之间的协调gydF4y2Ba生长调节因子1gydF4y2Ba和gydF4y2BaGRF相互作用因子1gydF4y2Ba在调节水稻中的叶片生长方面发挥关键作用gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

生长调节因子(growth - regulated factors, GRFs)和GRF相互作用因子(GRF - interactions factors, GIF)之间的相互作用已经得到了很好的证明，但目前尚不清楚GRF和GIF的不同组合是否在复合体的下游通路中发挥独特的作用。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

这里我们展示了gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba协同调节水稻中的叶片生长。的表达gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba在各组织中均有明显升高gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba主要出现在含有茎尖分生组织(SAM)的茎尖和含有叶原基的幼叶中。osmir396抗性版本的过表达gydF4y2BamOsGRF1gydF4y2Ba导致由于细胞增殖增加而导致的叶片倒闭gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba显示相对的表型。过度表达gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba没有表现出新的表型，而敲低线显示出血液润滑脂缺陷，包括缩小的叶子。交叉的线条gydF4y2BamOsGRF1gydF4y2Ba超表达和gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba击倒仍然显示出收缩的叶子，表明gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba叶片生长是由gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba．的表达gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba赤霉素(GAs)可上调其表达量，不同胁迫可下调其表达量，而gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba不能。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的结果表明gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba是在各种组织中过度表达并在生长的各个方面发挥作用的同时gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba可能通过滴定专门参与叶子的生长gydF4y2BaOsGIF1。gydF4y2Ba影响叶片增长的内部和外部条件都可能通过调节表达方式gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

转录因子(TFs)和它们的共激活因子之间的相互作用通常在调节下游基因表达，从而适当地调节个体生长中是必不可少的。尽管在体内存在广泛的基因相互作用，由于缺乏可靠的方法，只有有限的数量被确定。在植物中，生长调节因子(GRF)和GRF相互作用因子(GIF)相互作用是众所周知的，这种复杂的组合已被证明参与了植物发育和生长的许多方面[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

OsGRF1gydF4y2Ba是含有吉布林酸（Ga）在水稻中诱导的第一构件[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］.根据OsGRF1的氨基酸序列特征，在水稻中发现了一个12个成员的家族[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］.该植物特异性家庭由两个保守的域，QLQ（GLN，Leu，GLN）和WRC（TRP，ARG，Cys）定义，在GRF蛋白的N末端区域中。QLQ结构域对蛋白质 - 蛋白质相互作用至关重要[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba]和由C组成的WRC域gydF4y2Ba_3.gydF4y2BaH基序被认为是通过其核定位信号(NLS)与DNA结合[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］.最初人们认为grf的作用是调节叶和茎的生长[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］.此后，越来越多的研究报告了GRF的其他功能，例如种子和根部发育，压力反应，流动和植物长寿[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba］.作为一家高度保守的家庭，GRF已被发现在包括gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba，gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2Ba，gydF4y2Ba大豆gydF4y2Ba，gydF4y2BaSolanum Tuberosum.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba,莫斯gydF4y2BaPhyscomitrella金属盘gydF4y2Ba［gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］.大多数的成员gydF4y2Ba平gydF4y2Ba是由miR396负调控的，miR396在转录水平切割它们的目标[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］.在大米中，12个成员中的11个gydF4y2BaOSGRFS.gydF4y2BaOsmiR396的目标，除了gydF4y2BaOsGRF11gydF4y2Ba［gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

首先确定了mir396gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba通过计算和实验手段[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］.像GRFS一样，MIR396家族也是一个高度保守的植物MicroRNA家族，在所有土地植物中发现[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］.MiR396已被证明参与植物生长发育的各个方面[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］.作为调节分子，MIR396的角色取决于其目标的功能以及它如何调节其目标的方式。gydF4y2Ba

相比之下,gydF4y2BaGRF.gydF4y2Ba家族通常由8-20个数字组成，gydF4y2BaGIFgydF4y2Ba家族较小，在不同的植物中只有少数成员，通常少于5个拷贝[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］.但是，这种现象gydF4y2BaGIFgydF4y2Ba基因存在于大多数真核物种，包括胚胎，绿藻和美卓岛，展示这个家庭更加保守gydF4y2BaGRF.gydF4y2Ba家庭(gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba］.GIF的氨基酸序列具有SNH (SYT n端同源)和QG两个结构域，富含谷氨酰胺(Q)和甘氨酸(G)。结合和Y2H分析表明GRF QLQ结构域和GIF SNH结构域介导了两个家族的相互作用[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］.在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，不同的AtgrF和ATGIFS成员之间的相互作用已经很好地确定了[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］.到目前为止，仍然尚不清楚GRF和GIF的不同组合在复杂的下游发挥着独特的角色。有趣的是，由于缺乏几乎缺乏几乎整个C末端结构域而没有转移活性的ZMGRF10的过表达，通过竞争组合来微调GRF-GIF复合物的稳态[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］.此外，在玉米叶片的不同区域也观察到GRFs和gif的不同组合[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］.这些结果表明，GRF和GIF的不同成员之间的组合被广泛存在并以竞争方式存在。gydF4y2Ba

在这里，我们探讨了精确的滴定关系gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba．通过分析其表达和转基因素的表型，我们提出了它们之间的协调关系。gydF4y2Ba

不同的表达模式gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba

虽然不同GRF和GIF之间的相互作用已经得到了很好的测试（[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba];Lee等人，2014年[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba];），不同组合的精确功能仍然不清楚。有12名成员gydF4y2BaOSGRF.gydF4y2Ba和2名成员gydF4y2BaOsGIFgydF4y2Ba在水稻(gydF4y2Ba栽培稻ssp。粳稻,gydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba])。早期的研究表明gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba是一种GA诱导基因，可以影响拟南芥的茎伸长[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］.的功能gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba据报道，它参与调控叶、茎、粒等多个器官的生长[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba］.研究基因表达模式对于研究其功能是必要的，因为基因表达模式通常与其作用相一致。在这里,我们选择gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba作为目标，以充分调查其表达方式。我们从成年植物和不同的叶片，茎，叶片等叶片，小组织中选择了鲜花，从4周龄幼苗中作为用于分析基因表达的物体。定量逆转录-PCR（QRT-PCR）表明表达水平gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba在包括较小的叶片，芽和根的年轻组织中相对较高，特别是在拍摄顶端单位（SAM）和叶原始（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).相比之下，gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba在几乎所有的测试组织中似乎具有相似的水平(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一种）。gydF4y2Ba

QRT-PCR可能显示表达趋势gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba在不同的组织中，但不能反映表达的强度差异。进一步比较他们的表达水平，特别是对于之间的强度gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba，我们测量了Northern印迹的两个基因的表达。我们精心使用两种含有相同的放射性标记α-含量的探针gydF4y2Ba^32.gydF4y2Ba用PCR方法将P-dCTP基因插入探针，分别进行杂交。无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab显示，RNA丰富gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba比?高得多gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba在所有被测组织中，甚至在幼叶和嫩枝处也有表达水平gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba也相对较高。总的来说，Northern印迹和QRT-PCR检测的表达水平彼此一致（图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA和B）。这些结果表明表达了gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba是具有更高水平的本构型方式，然而，表达了gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba显示具有相对较低水平的组织特异性偏好。为了进一步研究蛋白质水平对蛋白质水平的两个基因，从2周龄幼苗中提取总蛋白质，并分别由抗OSGIF1和抗OSGRF1免疫。OSGIF1的分子量为约25kDa，而OSGRF1的ISGRF1是约43.5kDa。如图1所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac, OsGIF1的印迹强度远远强于OsGRF1，进一步表明OsGIF1的蛋白丰度高于OsGRF1。gydF4y2Ba

的表达gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba可受植物激素和胁迫调节，而gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba不能gydF4y2Ba

这是众所周知的gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和大多数其他gydF4y2BaOSGRFS.gydF4y2Ba很诱导[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］.作为一种碱性植物激素，赤霉素（气体）通常在不同途径的枢轴枢纽中。通常，内源性赤霉素的浓度可能受到其他因素的影响，例如生物和非生物应激[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］.此外，我们不知道是否或如何gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba对这些因素做出反应。我们选择2周龄的幼苗，在指定的时间内分别接受GA、盐、干旱、紫外线、病原体和ABA的不同处理。然后提取这些幼苗的总RNA，分别用qRT-PCR检测这两个基因的表达。不出所料，表达了gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba随着GAgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba治疗，而那个gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba在相同时期不受影响（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。相比之下，表达式gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba在ABA处理和各种胁迫下逐渐降低(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba与GA处理类似，表示gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba在其他处理中也不受影响(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.有趣的是，变化gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba外源ABA处理下的表达显著高于其他胁迫gydF4y2BaGIF1.gydF4y2Ba在ABA治疗下也略微下降（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB到F），表明ABA是相关的荷尔蒙之一，可能对基因的表达比其他应力快速影响。这些结果表明表达了gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba可以受到各种因素的监管，但是gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba不能。gydF4y2Ba

的mir396抗性版本过表达gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba结果是叶片展开gydF4y2Ba

OsGRF1gydF4y2Ba已被确定为植物中miR396的目标[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］.过表达微小RNA抗性靶标的功能突变体已被用于阐明给定微小RORNA的角色（AXTELL和[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba])。gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba在茎尖和幼叶中均有高表达。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，表明它可能在调控叶和芽的生长中起作用。为了避免被OsmiR396攻击，我们有了mir396抗性版本的gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba通过变异五个碱基gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba在MiR396标志区域中的mRNA，不根据密码子的退化改变氨基酸序列（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).然后引入mir396抗性版本的gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba(命名为gydF4y2BamOsGRF1gydF4y2Ba）和野生型gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba分别进入米饭，两者都是由本地启动子驱动的gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba．转基因植物繁殖并选择纯合线gydF4y2Ba潮霉素gydF4y2Ba在T.gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba的一代。Northern blot和qRT-PCR结果显示，在未转化植株的4周龄幼苗中，miR396的RNA丰度基本相同，gydF4y2BaOsGRF1OEgydF4y2Ba和gydF4y2BaMOSGRF1OE.gydF4y2Ba，但是gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba信使rna水平gydF4y2BaMOSGRF1OE.gydF4y2Ba线显著高于其他两种线(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).三种遗传背景的总体生长率相近，但观察到叶片的过度生长gydF4y2BaMOSGRF1OE.gydF4y2Ba行(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.野生型和野生型幼苗的第一片叶子gydF4y2BaOsGRF1OEgydF4y2Ba是一个不完整的叶子，形状喜欢针，但是gydF4y2BaMOSGRF1OE.gydF4y2Ba线条有一个舌状的形状与叶柄(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad).其他叶子的大小gydF4y2BaMOSGRF1OE.gydF4y2Ba品系也比非转化植株大gydF4y2BaOsGRF1OEgydF4y2Ba在3周龄幼苗中（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).除此之外，在三种背景下没有其他明显的特征差异。这些结果表明gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba有促进叶片生长的作用。有趣的是gydF4y2BaMOSGRF1OE.gydF4y2Ba即使mRNA的mRNA一样，株株的茎长也没有明显的差异gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba在茎中也高度积累(Fig。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.我们推测，在拍摄提示中，所有12名成员都表达的拍摄技巧中只有一个成员的过度表达gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]可能不足以产生明显的茎伸长率。gydF4y2Ba

击倒gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba通过RNAi显示出缩小叶子的表型gydF4y2Ba

进一步研究的作用gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba在水稻的发育和生长中，我们推倒了gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba通过RNAi (RNA干扰)技术。我们选择了一个特定序列对应于的3 '区域gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba以构建RNAi载体为对象，将其导入水稻中gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba介断的转化gydF4y2Ba．gydF4y2Ba如图1所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一、表达式gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba通过QRT-PCR测量的QRT-PCR在显着较低gydF4y2BaOsGRF1RNAigydF4y2Ba线条。最突出的敲低表型gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba是转基因系表现出较小的叶子（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab）。三个遗传背景的叶片尺寸之间的差异（NT，gydF4y2BaMOSGRF1OE.gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsGRF1RNAigydF4y2Ba)在靠近底部的位置更显著(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab,表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.为了探讨叶片生长差异是否是由细胞增殖或细胞伸长率引起的，悬浮培养的细胞源于叶子gydF4y2Bacalli.gydF4y2Ba三种基因背景中的gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba。植物的悬浮系统通常由许多块组成，其中几十个细胞聚集在一起，在悬浮系统中很少能观察到离解的细胞。培养6 d后，悬浮培养细胞的生物量增加gydF4y2BaOsGRF1RNAigydF4y2Ba系数显著低于非转化植株，而系数显著低于非转化植株gydF4y2BaMOSGRF1OE.gydF4y2Ba线路显着更高（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).此外，三种遗传背景下分离的细胞大小没有显著差异(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba这些结果表明，3个遗传系之间叶片大小的较大差异可能是由细胞转移活动引起的，而不是细胞伸长引起的。一些细胞周期相关的基因gydF4y2BaCyclin Oryza Sativa1.gydF4y2Ba（gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba），gydF4y2BaCyclin Oryza Sativa2.gydF4y2Ba（gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba）被认为是遗传诱导的[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba尽管还不清楚这些细胞周期相关的基因是否与gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba．我们测量了表达式gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba在三个背景的3周龄幼苗的叶子中gydF4y2BaOsGRF1。gydF4y2Ba如图1所示。gydF4y2Ba4gydF4y2BaE的表达式gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba是在行的上调gydF4y2BaMOSGRF1OE.gydF4y2Ba并且在直线上下调gydF4y2BaOsGRF1RNAigydF4y2Ba．这些结果充分说明细胞分裂的活性可能受到影响gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba在水稻叶。gydF4y2Ba

击倒gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba表现出含有缩小叶片的含磷生长缺陷，而过度表达显示出没有变化gydF4y2Ba

调查职能gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba在水稻中，我们用过表达或敲低（按特定序列RNAi）制成转基因素gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba．然后gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba采用qRT-PCR检测三种背景(NT、gydF4y2BaOSGIF1OE.gydF4y2Ba，gydF4y2BaOSGIF1RNAI.gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).意料之中的gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba显著高于gydF4y2BaOSGIF1OE.gydF4y2Ba线，而低得多gydF4y2BaOSGIF1RNAI.gydF4y2Ba线条（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).对整个生育期的生长性状进行仔细研究。植物overexpressinggydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba在它们的生命周期中始终没有显示出任何新的表型(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).茎长、分蘖数、叶大小、千粒重与未转化植株完全相同(图5)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).然而，击倒线gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba在生命周期中表现出茎短、种子枯萎、根细、数量减少、叶缩等多种缺陷(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac e;表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.我们之前已经证明了gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba可能受到gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba在叶子(图。gydF4y2Ba4gydF4y2BaE)，但我们不知道这种影响是否需要合作伙伴gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba．为确定不确定性，用gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba也通过QRT-PCR测量了三个遗传背景的叶片gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba．如图1所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaG，表达水平gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba显著降低了gydF4y2BaOSGIF1RNAI.gydF4y2Ba线路虽然显然没有改变gydF4y2BaOSGIF1OE.gydF4y2Ba线条（图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaG）。这些结果表明，在敲击线的叶片中抑制了细胞分裂的活性。出于表达的原因gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba是不是在线条上有过表达的变化gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba，我们推测的表达gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba受到OSGIF1-OSGRF1 DUO的控制，其中表达了gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba在非转化植株中已经处于过量状态(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(b和c).这一假设得到了进一步的支持，观察到叶子的大小仍然表现为收缩在交叉线gydF4y2BaMOSGRF1OE.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1RNAI.gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC)，因为只有过度表达gydF4y2BamOsGRF1gydF4y2Ba但缺少的伙伴gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba不足以促进叶片生长。这一观察结果也得到了分子证据的支持gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba杂交线的叶子仍然显着降低gydF4y2BaMOSGRF1OE.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1RNAI.gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaG)，在其中表达gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba是更高的，而gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba较低(图gydF4y2Ba5gydF4y2BaF）。gydF4y2Ba

GRF-GIF的双重作用已经被揭示参与了植物发育和生长的许多方面[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］.然而，与GIF家族成员很少相比，GRF家族要大得多。所以，不同的功能gydF4y2Ba平gydF4y2Ba涉及植物发育的许多方面可能反映了不同科成员的特定个体角色的组合。的单个成员的角色gydF4y2BagifgydF4y2Ba因为家族成员很少，所以似乎更多才多艺。gydF4y2BaGIFgydF4y2Ba在大多数真核生物中发现的家庭比gydF4y2BaGRF.gydF4y2Ba家庭(gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba]，表明它们可能具有与之相结合的其他角色gydF4y2Ba平gydF4y2Ba．的观察gydF4y2Ba拟南芥gif1/2/3gydF4y2Ba三重突变体在增长和发展中显示出严重的缺陷[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba进一步支持了这一假设。到目前为止，大多数研究都集中在揭示两个家族中个体成员的角色，而不是不同组合的不同角色[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］.目前，两个家庭的个别成员之间的确切关系在很大程度上仍然不清楚。gydF4y2Ba

在这里，我们详细说明了表达模式gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba并深入分析了转基因植物表型与异位表达的重叠gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba．从我们的结果中，我们可以得出如下要点。gydF4y2Ba

1. （1）gydF4y2Ba

   的表达gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba是一个具有更高层次的构成方式，而表达层次gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba总体上处于相对较低水平的组织特异性偏好(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.的表达水平较高的原因gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba有可能是两个方面造成的:低拷贝gydF4y2Baosgifs.gydF4y2Ba(在水稻中只有2个)，以及基于一些ChIP分析，gif也可能与GRFs之外的其他转录因子相互作用的假设[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba];gydF4y2Ba

2. （2）gydF4y2Ba

   具体的角色gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba可能只参与调控叶片生长而作用gydF4y2BaOsGIFgydF4y2Ba可能参与植物生长的各个方面。探讨的作用gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba倾吐以茎和叶的提示表达，我们使用其本土启动子而不是组成型启动子，因为我们不打算破坏其固有的表达方式。特定作用gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba为了避免miR396对叶片生长的调控作用(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC和D）。另外，叶片缩小的观察结果也出现在敲低的gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba通过RNAi，进一步暗示其在调节叶生长方面的作用（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).然而，基因敲低的表型gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba显示多种缺陷，包括缩小叶，表明植物生长中可能具有多种作用（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac到e)。为什么过度表达gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba没有新的表型，我们推测这将是由表达的事实引起的gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba在各种组织中已经过度过度（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab和c);gydF4y2Ba

3. （3）gydF4y2Ba

   的表达gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba可以受到各种压力和某种荷尔蒙的影响gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba不受影响。细胞周期相关基因的表达如gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2BacycOs2gydF4y2BaOsGIF1-OsGRF1 duo控制。甚至gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和细胞周期相关基因，如gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba细胞周期蛋白gydF4y2Ba被认为是由ga引起的[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，但目前尚不清楚在GA反应中OsGRF1与细胞周期相关基因是否存在联系。这里我们建议gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba是在下游gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba因为更高水平的gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba促进了表达gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba虽然较低水平gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba抑制(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae）。甚至gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba对GA没有反应(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA)，事实gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba可以与gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsGRF1RNAigydF4y2Ba还提出了剩余叶子的表型（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac），表明表达了gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba和gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba可能需要OsGIF1-OsGRF1 duo。gydF4y2Ba

总之，这里我们探讨了不同的角色组合之间的给定成员gydF4y2BaOSGRFS.gydF4y2Ba和gydF4y2Baosgifs.gydF4y2Ba，并发现它们在调节叶片生长方面的特定功能。未来的研究可能更多地展示了揭示不同组合的独特作用gydF4y2BaOSGRFS.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsGIFs。gydF4y2Ba

基于以上结果，我们在这里提出一个工作模型来解释如何gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba共同调节生长(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.我们建议表达gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba由Ga促进的同时被各种压力，ABA和MIR396抑制。之间的互动gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba通过促进细胞周期相关基因的表达来特异性促进叶片生长是必要的。然而,gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba在更高的水平中表达，也可以与其他因素一起调节增长的其他方面。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

水稻品种（gydF4y2Ba栽培稻ssp。粳稻gydF4y2Ba）被用作对照植物，并为所有转基因植物提供遗传背景。本研究中涉及的所有种子是从扬州大学植物功能基因组学的关键实验室拍摄，中国。Y.L.承担他研究中使用的植物材料的正式鉴定。该材料的优惠券标本尚未在公共植物征中存放。如Lu等人所述进行对照植物和转基因植物的正常生长条件。［gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

压力和激素治疗gydF4y2Ba

盐胁迫，UV光应力，病原体（gydF4y2Ba稻瘟病菌gydF4y2Ba)、干旱胁迫和脱落酸(ABA)处理，如前所述[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］.赤霉素(GA)处理是将2周龄幼苗置于含50 μM赤霉素的N6溶液中gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba和0.02％的吐温20.然后在基因分析的指定时间从上述幼苗中提取总RNA。gydF4y2Ba

观察细胞和悬浮培养细胞的产生gydF4y2Ba

为了创造悬浮细胞，水稻gydF4y2Bacalli.gydF4y2Ba从非转化植物的绝育叶片中提取，gydF4y2BaOsGRF1OEgydF4y2Ba， 和gydF4y2BaMOSGRF1OE.gydF4y2Ba系在N6培养基(固体)上生长。4周后，将不同株系的新鲜愈伤组织1g培养到500 mL AA培养基中[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba[给定间隔测量生物质。观察到悬浮液细胞并在显微镜下记录。gydF4y2Ba

定量rt - pcrgydF4y2Ba

用于定量RT-PCR分析gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba(基因ID: Os02g0776900),gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba（基因ID：OS03G52320），gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba(基因ID: Os04g0563700)gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba（基因ID：OS06G0726800），在0.5mg oligo（DT）15,0.75mM DNTPS，10mM DTT和100u上标II rnase H2逆转录酶（Invitrogen）.PCR的反应体积为20μL，RT反应1μL[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］.用于定量RT-PCR的引物被列为以下：OSGRF1，FW：5'-TGATCTTTCAAAAGGGACGACG-3'，RV：5'-TGGTGGTGATCGGGGGTCGTT-3';OSGIF1，FW：5'-gcagcagcagcaggcggcggc-3'，RV：5'-TGCCCTTGAGGTACTCCCGT-3';CYCOS1：FW：5'-GTGTTTCTAGGATGATGGTAGA-3'，RV：5'-GTTGTAACCTCCTGCTCCTGACT-3'，CYCOS2：FW：5'-CatgaAGGTTCCTCAAGGCT-3'，RV：5'-TGGTGCACTGAGCAGTGTAGA-3';进行30次PCR循环，并归一化样品的表达水平gydF4y2BaOsubiquitingydF4y2Ba基因(正向:5 ' -AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3 '，反向:5 ' -AACCAGTCCATGAACCCGG-3 ')。实验设3个生物重复，每个生物重复设3个技术重复。gydF4y2Ba

Northern-blot分析gydF4y2Ba

采用TRIzol试剂(Invitrogen)从不同组织中提取总RNA。5 ' - cagttcaagaaagctgtgggaa -3 ' DNA寡核苷酸作为miR396的探针，5 ' - attttctcgatttgtgcgtgtc -3 '作为U6的探针;两种探针均用γ-标记gydF4y2Ba^32.gydF4y2BaP-ATP在5'终端。对于mRNA凝胶印迹分析，特异性探针gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba和gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2BaPCR扩增与这两个基因cDNA 3’序列对应的基因组DNA，并用放射性gydF4y2Ba^32.gydF4y2BaP(α-gydF4y2Ba^32.gydF4y2BaP-dCTP)。这两种探测器被认定含有相同的放射性物质gydF4y2Ba^32.gydF4y2BaP由设计引物(OsGRF1, FW: 5 ' -TGATCTTTCAAAAGAGGACGACG-3 ';房车:5“-TGGTGGTGATCGGGAGGTCGTT-3”;OsGIF1,弗兰克-威廉姆斯:5“-GCAGCAGCAGCAGGCGGCGGC-3”;房车:5“-TGCCCTTGAGGTACTCCCCGT-3”)。按照前面的描述执行了该过程[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

表达载体的构建与转基因水稻线的产生gydF4y2Ba

野生型的gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba首先用RT-PCR方法克隆出FW: AAgydF4y2BaGGATCCgydF4y2Bacagagatgatgatgatgatgagcggtcg;RV：GCGAGCTCAGATTAATCATGCGGGAGGTGGGTG。然后是mir396抗性版本gydF4y2BaGRF1gydF4y2Ba（gydF4y2BamGFF1gydF4y2Ba)通过诱变引物(FW: 5 ' - AAGCACATGCACCGTGGCAAGAACCGATCTAGAAAACCGGTGGAGATGTCCTTGGCCAC-3 ';房车:5“-CAAGGACATCTCCACCGGTTTTCTAGATCGGTTCTTGCCACGGTGCATGTGCTTCTCGCAGTAC-3”)。在突变过程中，对第一轮PCR产物进行纯化，并作为第二次扩增的模板。结果产物经酶切后克隆到pUC18中，并通过测序验证阳性克隆。最后是突变型和野生型gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba被带入PCAMBIA1301的原始gydF4y2BaUbi1gydF4y2BaPromoter被Promoter of所取代gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba．完整的长度gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba采用RT-PCR方法克隆，引物为:FW: 5 ' -ATGCAGCAGCAACACCTGATGC-3 ';房车:5“-CTAGCTGCCTTCCTCCTCGGT-3”。然后在Ubi1启动子下将OsGIF1构建到pCAMBIA1301中进行过表达。对于OsGRF1和OsGIF1的RNAi (RNA干扰)，分别使用两个基因的特定区域(northern blot探针区域)沉默靶标，然后分别带入pCAMBIA1301，由一个内含子分开。所有构建的表达载体均导入水稻gydF4y2Bacalli.gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba（EHA105）介导的方法[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

Western Blot.gydF4y2Ba

对于OSGRF1和OSGIF1的Western印迹，通过SDS样品缓冲液提取来自非转化植物的2周龄幼苗的总蛋白质，并煮沸10分钟。然后通过SDS-PAGE分离所提取的蛋白质并用抗OSGRF1的抗体免疫，抗OSGIF1为1：1000稀释。gydF4y2Ba

为了制备OSGRF1和OSGIF1的抗体，表达了6×HIS-OSGIF1和6×HIS-OSGRF1构建到PET28载体中并用作抗原，以产生兔子中的单克隆抗体（从君惠生物技术，CO，CO）。在制备单克隆抗体的过程中，至少将兔子免疫4次，至少萃取抗体的纯度应保持大于90％。最后，酶联免疫吸附测定值（ELISA）的值应大于1：128000。gydF4y2Ba

本研究中生成并分析的数据集可从通讯作者处获得。本文中的序列数据可以从数据库(gydF4y2Bahttp://www.ricedata.cn/gene/gydF4y2Ba)下的基因ID /登录号:gydF4y2BaOsGRF1gydF4y2Ba(Os02g0776900),gydF4y2BaOSGIF1.gydF4y2Ba(Os03g52320),gydF4y2BacycOs1gydF4y2Ba(Os04g0563700)和gydF4y2BacycOs2gydF4y2Ba(Os06g0726800)。gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

GRFS：gydF4y2Ba

生长调节因子gydF4y2Ba

GIF：gydF4y2Ba

GRF-Interacting因素gydF4y2Ba

nls：gydF4y2Ba

核定位信号gydF4y2Ba

QRT-PCR：gydF4y2Ba

定量逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba

山姆:gydF4y2Ba

技条顶端分生组织gydF4y2Ba

RNAi:gydF4y2Ba

RNA干扰gydF4y2Ba

我们感谢李峰博士为她的表达载体传染媒介PCAMBIA1301（也是RNAi）的贡献。gydF4y2Ba

国家自然科学基金资助项目(No. 31271623)。关键词:岩石力学，数值模拟，数值模拟创始人没有参与本研究及相关数据的设计、分析、解读。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 2 .扬州大学江苏省作物遗传生理重点实验室/植物功能基因组学教育部重点实验室，江苏扬州225009gydF4y2Ba

   卢玉柱，高素云gydF4y2Ba

2. 中国农业和农业和农业部安全研究实验室，中国教育部，扬州大学，扬州，江苏225009gydF4y2Ba

   卢玉柱，高素云gydF4y2Ba

3. 2 .扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州225009gydF4y2Ba

   玉珠·鲁，云龙萌，嘉增，盈罗，镇峰与李英卞gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

YL完成了大部分的基因表达工作。YM、JZ和SG负责基因克隆和载体构建。ZF和LB完成了水稻转化的大部分工作。YL分析数据并撰写文章。作者审核并批准了最终的提交。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba陆的抗病毒gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

植物材料(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba以扬州大学的所有转基因株系为对照和背景。他在工作中对植物进行的实验研究符合机构、国家和国际准则。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

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再版和权限gydF4y2Ba