褪黑激素可以通过对葡萄浆果的DNA甲基化和基因表达的影响增加抗病抗性和黄酮类生物合成GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

褪黑素可以通过引起基因表达的全局变化来调节植物生长，发育和生物反应;然而，通过DNA甲基化改性的褪黑激素诱导的基因表达的变化仍不清楚植物。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在对照和褪黑激素处理的葡萄浆中，共鉴定了总共1,169,852和1,008,894甲基化胞嘧啶（MCS），MCS主要发生在CG位点，然后是CHG位点和CHH位点。与对照相比，褪黑素处理在各种基因区中的CHG和特别是CHH位点的甲基化水平宽程度地降低。褪黑激素处理共产生25,125个差异甲基化区域（DMR），其包括6517dMR相关基因。RNA-SEQ证明了2479个基因被上调，并通过褪黑激素处理压抑了1072个基因。评价DNA甲基族和转录组的互连鉴定的144个基因显示出促进剂甲基化和基因表达的负相关，其主要与生物应激反应和黄酮类生物合成相关。此外，5-氮杂胞苷和褪黑激素的应用导致对菌丝体生长的影响GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba，浆果腐烂率和类黄酮生物合成。此外,GydF4y2BaEDS1.GydF4y2Ba研究表明褪黑素通过降低启动子甲基化水平来增加基因表达。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的结果表明，褪黑素广泛减少了DNA甲基化和改变基因表达的葡萄浆果。我们认为褪黑素可以通过降低相关基因启动子的甲基化水平来增加抗病能力和类黄酮的生物合成。GydF4y2Ba

葡萄是世界上最重要的经济水果作物之一。提高葡萄品质和抗病性是目前葡萄栽培的重点。整个葡萄浆果，包括果皮、果肉和种子，都含有褪黑激素(n -乙酰基-5-甲氧基色胺)[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．褪黑素是一种信号分子，在生物和非生物压力下起保护作用。褪黑激素参与调节对各种植物病害的耐受性。例如，褪黑素诱导对疾病的抵抗力GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba通过调节JA信号和H番茄果实GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba提高和提高抗病能力GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba通过NO信号抑制病原体感染[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．由MeRAV1和MERAV2激活的褪黑素含量的增加增强了植物对木薯细菌性枯萎病的抗性[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．此外，外源性褪黑激素处理和内源性褪黑激素诱导都增加了许多植物对非生物胁迫的耐受性。据报道，褪黑素可以减轻葡萄中的盐分损害[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]增强苹果植物的耐旱性[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．内源性增加褪黑素通过过表达GydF4y2BaASMT1GydF4y2Ba显着增强了干旱耐受性GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba植物 [GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

褪黑素是一种多功能信号分子[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]通过与其他信号分子的相互作用来促进葡萄浆果成熟和质量形成[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．据报道，褪黑激素还可以促进番茄和香蕉成熟，从而影响果实品质[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]．此外，一些其他研究强调了褪黑素在水果中调节代谢物积累方面的作用。例如，褪黑激素治疗增强了葡萄浆果和葡萄酒中总花青素，酚和黄酮类化合物的含量[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]．与褪黑激素的收获后处理增加了番茄水果中总酚和花青素的含量[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

褪黑素对应力耐受性和果实发育的影响大大归因于基因表达的调节。由褪黑激素引起的全局基因表达改变显示褪黑激素诱导水稻芽中的ROS清除耐盐性[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．转录组分析显示出与多酚代谢，碳水化合物代谢和乙烯生物合成相关的基因表达的全局变化，并在葡萄浆果中对褪黑激素处理时的信号传导[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]．蛋白质组学数据表明，241个蛋白质受番茄水果中褪黑素的显着影响[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]．arnao和hernández-ruiz总结了在给定生理条件下由褪黑激素的上调的基因，包括不同植物中的各种非生物胁迫源和生物胁迫源[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

DNA甲基化是一种重要的表观遗传改性，其在调节多种生物学过程中起着非常重要的作用，包括通过调节基因表达预测来调节基因反应，生长，发育和果实成熟。GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]．甲基组分析表明，镉胁迫下水稻大部分DNA甲基化修饰基因发生转录改变[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]在橙色果实成熟期间发生DNA甲基化的全局增加[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．此外，一些特定的基因，如果实成熟相关的RIN和PSY1，在果实成熟过程中启动子上出现去甲基化以激活转录[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]．值得注意的是，越来越多的研究表明褪黑激素改变了整体的DNA甲基化水平[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba或特定基因的DNA甲基化[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]在人类中。然而，通过甲基化改性的褪黑激素的基因表达的调节仍不清楚植物。GydF4y2Ba

在该研究中，分析了DNA甲基族和RNA转录组在对照和褪黑激素处理的葡萄浆中分析，并对其互连的分析显示了褪黑素在增加黄酮类生物合成和抗病性抗性中的关键作用。通过确定褪黑素诱导的类黄酮含量，浆果衰减率和所选基因的促进剂甲基化水平的褪黑素诱导的变化进一步验证褪黑激素的这些功能。这些发现提供了一种了解褪黑素在调节葡萄浆内的基因转录中的作用的新视角。GydF4y2Ba

外源褪黑激素治疗增加了“梅洛”葡萄浆果中的褪黑激素含量GydF4y2Ba

外源褪黑激素处理用于增加葡萄浆果的褪黑素含量。Veraison（浆果成熟的发病）是使用信号分子熟化调节的关键时期，并且褪黑素水平在Veraison开始增加[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．糖和花青素的积累表明了Veraison的发生以及可滴定的酸度下降。在'Merlot'葡萄浆果中，花青素在盛开后80天开始积累，并且着色开始于90达布（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba从80 DAB开始，总可溶性固形物(TSS)和可滴定酸分别持续积累和减少(图1)。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa，b）。因此，在大约80令达到80Ab的情况下发生Veraison，并且在此时间点进行褪黑激素处理。用50μm褪黑激素的处理显着增加了浆果的褪黑激素含量，与对照浆果相比，在治疗（帽子）后，在4,48和144小时中产生1.24-，4.45-和9.02倍的增量（图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC）。GydF4y2Ba

DNA甲基化分析控制和褪黑素处理的'Merlot'葡萄浆果GydF4y2Ba

在48 HAT采集的对照和褪黑素处理过的浆果用于BS-Seq单碱基DNA甲基化。共生成了877,654、62和889,758,30个clean reads，转化率(C to G)分别为99.54和99.47%。对照和褪黑素处理浆果的平均阅读深度分别为12.25 G和12.42 G，作图率为54.33和54.31%(表SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.在对照和褪黑素处理的葡萄中分别鉴定出1,169,852和1,008,894个甲基胞嘧啶(mCs)。在对照/褪黑激素处理中，42.10%/40.52%的mCs在CG位点，30.35%/29.47%在CHG位点，27.53%/29.99%在CHH位点(H = A, T，或C)(表SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

对照和褪黑激素处理的浆果在19染色体上显示出非常相似的MC型材（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa).三种mCs在同一染色体上的分布模式相似。不同染色体甲基化水平和mC分布不同。例如，Chrs 16和Chrs 8的甲基化水平在染色体中分别最高和最低;在Chrs 4、6、7的中心位置附近有一个高mc区，而在Chrs 18、1、8、17的一侧有高甲基化水平(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种）。另外，与对照和褪黑激素处理的浆果中的CHG和CHH语境相比，在CG上下文中检测高甲基化水平（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab)。对照和褪黑激素处理的浆果之间的甲基化水平的比较显示出比在启动子，内含子和下游区域中的外显子中的差异甲基化胞嘧啶较高百分比（图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaC）。另外，基因体通常显示比其上游和下游区域更高的甲基化水平（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab).此外，褪黑激素大大降低了基因上游、基因体和下游区域CHH环境中的甲基化水平。相比之下，褪黑素在CHG环境中广泛降低了不同基因区域的甲基化水平，但程度较轻，仅在基因体中导致了CG甲基化水平的轻微下降(图)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab)。GydF4y2Ba

差异甲基化区(DMR)相关基因的基因本体(GO)和KEGG富集GydF4y2Ba

共检测DMRs 25125例(倍数变化≥4或≤0.25，GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05) between the control and melatonin-treated berries. Compared to the control, the methylation levels of 9000 and 16,125 DMRs were increased and decreased, respectively, by melatonin in grape berries. The total DMRs included 6517 DMR-associated genes in upstream, exon, intron and downstream regions (Table S2GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

致DMR相关基因的富集表明，三种最显着改变的生物过程是DTDP-rhamnose生物合成过程，乙醇代谢过程和铁螯合物运输。也显着改变酶导向rRNA 2'-O-甲基化和替代MRNA剪接（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa). dmr相关基因的分子功能主要包括碳水化合物激酶活性、胆固醇结合、三糖-磷酸跨膜转运蛋白活性和胱硫氨酸-裂解酶活性。大多数dmr相关蛋白位于细胞核(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。Kegg途径分析表明，三种最具显着变化的途径是戊糖和葡糖醇互连，肌醇磷酸盐代谢和脂肪酸降解。另外，显着改变了氨基酸的代谢，包括赖氨酸，亚油酸和α-亚麻酸，包括类胡萝卜素和异黄酮，包括类胡萝卜素（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab)。GydF4y2Ba

褪黑激素治疗改变了“Merlot”葡萄浆果中的全球基因表达模式GydF4y2Ba

使用RNA-SEQ检测对照和褪黑激素处理的浆果的转录性丰度。共3551个差异表达基因（DEGS）（|日志GydF4y2Ba_2GydF4y2BaFC | > 1,GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)在褪黑素处理的浆果中与对照组相比。与对照相比，2479个基因表达上调，1072个基因表达下调(表SGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba， 图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种）。富集证明了生物过程类别中的参数主要与防御反应相关，包括对生物刺激，甲壳素和真菌的反应。在分子函数中，该次数主要参与三羟基苯乙烯合酶活性，DNA结合转录因子活性和异构酶活性。DEG的推断蛋白主要位于置换器和血浆膜中（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab)。Kegg途径分析表明，最显着改变的途径是黄酮类生物合成，昼夜节律植物和植物病原体相互作用途径（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC）。GydF4y2Ba

DNA甲基和RNA转录组的互连GydF4y2Ba

通过dmr相关基因和DEGs交叉分析，共鉴定出1626个基因。其中886个基因的表达量与甲基化水平呈负相关(54.5%)，740个基因的表达量与甲基化水平呈正相关(45.5%)(表SGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba， 图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。另外，与对照相比，大多数相互连接的基因在褪黑激素处理的浆果中显示出上调的表达水平（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。GydF4y2Ba

基因启动子区域的甲基化可以抑制DNA转录，这已被证实[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．在该研究中，我们鉴定了144个差异甲基化的启动子（DMP） - 在促进剂甲基化水平和表达水平之间表现出阴性关联的差异基因，其中133个基因呈现上调表达和降低的促进剂甲基化，并且13个基因显示相反的关系（表SGydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.验证启动子甲基化和基因表达水平之间的关联，三种基因参与黄酮类生物合成和植物 - 病原体相互作用（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)进行甲基化特异性PCR (MS-PCR)和qRT-PCR分析。与对照组相比，褪黑素处理的浆果表现出低水平的启动子甲基化和高水平的基因表达(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab，c）。几乎所有相互联系的基因与防御反应有关，包括对生物刺激，水杨酸，甲壳素，细菌和真菌的反应。它们的分子功能包括铁螯合物还原酶，钙转运ATP酶和三羟基苯乙烯合酶酶活性。推断的蛋白位于质膜中并在质膜外部（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bad).另外，基于这144个基因，两个KEGG通路显著改变:植物-病原体互作(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba = 7.57 × 10^{- 6GydF4y2Ba})和类黄酮生物合成(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba = 7.47 × 10^{- 4.GydF4y2Ba}）.GydF4y2Ba

此外，17个基因的基因函数具有最大的表达变化（|对数GydF4y2Ba_2GydF4y2BaFC| > 3或只在褪黑素处理过的浆果中检测到)和methylation levels (|log_2GydF4y2BaFC | > 2 or detected only in control berries) in the promoter region are listed. Among these genes,PAL1GydF4y2Ba和GydF4y2BaSTS1.GydF4y2Ba负责黄酮类生物合成。四种基因的功能是未知的。剩余的基因包括GydF4y2BaEDS1.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCML41.GydF4y2Ba与疾病抗性和/或非生物胁迫反应有关(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

褪黑激素和DNA甲基化抑制剂治疗增加抗病抗性和黄酮类化合物在葡萄浆果中的积累GydF4y2Ba

为了探讨褪黑素是否影响葡萄浆果的抗病抗性，进行了50微米的分离的'梅洛'和“闪耀马斯喀特”浆果的褪黑激素治疗。褪黑激素显然降低了受伤的“梅洛”浆果表面的菌丝体生长GydF4y2BaBotrytis cinereaGydF4y2Ba（GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba)，对照浆果(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba一种）。褪黑激素减少了“闪亮马斯喀特”浆果的衰减率而不接种GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba在14和21日（图21日）（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab, c)。此外，本研究采用了常用的DNA甲基化抑制剂5́-azacytidine(5́-Aza) [GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]．5-AZA的应用导致对菌丝体生长的类似效果GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba与褪黑激素相比，浆果衰变率（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaA-C）。因此，褪黑激素和5-AZA增加葡萄浆果的抗病性。另一方面，测定了褪黑激素和5-αza对类黄酮含量的影响。褪黑激素和5-AZA增加了3个DAT的“Merlot”和/或闪光肌肉'浆果的类黄酮含量（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bad）。GydF4y2Ba

另外，褪黑激素上调了表达水平GydF4y2BaPAL1GydF4y2Ba那GydF4y2BaSTS1.GydF4y2Ba那GydF4y2BaEDS1.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCML41.GydF4y2Ba，与黄酮类生物合成或植物 - 病原体相互作用有关（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba），在3 dat的'merlot'浆果中（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bae).褪黑素和5́-Aza均增加了分离的麝香果中上述四个基因的表达水平(图3。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaF）。此外，褪黑激素和5-AZA都降低了启动子区的甲基化水平GydF4y2BaSTS1.GydF4y2Ba那GydF4y2BaEDS1.GydF4y2Ba和GydF4y2BaCML41.GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bag).总体而言，褪黑素和5́-Aza增加了葡萄果实的抗病性和类黄酮积累，这可能与启动子区去甲基化导致基因表达上调有关。GydF4y2Ba

褪黑激素诱导的启动子转录驱动能力的增加由DNA（胞嘧啶-5） - 甲基转移酶1（met1）负调节GydF4y2Ba

如图1和图2所示。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaB，C和GydF4y2Ba6.GydF4y2BaE-G，褪黑激素处理降低了启动子甲基化水平并增加了三种选定基因的表达水平。另外，表达水平GydF4y2BaMET1.GydF4y2Ba那GydF4y2BaMet1B.GydF4y2Ba和GydF4y2BaS-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶GydF4y2Ba（GydF4y2Ba悲伤GydF4y2Ba通过褪黑激素根据RNA-SEQ和QRT-PCR的结果显着下调（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Baa），与褪黑激素诱导的甲基化水平的降低一致（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab)。相比之下，两个表达水平的变化GydF4y2BaCMT2.GydF4y2Ba基因与褪黑素治疗下甲基化水平的降低没有关联(图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaB，GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba一种）。为了进一步通过改性促进剂甲基化来阐明褪黑激素是否调节基因表达，GydF4y2BaMET1.GydF4y2Ba(VIT_212s0035g01770)用于提高甲基化水平GydF4y2Ba增强疾病易感性1GydF4y2Ba（GydF4y2BaEDS1.GydF4y2Ba) (VIT_217s0000g07370)的启动子。的GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba介断的p的瞬态表达GydF4y2Ba_edsGydF4y2Ba（atg上游800 bpGydF4y2BaEDS1.GydF4y2Ba， 图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba-35年代)miniGUS激活GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba葡萄愈伤组织的表达(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bac).相对于PGydF4y2Ba_edsGydF4y2Ba-35S miniGUS单独，P的协变换GydF4y2Ba_edsGydF4y2Ba-35S miniGUS和35S::MET1降低了GUS染色程度和GUS活性(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaC，D）。因此，Met1引起的甲基化水平的增加降低了P的转录驱动能力GydF4y2Ba_edsGydF4y2Ba．另外，表达p的褪黑激素处理的愈伤组织GydF4y2Ba_edsGydF4y2Ba-35s薄椎蕊是蓝色的彩色，并且表现出比对照愈伤组织和褪黑激素处理的愈伤组织与pGydF4y2Ba_edsGydF4y2Ba-35S miniGUS和35S::MET1(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bac, d)。此外，上述共转化子显示甲基化水平增加GydF4y2BaEDS1.GydF4y2Ba促进剂与表达P的愈伤组织相比GydF4y2Ba_edsGydF4y2Ba-35S在褪黑激素处理下单独的小孔（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bae).总体而言，褪黑素增加了P的转录驱动能力GydF4y2Ba_edsGydF4y2Ba，至少部分通过降低p的甲基化水平GydF4y2Ba_edsGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

甲基化主要发生在CG上下文中，然后是CHG和CHH的环境，包括水稻（CG：54.7％，CHG：37.3％，CHH：12％）[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba] 和GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba(cg: 24%， chg: 6.7%， chh: 1.7%) [GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]．在葡萄浆果中观察到类似的模式;然而，CHG和CHH的甲基化率葡萄浆果（分别为30.35和27.53％）高于其他物种（如稻米）GydF4y2Ba拟南芥，GydF4y2Ba正如刚才提到的。此外，番茄果实（13.52-14.20％）的CHH甲基化高于叶子（8.63％）[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]，表明CHH甲基化在果实中具有重要作用。在葡萄果实中，基因体的甲基化水平高于其两侧的区域(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac），而在柑橘类水果中发现了相反的结果[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]．此外，值得注意的是，在橙色果实成熟期间发生DNA甲基化的全球增加，而全球去甲基化伴随着番茄果实成熟[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]．因此，不同物种甚至同一物种不同组织中CG、CHG和CHH环境的甲基化模式及其生物学意义存在差异，CHH甲基化可能在果实中起重要作用。GydF4y2Ba

胞嘧啶甲基化由DNA甲基转移酶（MET1，CMT和DRM），去甲基酶（DME，ROS1，DML）和染色质重塑因子DDM1进行调节[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba]．在植物中，甲基转移酶满足主要负责CG位点处的DNA甲基化[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba[但MET1也影响CHH甲基化[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]．在这项研究中，两个重要下调了两个GydF4y2Ba遇见GydF4y2Ba基因(VIT_212s0035g01770和VIT_212s0035g01755)可能有助于褪黑素处理浆果中观察到的DNA甲基化减少(表S3)。甲基化dna是在SadMET催化下使用s -腺苷甲硫氨酸作为甲基的供体产生的[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]．相当大的下调GydF4y2Ba悲伤GydF4y2Ba（VIT_214S0006G02170也可能降低DNA甲基化水平（表S.GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.显色乙基酶CMT主要维持CHH和CHG位点的DNA甲基化[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]．褪黑激素处理对CHH甲基化产生大得多，而不是CG和CHG甲基化;所以，GydF4y2BaCMT.GydF4y2BaS被认为会被褪黑素下调。然而，只有两种上调GydF4y2BaCMT2.GydF4y2Ba在褪黑素处理的浆果中检测到非常低的FPKM值(表sGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba），表明它们可能不是负责褪黑素诱导的CHH甲基化降低的关键酶。另一方面，表明DNA去甲基酶如DML2，以调节番茄和柑橘成熟期间的DNA甲基化[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．差异表达的DNA去甲基酶在褪黑素处理的浆果中没有检测到。综上所述，目前的结果表明，褪黑素诱导的DNA甲基化下降可能与GydF4y2Ba遇见GydF4y2Ba和GydF4y2BaS-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶GydF4y2Ba需要探索基因和其他潜在机制。GydF4y2Ba

我们的研究表明，褪黑激素处理广泛地降低了基因组DNA甲基化水平和改性基因表达。DNA甲基化和基因表达之间的相关性非常复杂，受各种因素的影响，包括组织类型和基因组区域[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]．只有DMR的子集与附近基因的表达相关联[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]．基因体甲基化在改变基因表达中的作用较小的表征较小[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]．有限的研究表明，通过抑制RNA剪接，基因体甲基化可能在产生新的功能基因转录物中的作用[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]．基因体甲基化的减少（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab)和RNA剪接增加(表SGydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)表明褪黑素通过降低基因体的甲基化水平来增加RNA的剪接。相反，基因启动子区域的甲基化会阻止RNA聚合酶和转录因子结合启动子，从而抑制DNA转录[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，降低DNA甲基化有助于调节低甲基化和高甲基化突变体中病原体诱导的基因表达[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]．本研究对144个启动子甲基化水平与基因表达呈负相关的基因进行了功能注释(表SGydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）表明褪黑素可以通过改变促进剂甲基化来调节基因表达，从而影响葡萄浆果中的抗病性和黄酮类生物合成。这种推断也受到褪黑素和5-AZA对抗病性，总黄酮含量和启动子甲基化和基因表达的变化的影响（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.此外，促进GydF4y2BaEDS1.GydF4y2Ba用来验证褪黑素通过降低启动子的甲基化水平来增加其转录驱动能力(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.总的来说，结果表明，褪黑激素至少部分地通过降低所涉及的基因促进剂的甲基化而增加抗病性和黄酮类生物合成。GydF4y2Ba

在DMP相关的基因和DEG中显示由褪黑激素引起的变化，两个GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba沙GydF4y2BaSTSGydF4y2Ba启动子甲基化和基因表达相互关联(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba,表GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.PAL是苯丙烷丙醇途径中的第一键酶，其中它催化肉桂的生物合成，并为其他酚类化合物提供初始前体[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]．褪黑激素可能通过增加来广泛影响酚类代谢GydF4y2Ba朋友GydF4y2Ba表达式。STS负责白藜芦醇的生物合成[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]和上调的GydF4y2BaSTSGydF4y2BaS表明褪黑激素在葡萄浆果中促进白藜芦醇生物合成中的可能作用。另一方面，褪黑激素可能会根据鉴定的互连基因通过多种途径影响抗病性（表S.GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.例如，EDS1通过促进SA生物合成来增强先天免疫系统的稳健性[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]．通过启用CA来对细菌病原体的完全防御响应需要CML41GydF4y2Ba^2+GydF4y2Ba信令特异性，免疫反应的关键组分[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]．凝集素受体激酶与涉及丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）途径的免疫信号传导的激活有关[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

结果表明，褪黑素导致葡萄浆体的DNA甲基化的全局降低，并且降低主要发生在CHH位点，然后是CHG和CG位点。同时，褪黑激素在葡萄浆果中广泛修饰的基因表达。褪黑激素通过减少促进剂甲基化至少部分地增加基因表达，从而促进抗病性和黄酮化生物合成。GydF4y2Ba

植物材料和实验治疗GydF4y2Ba

葡萄果实是从生长在中国山东省泰安市一个实验葡萄园的“梅洛”和“香马斯喀特”葡萄中采集的。梅洛浆果被用来确定褪黑激素对DNA甲基组和RNA转录组的影响。花后80天的每一簇葡萄在50 μM褪黑素+ 0.05% (v/v) Triton X-100溶液中浸泡5 s。对照浆果用0.05% (v/v) Triton X-100处理。分离的‘闪亮麝香’浆果被用来评估褪黑素和甲基化抑制剂(5’-Aza)对浆果抗病能力和类黄酮积累的影响。对照组和褪黑激素治疗与上面描述的相同。对于5’-Aza处理，分离的葡萄簇在20 μM 5-Aza溶液中浸泡5 s，溶液中添加0.05% (v/v) Triton X-100。处理后的浆果放置在环境控制室(20±1℃，80% RH，黑暗)中21天。“梅洛”葡萄愈伤组织用于启动子分析。愈伤组织继代培养于MS培养基上，添加2.2 mg/L噻嗪隆、10 mg/L苦氯仑和0.59 g/L 2-(n -吗啉)乙磺酸，25℃暗培养。 The berries and calluses were collected, rinsed, frozen in liquid nitrogen, and stored at − 70 °C for the determination of DNA methylation, gene expression and other parameters.

TSS、可滴定酸、相对花青素含量、总黄酮含量及平均腐烂率的测定GydF4y2Ba

新鲜的浆果浆均匀化并过滤。滤液用于测定TSS和滴定酸。用PAL-1数字显示糖表（Atago，Tokyo，Japan）测定TSS含量。通过用0.1M NaOH滴定至pH8.3，通过滴定滴定滴定滴定酸。结果表达为每G FW的Mg酒石酸。提取三孔蛋白并定量，并按先前研究报告的计算相对花青素含量[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．使用Rutin作为标准分光光度测量的总类黄酮含量，如Dewanto等人所述。[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba]．通过将浆果的总数除以浆果的数量来计算浆果衰减率。根据以下标准目视评估腐烂的浆果：具有轻微的霉菌和中度萎缩和棕色斑点。用三种生物学重复进行测量。每个复制由10个簇（约600个浆果）组成。GydF4y2Ba

褪黑素含量测定GydF4y2Ba

用C提取褪黑激素GydF4y2Ba_18GydF4y2Ba固相提取盒（Proelut™; Dikma，中国）根据我们以前的研究[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．使用a beh分离十个微升样品GydF4y2Ba_18GydF4y2Ba色谱柱(Waters，内径2.1 mm ×长度50 mm，粒径1.7 μm)，采用Acquity UHPLC系统(Waters, Milford, MA, USA)。样品采用QTof-Micro质谱仪(Waters, Milford, MA, USA)分析。UHPLC-MS分析的参数和条件根据我们之前的研究设定[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

亚硫酸氢盐测序（BS-SEQ）文库构建，测序和分析差异甲基化胞嘧啶GydF4y2Ba

基因组DNA从对照和褪黑素处理的“梅洛”葡萄浆果中提取。提取的dna经超声裂解至200-300 bp。经末端修复后，3个́端腺苷化，连接接头，纯化的连接产物275-350 bp，使用EZ DNA甲基化金试剂盒(zyo Research, USA)处理。所得dna在Illumina HiSeq Xten平台(Illumina, Inc.， San Diego, CA, USA)上进行配对测序。甲基组测序和分析由OE生物技术有限公司(中国上海)进行。通过对原始数据进行过滤，获得了大于75 bp的Clean reads。使用Bismark软件，将清洁序列的前链和基因组中的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，将反向链中的鸟嘌呤转化为硅中的腺苷。然后，将干净的reads与葡萄的参考基因组(GydF4y2Bahttp://genomes.cribi.unipd.it/DATA/GENOME_12X/GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

使用Methykit软件对甲基化胞嘧啶位点的检测和DMRS分析进行进行。只使用至少5所读取的胞嘧啶位点。通过甲基化和未甲基化胞嘧啶的二项分分布证实了真正的甲基化胞嘧啶位点和假发现率（FDR）≤0.05。滑动窗口方法用于筛选DMRS。将甲基化水平（％）集成在每个1000-BP平铺窗口中，每个窗口的集成数据用于DMR分析。使用逻辑回归模式分析DMRS，并根据甲基化水平的变化（折叠变化≥4或≤0.25）和FDR≤0.05的变化鉴定。另外，转录起始位点上游的区域2000bp作为分析差异甲基化启动子（DMP）的启动子区域。对于DMP分析，将滑动窗设定为2000bp，其他分析方法与DMR分析相同。对对照和褪黑激素治疗进行了三种生物重复。GydF4y2Ba

RNA文库构建、测序及DEG分析GydF4y2Ba

使用TruSeq strand mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, USA)按照制造商说明书构建RNA文库。使用Illumina HiSeq Xten平台(Illumina, Inc.， San Diego, CA, USA)对RNA文库进行测序，生成150 bp的对端序列。干净的reads被绘制到葡萄基因组(GydF4y2Bahttp://genomes.cribi.unipd.it/DATA/GENOME_12X/GydF4y2Ba）使用Hisat2。根据FPKM值量化Unigene表达水平，其使用袖扣计算。使用绝对日志筛选两个样本之间的次数GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba(fold change)≥1,FDR≤0.05为阈值。三种生物重复产生对照和褪黑素处理的浆果。GydF4y2Ba

亚硫酸氢盐- pcr (BS-PCR)和定量pcr (qRT-PCR)GydF4y2Ba

进行三种基因的BS-PCR分析以验证BS测序的质量。使用EZ DNA甲基化金试剂盒（美国Zymo Research）用二硫酸盐处理从对照和褪黑激素处理的浆果中萃取的DNA。使用与甲基底漆Express V2.0设计的特异性引物扩增以上三种基因的启动子区域（GydF4y2Bahttp://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer2.GydF4y2Ba；表的年代GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.将BS-PCR产物克隆到PMD19-T（Takara，大连，中国）和30个阳性克隆中。测序结果用于使用在线软件BIQ分析仪计算甲基化水平（GydF4y2Bahttp://biq-analyzer.bioinf.mpi-inf.mpg.de/GydF4y2Ba）.qRT-PCR在Bio-Rad iQ5 (Hercules, CA, United States)仪器上使用SYBR Green Master-Mix (SYBR Premix EX Taq TM，中国大连)进行，引物列于表SGydF4y2Ba7.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

瞬态转换GydF4y2BaEDS1.GydF4y2Ba启动子和GydF4y2BaMET1.GydF4y2Ba进入葡萄愈伤组织GydF4y2Ba

的启动子序列GydF4y2BaEDS1.GydF4y2Ba，克隆了800bp上游ATG（参见表S中的特定引物GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）在Pri101-Gus（Takara，大连，中国）的35s最小启动子上游融合，以产生pGydF4y2Ba_edsGydF4y2Ba:: 35 s miniGUS质粒。的子GydF4y2BaMET1.GydF4y2Ba(具体引物见表SGydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)，与pRI101的35S序列下游融合，生成35S::MET1质粒。将上述两个质粒引入GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba应变GV3101。的GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba-介导的葡萄愈伤组织瞬时转化是根据前人的研究[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．葡萄愈伤组织浸没在葡萄皮中GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba悬浮液并轻轻摇动20分钟。在无菌过滤纸上擦干干燥后，将愈伤团转移到含有100μM乙酰苯胺酮的固体MS培养基中。在28°C的黑暗中批量生入3天后，收集愈伤组织并进行GUS染色和活性测定。根据先前报告的方法进行了GUS组织化学染色和活性测定，如Jefferson等人所述的方法。[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]．GUS活性以每分钟Mg蛋白质表示为4-甲基纤维素的Nmol。GydF4y2Ba

接种单个分离的浆果GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

将拆卸的'梅洛'浆果浸泡在50μm褪黑激素或20μm5'-aza溶液中加上0.05％（v / v）Triton X-100。然后用剃刀刀片轻轻伤害浆果以破坏浆果的表面。通过喷洒悬浮液接种受伤的浆果GydF4y2Bab .灰质GydF4y2Ba（1×10GydF4y2Ba^4.GydF4y2BaConidia / ml）。接种后，将浆果置于环境控制室（20±1°C，90％RH，黑暗）中。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

使用SPSS（V19.0）软件进行统计分析。采用单向分析邓肯的多个范围试验。GydF4y2Ba

在BioSample accessions prjna603630和prjna603632中提交全Bs-seq和RNA-SEQ数据，分别在BioSample Resadions Prjna603630和Prjna603632下提交NCBI的序列读取档案（SRA）（GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

轻拍：GydF4y2Ba

盛开后的几天GydF4y2Ba

DAT:GydF4y2Ba

天治疗后GydF4y2Ba

度:GydF4y2Ba

差异表达基因GydF4y2Ba

DMP：GydF4y2Ba

不同甲基化剂GydF4y2Ba

DMR：GydF4y2Ba

差异甲基化区域GydF4y2Ba

EDS1：GydF4y2Ba

增强疾病易感性1GydF4y2Ba

舰队指挥官:GydF4y2Ba

折叠变化GydF4y2Ba

5-AZA：GydF4y2Ba

5-氮杂扎胺GydF4y2Ba

去：GydF4y2Ba

基因本体论GydF4y2Ba

MC：GydF4y2Ba

甲基化胞嘧啶GydF4y2Ba

帽子：GydF4y2Ba

治疗后的小时数GydF4y2Ba

MET1：GydF4y2Ba

DNA（胞嘧啶-5） - 甲基转移酶1GydF4y2Ba

悲伤：GydF4y2Ba

S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶GydF4y2Ba

TSS:GydF4y2Ba

总可溶性固体GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

本研究由国家重点研发计划(2018YFD1000200)、山东省重点研发计划(2019GNC106149)、国家自然科学基金(31872068)和山东省“双一流”项目资助(SYL2017YSTD10)资助。在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写中，没有任何资助机构有任何作用。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，果蔬优质高效生产协同创新中心，山东泰安271018GydF4y2Ba

   石威高，万云马，新宁莉，萧县曹＆玉溪瑶GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

YY和SG构思和设计了研究;SG，WM和XL进行实验;SG和XC分析了数据;而且YY写了手稿。所有作者均阅读并批准了手稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba玉溪瑶GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

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