FM技术测定三种进料植物物种的光化学效率，并将FV / FM比的百分比增加为指数。具有不同浓度硝酸盐处理的三种饲料植物的光化学效率的较高百分比显着增加（gydF4y2BapgydF4y2Ba < 0.05) (Fig.7.gydF4y2Ba）.硝态氮处理后，多年生黑麦草的光化学效率增长最快，生长效率最高。3种饲料植物在种子硝态氮处理下的光合活性均较高，表明叶片NADPH和光合产物的产生可能是硝酸盐减少的原因之一。gydF4y2Ba

在0 mM ~ 25 mM的硝酸盐浓度范围内，虽然多年生黑麦草的耐受性较高，发芽率下降最少，但总体上，3种植物的发芽率下降了约25 - 30%，表明具有一定的硝酸盐耐受性。这与Kołodziejek等人观察到高浓度硝酸钾对四种石竹种子都有负面影响的结果一致[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．Figura等人也观察到硝酸盐抑制了兰花种子的萌发[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．这可能是因为植物种子对硝酸盐浓度敏感[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．硝酸盐浓度的增加可能导致抑制种子萌发，细胞死亡和活力丧失的毒性作用，从而减少种子萌发率[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．发芽率可以测量种子的生长情况，具有预测作用。但是，如果不测量它们的生长，就无法准确地知道这三种植物在后期的生长过程中是否受到硝酸盐的影响，也无法获得实际应用的证据。在未来，我们还会注意将发芽率和生长速率结合起来作为指标，使之更有说服力。gydF4y2Ba

高硝态氮处理下，苜蓿和高羊茅总抗氧化活性和总可溶性酚含量均较高，说明这些植物可能通过抗氧化反应系统积累酚，从而对抗细胞氧化应激。酚类化合物是广泛存在于植物中的次生代谢物[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]，具有还原、稳定和解离未配对电子的能力，能够与其他抗氧化剂和过渡金属螯合电位发生反应，具有抗氧化活性，在植物抗氧化防御途径中发挥重要作用[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba那gydF4y2Ba25gydF4y2Ba那gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba]．三种饲料植物在高硝酸盐处理中总可溶性酚的高积累表明，酚类抗氧化剂可能通过直接清除自由基或间接刺激抗氧化酶反应系统来抵御氧化应激[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．在非生物胁迫下，植物中总可溶性总酚含量和总抗氧化活性均较高[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

硝酸还原酶活性还与苜蓿和高硝酸盐处理下的苜蓿和多年生黑麦草中的G6PDH活性相结合。结果表明，高G6PDH活性在这两个物种中的戊糖磷酸途径和通过戊糖磷酸途径产生NADPH，减少硝酸盐。高氟乙酸中硝酸盐还原酶活性的饱和意味着在早期生长阶段中该物种中硝酸盐同化的限制。还观察到硝酸盐和亚硝酸盐的较高G6PDH活性gydF4y2Ba青霉菌chrysogenumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba),在gydF4y2BaChlamydomonas Reihardtii.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]早些时候。硝酸盐还原酶的不同同种型可以支持与戊糖磷酸途径连接的途径，其中可以更换NADPH和来自TCA循环的NADH。在盈高刘等人的研究中。［gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba和Hipkin等人[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba可以看到合理的解释，是盐胁迫下的G6PDH参与NR依赖性NO的产生，因此与NR活性有关。进一步转化为NR和G6PDH具有强烈的关系，它们正在增加或同步减小。gydF4y2Ba

高硝态氮处理下多年生黑麦草G6PDH活性高，SDH活性低。这可能是由于碳通量从糖酵解途径转移到磷酸戊糖途径，使NADPH降低，与脯氨酸相关的磷酸戊糖途径正相关的酚含量相应降低[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．但高的FESCUE在高硝酸盐处理下显示出不同的途径规则，略微增加了G6PDH和SDH活性。gydF4y2Ba

多年生黑麦草中脯氨酸含量高，PDH活性高，表明该物种在高硝酸盐处理下可能有效地进行脯氨酸氧化以维持氧化磷酸化。较高的硝酸盐处理可能促进糖酵解和磷酸戊糖途径合成NADPH，从而提高发芽率，也可能诱导脯氨酸合成[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]，从而保护某些物种(如多年生黑麦草)的硝酸盐还原酶和脯氨酸氧化，从而节约能源，在压力下发挥更有效的作用。这也与Sarkar等人观察到的事实相一致，他们发现多年生黑麦草中更高的磷酸戊糖通路刺激[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．此外，苜蓿和高羊茅可能通过产生更多的NADPH和支持不同的细胞功能合成需求，通过不同的机制和途径调控来对抗硝酸盐诱导的氧化应激。gydF4y2Ba

苜蓿通过提高SOD和GPX活性来抑制硝酸盐诱导的氧化应激，其中多年生黑麦草和高羊茅的SOD和过氧化氢酶活性分别较高。这可能是因为单个酚类的变化改变了SOD的刺激和CAT的消除[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．高硝酸盐处理使活性氧过量产生，引起氧化应激。植物抗氧化酶如SOD、CAT等会增加，以清除活性氧抗氧化，维持细胞稳态[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

高光化学效率以及高级驱动的磷酸磷酸途径表明，碳通量可以是换档并利用不同的细胞机制，通过诱导不同的响应系统来保持氧化还原平衡。洪等人。，Wang等人和Al Gehani等。指出，硝酸盐可以增加光合色素并减少活性氧的产生，进一步诱导PSII的潜在光化学效率的提高，并增加PSII的电子传输活性;硝酸盐还可以是未调节的抗氧化基因，刺激抗氧化酶的产生，从而提高F的效率gydF4y2Ba_vgydF4y2Ba/ FgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba［gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba]同时，硝酸盐通过渗透吸收水分和合成蛋白质介导，使光合系统自我修复并增强FgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba/ FgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba，影响植物的良性发展[gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba]．Al Gehani的研究[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba]等指出，适当的硝酸盐可以降低盐碱化植物的盐化效应，促进植物生长。因此，可以解释硝态氮处理下三种植物光化学效率的百分比增加。此外，Al Gehani等人的研究也可以看出这一点。gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba]的研究结果表明，添加NO水平可提高番茄幼苗的耐盐性gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba全日空航空公司gydF4y2Ba_4.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

然而，实验讨论了一个简单的情况，这与硝酸盐不被外界改变的情况是一致的。如果硝酸盐由于水蚀等因素迁移，实际浓度会降低，由此产生的实验现象会更接近较低浓度产生的实验现象，这是复杂且难以确定的。因此，湿地和/或水生植物净化硝酸盐的研究可能是下一步的工作。gydF4y2Ba

以上结果表明，3种饲料植物的种子在25 mM KNO胁迫下均能耐受和正常发芽gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba治疗。三种种子中，多年生黑麦草的发芽率最高，高羊茅次之，紫花苜蓿最低，与未经硝酸盐处理的初始发芽率一致。在这种治疗下，最初的生长和细胞功能也保持正常。硝酸盐处理下三种饲料植物的初始耐性和生化调节机制不同。紫花苜蓿被发现更强大，并采用酚连接诱导抗氧化反应驱动戊糖磷酸途径结合硝酸盐还原。G6DPH是磷酸戊糖途径的第一步，提示NADPH的增加，因此在硝酸还原酶的帮助下支持硝酸盐还原为亚硝酸盐。紫花苜蓿和多年生黑麦草中SOD含量较高，说明它们通过诱导高抗氧化酶来对抗活性氧。多年生黑麦草在生长初期对硝酸盐诱导的氧化胁迫也表现出部分不同的有效生化调控。可以推测，SOD、CAT、GPX和脯氨酸相关戊糖磷酸途径等关键抗氧化酶可能在硝酸盐胁迫耐受中起重要作用。高羊茅对高硝态氮胁迫的反应不同，可能采用不同的机制。利用脯氨酸相关戊糖磷酸途径刺激植物中的酚类植物化学物质也有帮助。高耐硝酸盐性使人们有机会在被硝酸盐污染的土壤或水中使用和培育这些物种，这有助于产生额外的价值，作为食物和饲料。gydF4y2Ba

种子发芽率测定gydF4y2Ba

在种子萌发阶段，种子（江苏省江苏，中国）的苜蓿（gydF4y2Ba紫花苜蓿gydF4y2BaL.)品种-高羊茅gydF4y2BaFestuca arundinacea.gydF4y2BaL.)品种-金岛和多年生黑麦草(gydF4y2Ba多年生黑麦草gydF4y2BaL.）品种 - 太阳岛被收集为材料，并在不同的硝酸盐浓度下发芽。学习材料的代表优惠券标本沉积在中国科学院武汉植物园。植物材料的集合是在生物学家中李的方向下进行的。种子以三种不同的硝酸盐浓度处理（5 mm KnogydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba, 10 嗯，克诺gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba25mm KNOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba）通过清洁水进行一种对照，并确定种子萌发率。短暂的说，分别将25种苜蓿种子和50个高的FESCES和50多年生黑麦草种子分别置于锥形烧瓶中，浸入250ml不同浓度的硝酸盐溶液中，然后通过摇动台摇摆过夜。然后将这些种子转移到具有三层吸收纸的培养皿中，一层Whatman＃1滤纸，含有相应浓度的硝酸盐溶液。然后将这些菜肴置于20°C的室内，连续白光（340μmol.mgydF4y2Ba^-2gydF4y2Ba．年代gydF4y2Ba^-1gydF4y2Ba）.用Whatman＃1滤纸替换旧滤纸，每隔一天用硝酸盐对应浓度的硝酸盐溶液润湿。将胚根根突破一半的种子吠声长度作为萌发标准，1周后，登记萌发总数，计算种子的发芽率，收集种子的萌发速率，并收集生长组织的样品进行生化分析。gydF4y2Ba

酶提取gydF4y2Ba

参考Lin等人的实验方法[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，将酶提取缓冲液加入的0.5％聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）和3mM EDTA至0.1M磷酸钾缓冲液，pH值为7.5，然后使用冷杵和电动机磨削植物叶片组织（200mg）。之后，在2-5℃下以12000×g离心15分钟，然后储存在冰上[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba那gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba]．收集上清液进行分析。gydF4y2Ba

总蛋白质测定gydF4y2Ba

Bradford测定的手段用于测量蛋白质含量[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba那gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]. 首先，用4倍蒸馏水稀释染料试剂浓缩液（BioRad蛋白质分析试剂盒II，Bio-Rad实验室，Hercules，CA）。然后，拿了5块 稀释染料试剂mL和100 微升植物组织提取液旋涡培养5分钟 最后，用紫外-可见分光光度计（纽约州罗切斯特市米尔顿罗伊公司）测量5 mL试剂空白和100 595μL缓冲溶液 纳米。gydF4y2Ba

总可溶性酚类测定gydF4y2Ba

folin-ciocalteu方法[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba那gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba用于分析植物叶中的总酚类含量。吸光度在725nm处获得。吸光度读数被翻译成总酚类，并表达了每克每克新鲜重量（FW）的无碱的小酸的毫克当量。在95％乙醇中利用各种浓度的小酸确立了标准曲线gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

ABTS [2,2'-唑胺 - 双（3​​-乙基噻唑啉-6-磺酸）]阳离子自由基和抗氧化活性测定gydF4y2Ba

采用ABTS法测定蠕动弯曲植物叶片提取物的总抗氧化活性gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba自由基阳离子脱色试验涉及执行ABTSgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba阳离子自由基[gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba]．abt的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba采用ABTS (Sigma Chemical Co.St.)反应制备自由基阳离子。Louis, MO)水溶液和过硫酸钾，室温下避光12-16小时，分析。gydF4y2Ba

分析前，稀释ABTSgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba储备溶液95%乙醇(比例1:88)，和。gydF4y2Ba

在734 nm处吸光度为0.70±0.02，平衡至30°C。将mL ABTS体积的ABTS加入含50 uL各组织提取液的玻璃管中，用涡流混合器混合30 s。超过2.5 min的孵育，混合物在734 nm处获得吸光度。采用5 mM的Trolox乙醇原液进行分析，活性范围为0 ~ 20 μM。抑制率计算方法为:gydF4y2Ba

硝酸还原酶活性测定gydF4y2Ba

Snell和Snell [gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba[]对植物叶片组织中硝酸还原酶(NR)活性的测定方法进行了改进并应用于研究。在530 nm波长下用分光光度法测定亚硝酸盐浓度。不同浓度亚硝酸钠(0、0.02、0.10、0.50 μmol/mL)溶液与蒸馏水建立标准曲线。以μmol亚硝酸盐产生g FW时，测定其硝酸还原酶活性gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}hgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)测定gydF4y2Ba

在该测定中，遵循Deutsch（1983）描述的测定的修改版本[gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba]．每分钟吸光度变化的比值可以通过NADPH (6.22 mM)的消光系数来量化混合物中的酶gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}厘米gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}）.gydF4y2Ba

琥珀酸脱氢酶(SDH)测定gydF4y2Ba

琥珀酸脱氢酶活性的测定采用Bregman [gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba]．每分钟吸光度差异的比率可以使用DCPIP的灭绝共同效率来定量混合物中的酶（19.1mmgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}厘米gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}）.gydF4y2Ba

高效液相色谱法分析脯氨酸gydF4y2Ba

采用配备二极管阵列检测器（dad1100）的agilent1100型液相色谱仪进行高效液相色谱分析。反相核苷C18250 纳米 × 4.6 mm为分析柱，填料粒径为5 μm。洗脱提取物样品的流动相为20 mM磷酸钾（pH 2.5磷酸盐），流速为1 毫升 最小gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}，检测波长210 nm。l -脯氨酸(Sigma chemicals, St. Louis, MO)用于校准标准曲线[gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba]. 样品中的脯氨酸含量表示为每毫升脯氨酸毫克数，并换算成毫克gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}弗兰克-威廉姆斯。gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶（SOD）测定gydF4y2Ba

在竞争性抑制测定中，通过使用黄嘌呤 - 黄嘌呤氧化酶产生的超氧化物进行硝基蓝四唑（NBT）到蓝甲烷氮的还原。SOD活性的560nm指示的分光光度法测定的NBT [gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba]．一个单位的SOD被调节为阻止NBT减少到最大值的50%的蛋白质的数量。gydF4y2Ba

过氧化氢酶（猫）测定gydF4y2Ba

通过最初由贝尔和Sizer描述的方法从测量中取出过氧化氢酶的活性[gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba]．用分光光度法测定过氧化物的消失。吸光度的差异ΔAgydF4y2Ba_240gydF4y2Ba/分钟从初始（45秒）的线性部分计算。一种过氧化氢酶活性的单位定义为分解一体微摩的量gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

愈创木酚过氧化物酶(GPX)测定gydF4y2Ba

本试验采用Laloue等人开发的改良方法[gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba]．用每分钟吸光度变化的比率来量化混合物中的酶，使用氧化产物四胍酚(26.6 mM)的消光系数gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}厘米gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}）.gydF4y2Ba

光化学效率gydF4y2Ba

用OS1-FL (Fluorometer, Opti-Sciences, Inc.， Tyngsboro, Mass)测量植物芽的光化学效率。试验在暗适应模式下进行，FgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba/ FgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba(FgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba/ FgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba= [FgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba- FgydF4y2Ba_ogydF4y2Ba) / FgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba计算变量荧光与最大荧光的比值。然后计算增长的百分比。测定前将植株置于黑暗中至少2小时。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有实验均进行四次复制。在社会科学统计包的差异（Anova）的分析的基础上确定了硝酸盐治疗的影响（适用于Windows，SPSS Inc.，芝加哥，IL，U.S.A.的SPSS 18.0）。根据0.05概率水平的最低差异（LSD）试验确定三种饲料植物物种中硝酸盐处理的差异。gydF4y2Ba

来自所有实验的原始数据以及本手稿中使用的材料可以在合理的请求时从相应的作者获得。gydF4y2Ba

ABTS，2：gydF4y2Ba

2'-氮杂-BIS（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）gydF4y2Ba

猫:gydF4y2Ba

过氧化氢酶gydF4y2Ba

爸爸：gydF4y2Ba

二极管阵列检测器gydF4y2Ba

环保局:gydF4y2Ba

美国环境保护署gydF4y2Ba

G6PDH：gydF4y2Ba

Glucose-6-phosphate脱氢酶gydF4y2Ba

总分：gydF4y2Ba

愈创木酚过氧化物酶gydF4y2Ba

HPLC：gydF4y2Ba

高效液相色谱法gydF4y2Ba

主控灯：gydF4y2Ba

最大污染水平gydF4y2Ba

编号：gydF4y2Ba

氮gydF4y2Ba

电视台:gydF4y2Ba

硝基蓝色四唑唑唑gydF4y2Ba

全日空航空公司gydF4y2Ba_4.gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

铵gydF4y2Ba

近红外光谱:gydF4y2Ba

亚硝酸盐还原酶gydF4y2Ba

号码gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba¯:gydF4y2Ba

亚硝酸盐gydF4y2Ba

号码gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba¯:gydF4y2Ba

硝酸盐gydF4y2Ba

NR:gydF4y2Ba

硝酸还原酶gydF4y2Ba

PVP:gydF4y2Ba

聚乙烯吡咯烷酮gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

SDH:gydF4y2Ba

琥珀酸脱氢酶gydF4y2Ba

SOD:gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

我们感谢Kalathas Shetty博士和Dipa​​yan Sarkar博士就此方法提供了技术咨询。gydF4y2Ba

国家自然科学基金项目(No. 41807364);四川农业大学“211工程双支撑计划”(No. 03572195);四川省教育厅重大项目(No. 17zb0338)资助。关键词:边坡，抗剪强度，抗剪强度，抗剪强度资金用于实验支付。没有资助者参与本次研究的设计、数据的收集、分析、解读和手稿的撰写。gydF4y2Ba

作者笔记gydF4y2Ba

1. 林德荣、黄逸臣、赵晶晶、吴志军等对这一工作做出了同等贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 2 .四川农业大学食品学院，雅安625014gydF4y2Ba

   Derong Lin，Yichjing Huang，景景赵，舒良刘，文琴，鼎涛吴，洪辰和清章gydF4y2Ba

2. 2 .四川农业大学机电工程学院，雅安625014gydF4y2Ba

   新吴gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

DL进行了遗传学研究，参与了硝酸盐实验并起草了手稿。YH、ZW和JZ参加了硝酸盐实验。DL参与了研究的设计，并进行了统计分析。SL、HC、QZ、WQ、DW构思了该研究，并参与了该研究的设计与协调，协助撰写了论文。所有作者阅读并批准最终稿件。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

通信gydF4y2Ba林德荣gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料包括在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用线中另有说明。如果材料没有包含在文章的创作共用许可证中，而您的预期使用不被法律法规允许或超过允许的使用，您将需要直接获得版权持有人的许可。如欲浏览本许可证的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．“创作共用公共领域”豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba