从高碱基蓝莓绿色切割中涉及不定根形成的关键基因的转录组分析和发现（Vaccinium corymbosumL.）

背景

扦插的繁殖通常用于各种植物物种，包括蓝莓，其显示可能阻碍不定根（AR）形成的特殊根特征。AR形成受到各种因素的影响，疾病被认为是起到核心作用;但是，众所周知的相关监管机制很少。在该研究中，通过RNA_Seq进行或不使用吲哚-丁酸（IBA）处理的绿色切屑的比较转录体分析，以鉴定与IBA诱导的AR形成相关的候选基因。

结果

在IBA处理下，外源生长素显著促进了植株的生根表型，尤其是生根率。蓝莓AR的形成是一个生长素诱导的过程，其中不定根原基萌生(rpi)发生在切后14天(DAC)，根原基萌生(rp)发生在21天(DAC)，成熟AR发生在28天(DAC)，最终在35天(DAC)从茎中生长出来。较高的IAA水平和较低的ABA和玉米素含量可能促进AR的形成和发展。时间序列转录组分析发现AR形成过程中有14970个差异表达基因(DEGs)，其中上调基因7467个，下调基因7503个。其中，进一步鉴定了约35个参与生长素诱导途径和AR形成的候选deg，包括10个生长素相关基因(东盟地区论坛和阿富汗二月)、13个转录因子(含有含域域的蛋白质（磅))， 6种生长素转运体(AUX22，LAX3 / 5.和PIN-like 6（Pil6s.））和6个生根相关的基因（根分生组织生长因子9（RGF9.），侧根原始1（LRP1S.）， 和相关蛋白质同源3（DRMH3）））。在AR形成期间，所有这些所识别的均被均在某些阶段高度上调，表明它们在蓝莓AR形成中的潜在作用。

结论

转录组分析结果表明候选基因或主要调节因素影响蓝莓中的不定根形成，并为来自蓝莓绿色切割的生长素诱导的AR形成的根本机制综合了解。

蓝莓(Vaccinium corymbosum(L.)是杜鹃花科(Ericaceae)的一员，是一种具有重要商业价值的小型水果作物，因为它们含有健康和风味丰富的生物活性化合物，蓝莓的种植面积在世界范围内逐年扩大，特别是在中国[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 1" title="1" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e820">1］．该植物可以通过多种方法繁殖，例如种子，嫁接，组织培养和切屑，主要用于扦插，因为它可以确保母植物的特性并增加植物均匀性[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="2" href="#ref-CR2" id="ref-link-section-d13040e823">2，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="3." href="#ref-CR3" id="ref-link-section-d13040e823_1">3.，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="4" href="#ref-CR4" id="ref-link-section-d13040e823_2">4，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 5" title="5" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e826">5］．不定根的形成被认为是蓝莓扦插繁殖成功的先决条件。然而，由于蓝莓根系结构特殊，主要由细根组成，蓝莓的栽培通常需要一定的环境条件，如土壤的水分、渗透性、pH值等，这些条件往往导致蓝莓不定根率较低[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 6" title="6" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e829">6，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 7" title="7" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e833">7］．到目前为止，蓝莓扦插繁殖的困难是限制其发展的主要因素[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 8" title="8" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e836">8］．因此，必须揭示控制蓝莓AR形成的环境或遗传机制。

AR形成是一种复杂的发育过程，反映了植物的可塑性，以适应压力条件，并从与性繁殖的同一个人中再生植物组织[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="9" href="#ref-CR9" id="ref-link-section-d13040e842">9，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="10" href="#ref-CR10" id="ref-link-section-d13040e842_1">10，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="11" href="#ref-CR11" id="ref-link-section-d13040e842_2">11，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 12" title="12" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e845">12］．ARS通常自发地生成或响应叶片，叶子或较旧根部非自行组织的某些刺激[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 13" title="13" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e848">13，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 14" title="14" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e851">14]，它可以基于其生理和代谢过程分为几个阶段：a）去消化剂;b）细胞分裂;和c）不定根原奖励，发展和产量[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 15" title="15" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e854">15］．植物激素，包括生长素、脱落酸、细胞分裂素和乙烯，已经被证明在增强AR形成中发挥重要作用，而生长素被认为是一个中心角色[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 16" title="16" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e858">16，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 17" title="17" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e861">17］．虽然吲哚-3-乙酸(IAA)主要是植物中的一种本地生长素，但合成生长素吲哚-丁酸(IBA)在促进不定根质量方面更有效，经常外源应用于促进难以生根的植物的扦插产生AR，包括蓝莓[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 6" title="6" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e864">6］．例如，使用IBA处理的蓝莓硬木或软木切屑显示出明显更好的生根能力，而不是对照的生根能力[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 7" title="7" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e867">7，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 18" title="18" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e870">18］．然而，在IBA治疗后切割中发生的调节机制有限，特别是在AR启动期间，尤其是蟾蜍素信号传导级联和生长素诱导的基因转录信息的调节机制，从而形成了IBA处理的切屑的生根提示。随着生物信息技术的快速发展，Illumina测序技术（RNA-SEQ）提供了一种新的网关，以鉴定植物复杂生物过程中涉及的基因表达模式，调节网络甚至SNP变体[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="19" href="#ref-CR19" id="ref-link-section-d13040e873">19，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="20." href="#ref-CR20" id="ref-link-section-d13040e873_1">20.，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="21" href="#ref-CR21" id="ref-link-section-d13040e873_2">21，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 22" title="22" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e877">22］．RNA-SEQ技术是一种高效，广泛使用和常规的分子生物学方法，用于获得转录组族信息，已成功应用于蓝莓以识别涉及农艺性状的候选基因，例如与抗氧化剂相关的推定基因[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 19" title="19" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e880">19，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 23" title="23" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e883">23，果实发育和成熟[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 24" title="24" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e886">24，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 25" title="25" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e889">25]和参与冷冻介导的开花途径的基因[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 26" title="26" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e892">26］．但是，没有从蓝莓的切屑形成序列转录信息。

我们提出了一种假设，即外源IBA通过扰乱内源激素的平衡和与植物激素信号转导的基因，特别是在养肝稳态中，主要受IBA应用的影响。因此，在本研究中，分析了根表型，包括生根百分比，平均根数和根部长度，以评估蓝莓绿色切割的不定根能力。观察到茎碱的解剖结构监测ARS的发育过程。确定内源激素水平的动态变化以分析激素对ar形成的影响。此外，通过RNA_Seq技术进行使用或不使用IBA处理的切屑的比较转录体分析，以识别参与IBA诱导的扦插中的ARS形成的候选基因，并进入控制不定的生根事件的机制或监管网络的更深层次的见解蓝莓扦插。结果提供了鉴定参与AR形成的特定基因和蛋白质的遗传资源以及改善蓝莓的木质植物繁殖。

表型分析

蓝莓绿色切割的生根表型在控制和IBA治疗之间显着变化（图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">1a - b)。外源施加IBA显著促进了扦插生根率和平均根数(图2)。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">1c - d)。平均根长在这两个处理之间没有显著差异(图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">1e），表明外源性生长素IBA可以增强不定根根部形成，而不会影响平均长度。

不定根形成的显微结构观察

为了清晰、明确地观察蓝莓绿插枝的AR发育过程，对其显微结构进行了观察。结果表明，在IBA处理下，愈伤组织在切割后7天(DAC)开始形成(图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2a)， 14 DAC产生不定根原基起始(rpi)(图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2b)，不定根原基(rp)在21 DAC发育(图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2c），RP然后开发到不定根（AR）（图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2d）在35dac中观察到从茎的过度观察（图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2e）。该过程表明，从非根身自行细胞作为一种植物素诱导的非根性截带细胞开始蓝莓AR形成。

AR形成过程中蓝莓绿色切割植物激素分析

分析了蓝莓AR形成过程中植物激素的变化。在IBA处理下，IAA水平在21 DAC显著增加(图2)。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">3.a-b)，这可能表明较高的IAA参与了不定根原基(rpi)的起始。绿插穗GA3含量在对照和IBA处理之间没有显著差异(图3)。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">3.c). IBA处理下的ABA和玉米素含量在整个试验过程中都保持在较低水平，对照处理ABA和玉米素含量有下降趋势，在21 DAC后与IBA处理的ABA和玉米素含量相近(图2)。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">3.d)，表明较低水平的ABA和玉米素可能促进AR的形成。

蓝莓茎的RNA-seq分析中的从头测序、组装和基因注释

插入后每7天取样一次，对10个样本(CK7、CK14、CK21、CK28、CK35、T7、T14、T21、T28、T35)进行总RNA提取和RNA测序分析。每个文库的rna_测序共生成4073 - 4623万对150 bp的原始reads (M)<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="table anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">1）.数据过滤后，21200万清洁读数剩余，其中每个图书馆的清洁读数范围为41.27至44.25米（表<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="table anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">1）.最后，672,606份转录物和308,719个unigenes分别组装在一起，平均长度为735.87bp（n50 = 1082）和617.30bp（n50 = 844）（表<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="table anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2）.Blastx以截止截止搜索E价值10⁻⁵NR数据库、GO数据库、KEGG数据库、eggNOG数据库和Swiss-Prot数据库注释的unigenes总数分别为107,111、53,859、6696、101,729和89,910(表1)<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="table anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">3.）.

基于NR注释，25.33％的注释序列显示出非常强烈的同源性（E值< 10^{- 60})， 21.80%的注释序列具有较强的同源性(10^{- 60} < E值< 10^{- 30})，另有82.87%的序列具有同源性(10^{- 30} < E值< 10⁻⁵)到可用的植物序列(附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">1：图。S1A）。相似性分布是可比的，26.41％的序列显示出高于80和73.5％的命中的相似性显示出0-80％的相似之处（附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">1：图。S1B）。关于物种，72.99％的独特基因显示出与其他物种的序列高的匹配，包括葡萄，Oryza sativa japonica集团和Coffea canephora(附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">1:图就是S1c)。

GO分析采用Blast2GO软件进行。在308719个unigenes中，263,143个被分类为“生物过程”、“细胞成分”和“分子功能”类别(补充文件)<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2:图S2)。这一分类提供了不同信号转导、分解代谢和合成代谢过程中蓝莓unigenes的百分比信息。在生物过程分类中，unigenes主要分为“代谢过程”、“细胞过程”和“单生物过程”，约占72.83%。在细胞组分类中，unigenes主要分布在“细胞”、“细胞部分”、“膜”、“膜部分”和“细胞器”中，约占83.72%。在分子功能类中，大量的unigenes分布在“催化活性”和“结合”两类，约占86.26% (Additional file)<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2:图S2)。

利用RSEM定量软件计算对照(CK)和IBA处理(T)间unigenes的FPKM值，并通过CK7与T7、CK14与T14、CK21与T21、CK28与T28、CK35与T35等10个文库的两两比较鉴定DEGs(补充文件)<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">3.：图。S3A）。确定总共14,970℃，其中超过7467，下调7503（附加档案<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">3.:图S3b)。在每个采样周期，CK7和T7文库之间检测到3252个deg，这些ungenes直接受到IBA处理的影响，可能与愈伤组织的形成有关(图2)。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2一个，附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">3.:图S3b)。在CK14 Vs.T.T14中，鉴定了3999次，其可能与RPI形成有关（图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2b,额外的文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">3.:图S3b)。在CK21和T21中，鉴定出1488个DEGs，它们有助于rp的形成(图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2c,额外的文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">3.:图S3b)。在CK28和T28中，鉴定出2648个DEGs，它们有助于AR的形成(图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2D，附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">3.:图S3b)。在CK35和T35中，检测到3583次，这可能导致Ar过度和发育（图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">2e,额外的文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">3.:图S3b)。然而，在Venn图中所示（附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">3.图S3c-d)，提示DEGs可能在AR的形成、生长和发育过程中发挥特殊作用。

富含养羊石信号通路的果酒

已被证明在促进AR形成方面发挥关键作用;因此，注释和进一步分析了蟾蜍素信号通路中的°。映射了总共29个无辛相关的次数（图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">4）.这些次数中，有十个unigenes属于疾病响应蛋白质，包括四个东盟地区论坛和六阿富汗二月．还鉴定出六种毒素转运蛋白基因，包括三种流入载体（AUX22，AUX-LIKE 3（LAX3.）， 和LAX5.)及三种外排载体(PIN-LIKE 6（Pil6s.）））。在AR开发期间，所有这些DEG都在一定程度上进行了上调（图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">4）.为了验证比较转录分析的结果，两个助长响应因子东盟地区论坛基因（即，ARF7和ARF9）和六个助长转运蛋白基因（即，AUX22，LAX3.，LAX5.和Pil6a-6c.)，通过qRT-PCR鉴定DEG表达谱。RNA_seq显示ARF7和ARF9在IBA治疗中，在28 DAC上显示了一个显著的转录峰值，而这两种情况东盟地区论坛在对照中显示出下降的趋势(图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">5一个，附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">4:图S4)。RNA_seq数据表明AUX22保持在对照中的较低表达，但在IBA治疗中显示出7dac-21dac的显着上调（图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">5b）。它的同源基因LAX3.和LAX5.在对照中显示出下降的趋势，在IBA处理中在14 DAC和28 DAC显著上调(附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">5:图S5)。这些结果表明，这些基因可能在生长素运输和生长素不对称分布中发挥重要作用，有助于在AR形成早期诱导不定根原基起始。为三种生长素流出载体Pil6a-6c.，在对照处理中，这三个基因在7 DAC - 21 DAC时表达低，在28 DAC时表达上调。然而，在申请IBA之后，PIL6a在14 DAC显著上调(图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">5c)和PIL6b和PIL6c显示出于7 DAC的显着增加，并在35 DAC达到峰值（附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">6：图。S6），暗示养蛋白增强了表达式Pil6s.因此促进了AR形成。QRT-PCR数据表示与抄本信息的相似性。

转录因子侧器官边界域/垂叶domain-containing蛋白(磅的下游靶基因调控AR的形成东盟地区论坛家庭。在目前的工作中，13个同源基因磅基于NR注释鉴定（图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">4)， RNA-seq数据揭示了这一切磅在某种程度上在不同阶段上调或下调，特别是在28 dac。这13个中的四个磅（IE。，LBD16,23,29和37）代表性地选择以通过QRT-PCR确认它们的表达谱，结果表明LBD16.和LBD37与RNA-seq数据显示出良好的重现性。qRT-PCR结果表明LBD23在IBA治疗中，14 DAC再次上调LBD29在IBA处理中，从21 DAC持续上调至35 DAC，而在对照中，14 DAC和35 DAC也上调(图2)。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">5D，附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">7：图。S7）。

DEGs参与根原基形成

基于NR注释，获得了六种与生根相关的DEG，包括四种同源基因侧根原始1（LRP1恰巧),一个假定的根分生组织生长因子9（RGF9.）和一个相关蛋白质同源3（DRMH3） （图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">4）.RNA_seq数据表明LRP1恰巧在28 DAC显著上调(图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">5e）和其同源基因LRP1-like，LRP-Type1，LRP样2在14 DAC之后，表现出持续的上调，并在IBA处理中在28 DAC达到峰值(附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">8：图。S8）。明显上调RGF9.在7 dac，14dac和28dac中观察到（图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">5f),DRMH3在IBA处理中，28dac显著上调(图2)。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">5g). qRT-PCR分析RGF9.表示与RNA_seq数据具有良好的一致性，表示DRMH3IBA处理与RNA_seq数据表现出良好的一致性，但在对照处理中持续以高水平表达(图2)。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">5G）。

推测的控制蓝莓AR形成的基因调控网络

根据已知的调控网络报告的根系形成拟南芥和其他植物物种，获得了控制蓝莓AR形成的调控途径。推测IBA可诱导生长素应答因子的表达ARF7/9鉴于养羊酸信号传导，而ARF7/9直接或间接地影响了下游的目标磅基因建立具有核迁移的AR创始者细胞。然后是生长素极性载体，包括内流载体AUX22或LAX3 / 5.和射流运营商Pil6s.，以促进生长素不对称分布的建立，包括AR原基的形成。最后，在扦插的作用下，AR原基转变为AR顶端分生组织并生长LRP1恰巧，RGF9.，DRHM3.和其他基因(图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">6）.

生长素在促进不定根的发生和生长中起着至关重要的作用[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 27" title="27" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1799">27，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 28" title="28" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1802">28];然而，关于生长素如何调节蓝莓扦插不定根线索的分子机制的详细资料有限。在前期的研究中，我们发现蓝莓阔叶插枝的不定生根能力不仅取决于品种，还取决于IBA的用量，而且品种与IBA的互作有利于产生更好的生根品质[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 7" title="7" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1805">7］．在本研究中，IBA处理显著提高了绿色插枝的不定根率。此外，IBA诱导后AR原基启动，rpi从茎表皮发育为AR并生长。这些发现与生长素是AR形成的有效诱导剂的观点一致。激素分析表明，IBA处理下扦插的IAA水平在21 DAC时达到峰值。这IAA积累可能导致IBA处理,可以加快基础运输IAA或一小部分吸收了IBA转化为IAA,最后功能在特定反应细胞,启动自动调节生长素开运河和最大化,从而开始基于“增大化现实”技术形成的过程(<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 29" title="29" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1808">29，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 30" title="30." href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1811">30.］．ABA通常在环境压力期间诱导，并且代表AR形成的抑制剂，ABA水平通常由IAA衰减，因此ar出现可以进行[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 31" title="31" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1815">31］．ABA对AR的调控作用是通过与IAA的动态平衡间接作用的，较高的IAA/ABA比例有利于AR的形成[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 32" title="32" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1818">32］．在目前的工作中，与对照相比，ABA维持在IBA治疗的较低水平，这与IAA治疗的茎有最低的ABA和最多数量的报告相似[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 33" title="33" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1821">33］．显示细胞素蛋白抑制Ar开始，但正面调节细胞分裂并刺激AR伸长率[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 34" title="34" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1824">34，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 35" title="35" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1827">35］．康乃馨的研究表明，具有较高的转蛋白水平的切屑总是表现出较差的偶然生根能力[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 15" title="15" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1830">15，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 16" title="16" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1834">16］．在本研究中，IBA处理将玉米素的含量保持在非常低的水平，这与之前IBA处理下扦插基部细胞分裂素含量降低的研究结果一致[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 36" title="36" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1837">36］．上述结果支持通过介导疾病和其他激素之间的稳态，IBA影响了AR的假设。

转录组分析是在许多生物过程中研究基因表达谱的有效工具，包括偶然生根[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 37" title="37" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1843">37］．利用这种方法，在其他几种植物中发现了对AR形成做出反应的deg [<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 36" title="36" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1846">36，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 38" title="38" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1849">38］．对于蓝莓来说，尽管已经研究了多十年的不定根事件，但尚未记录在AR形成期间的成绩单信息。在这项工作中，使用蓝莓切屑的比较转录组分析来鉴定潜在与AR形成相关的unigenes和途径。总共生成了超过额外的读数，并组装了总共672,606个unigenes。在对Kegg，Go和其他数据库进行注释后，进一步鉴定出涉及蓝莓AR途径的许多参数，表明RNA_Seq方法对于鉴定与特定生物过程相关的高度差异表达的未经成根是强大的。此外，这些DEGS的存在在蓝莓切屑中的全球IBA诱导的AR形成的全球视图中，这将有助于更加了解对该过程背后的分子机制，并可以提高蓝莓农业实践中的不定产效率。

在模型植物中拟南芥，植物素在AR形成中的作用被证明是直接通过变化的相关基因表达的变化来调节[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 39" title="39" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1858">39，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 40" title="40" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1861">40］．转录监管机构助线响应因子（东盟地区论坛s)被证实参与调节AR的形成，其中东盟地区论坛S通过在这些基因的启动子区中的植物蛋白响应元件带激活或压制早期敏感基因[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 41" title="41" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1874">41］．到目前为止,29东盟地区论坛已被孤立并从中识别拟南芥，从中ARF7和ARF19被认为是通过积极激活其下游基因的转录参与AR的形成横向器官BOUNDSARIS-DOMAIN（的小黑裙s）[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="42" href="#ref-CR42" id="ref-link-section-d13040e1896">42，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="43" href="#ref-CR43" id="ref-link-section-d13040e1896_1">43，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 44" title="44" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1899">44］．表达的ARF7和ARF19可以增强增强现实的出现，而arf7，ARF19和arf7 / arf19双突变体导致AR形成严重缺陷[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 42" title="42" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1918">42］．激活LBD16.最终可能导致建立不定根 - 原始身份，是lbd18突变体表现出缩小的根数和LBD16LBD18双突变体的根明显减少lbd16或lbd18；但是，过度表达LBD18.挽救了根的形成lbd18和LBD16LBD18突变体，可以刺激根部形成arf7arf19突变体[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="45" href="#ref-CR45" id="ref-link-section-d13040e1950">45，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="46" href="#ref-CR46" id="ref-link-section-d13040e1950_1">46，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="47" href="#ref-CR47" id="ref-link-section-d13040e1950_2">47，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 48" title="48" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1953">48］．在目前的工作中，大量的生长素诱导的DEGs，包括ARF7，ARF9和他们的下游磅转录组和qRT-PCR数据均显示这些DEGS明显上调，表明它们在蓝莓AR形成中的潜在作用。然而，这些响应基因在蓝莓AR形成中的功能作用尚不清楚，有待进一步验证。

众多研究拟南芥其他物种表明，主要由流入和流出载体介导的植物素极性传输（APT）系统对于AR启动和随后的发展是必不可少的，因为APT系统是严格定向的，以建立养蛋白不对称定位，从而诱导ARS启动和出现[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="49" href="#ref-CR49" id="ref-link-section-d13040e1971">49，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="50" href="#ref-CR50" id="ref-link-section-d13040e1971_1">50，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 51" title="51" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e1974">51］．PIN-FORMED（销）蛋白质及其类似物PIN喜欢（PILS.）被认为是流出载体，AUX1和AUX1-LIKE（宽松的）家庭担任涌入载体，已被证明对AR形成产生了很大影响[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="52" href="#ref-CR52" id="ref-link-section-d13040e1999">52，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="53" href="#ref-CR53" id="ref-link-section-d13040e1999_1">53，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="54" href="#ref-CR54" id="ref-link-section-d13040e1999_2">54，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 55" title="55" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2003">55］．这些流出载体基因的上调可能导致观察到的Pat依赖性生长素峰，从而为AR形成的诱导或引发有助于[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 14" title="14" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2006">14，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 30" title="30." href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2009">30.］．先前的研究表明，较高的表达PIN1.增强非根组织的AR形成pin1突变体未能建立一种生长素梯度并显示根部形成的发育障碍。同样，水稻中的AR发育显着抑制OsPIN1RNA干扰(RNAi)转基因植株表现出AR出苗缺陷，外源应用NAA可以挽救植株的生根表型RNAi-OsPIN1植物 [<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 56" title="56" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2025">56］．的pils2pils5双重损失的功能突变体具有更高的助长水平和横向根系而不是PILS5.获得功能性表型[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 57" title="57" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2034">57，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 58" title="58" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2037">58］．对肿瘤诱导基因的局部表达模式分析有助于揭示在蓝莓中控制不定的生根事件的潜在调节途径。在这项工作中，鉴定了几种唾液中流入和流出载体基因，并发现它们的表达与AR发育相比，具有疾病减少的蛋白质AUX22在非常早期即7 DAC - 21 DAC上调。此外，生长素流入载体LAX3 / 5.生长素外排载体PIN样6.也上调，提示这些生长素相关基因可能参与了蓝莓AR诱导阶段，在此阶段，起始细胞开始去分化，然后形成圆顶形根原[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 59" title="59" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2050">59］．虽然已经确定了这些DEG的功能拟南芥或其他植物，其在调控蓝莓AR形成中的功能尚不清楚，需要进一步研究。

侧根原根1（LRP1恰巧），哪个是10个成员中的一个史基因家族，作为下游的转录激活剂辅助/ IAA，它主要表现在侧根原始形成的早期阶段[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="60" href="#ref-CR60" id="ref-link-section-d13040e2074">60，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="61" href="#ref-CR61" id="ref-link-section-d13040e2074_1">61，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="62" href="#ref-CR62" id="ref-link-section-d13040e2074_2">62，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 63" title="63" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2078">63］．LRP1-like转录本最初是在子叶中检测到的，然后迅速被限制在细胞分裂和根形成的上层区域[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 64" title="64" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2084">64］．在这项工作中，四个LRP-like通过转录组数据鉴定基因，并且在IBA治疗后肯定会上调，特别是在21dAc和28dac，在此期间，RP / RPI和Ar开始形成，表明潜在的作用LRP-like蓝莓AR形成的基因。此外，一些其他基因，如根分生组织生长因子9 (RGF9.)和休眠相关蛋白同源物3 (DRMH3），在本研究中鉴定。RGF.，是一种重要的多肽激素，通过对根分生组织的影响来调节根分生组织的发育PLT1/2干细胞转录因子或通过调节受体的稳定性RGFR1［<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 65" title="65" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2109">65，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 66" title="66" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2112">66］．在本研究中，转录组和qRT-PCR数据均表明RGF9.在IBA治疗后上调。DRM.，是生长素抑制的超家族基因之一，被认为在休眠和非生长组织中都有高表达。BrDRM1表明与根生长产生负面相关，这减少了50％以上BrDRM1-Overexpressing.拟南芥植株数量的减少与植株数量的增加有关BrDRM1表达水平[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 67" title="67" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2135">67］．然而，在这项研究中，DRMH3在IBA治疗后，用AR形成高度调节，特别是在28 dac。这种不稳定性可能是由各种功能引起的DRM.基于植物物种或每个成员之间的功能差异DRM.家庭。因此，分子的功能DRMH3在蓝莓ar形成中应进一步分析。尽管本研究中鉴定的DEG的分子功能仍然是未知的，但我们的工作为未来的基因特征提供了基础，以确定蓝莓中IBA诱导的AR形成的代谢。然而，AR形成是由多种基因或转录因子控制的复杂发育过程，除了在蟾蜍素信号通路中的这些含量;因此，其他生物途径中的基因也可能在调节AR形成方面发挥潜在作用。因此，在未来，我们将尝试对转录组数据进行全面分析，以扩大我们对涉及蓝莓的AR形成的监管机制的理解，例如促进生物合成和分布，二次新陈代谢，运输和降解的参数途径以及与细胞蛋白，芸苔类固醇（BRS），ABA，乙烯，GA及其与候选信号通路中的候选DEG的相互作用。

IBA应用程序显着改善了不定的生根率。蓝莓中的AR形成是一种毒素诱导的方法，在14dac时引发不定根原始（RP），在21dac中形成的Rp，在35dac的28dac形成的Ar，在35 dac观察到的茎中。较高的IAA含量和降低ABA或ZEEPIN水平将有助于蓝莓AR形成。为了我们的知识，这项工作是第一个提供全面的转录组件分析数据库，用于在蓝莓中IBA诱导的AR形成中的成绩信息的动态视图。组装了总共672,606份转录物和308,719个unigenes。成功鉴定了大约14,970℃，其中超过了7467，下调7503。基于它们的表达谱被认为，总共35次参与生长素信号和生根相关途径的候选基因。虽然需要进一步研究这些DEG的功能特征，但我们的研究结果为蓝莓AR形成的分子机制提供了新的见解，并为未来的蓝莓AR形成进展提供了一个相对完整的分子平台。此外，本作作品中的发现允许鉴定参与蓝莓AR形成的候选基因，因此代表了蓝莓进一步快速繁殖和繁殖的重要分子资源。未来的作品应旨在表征这些确定的个体参数的功能作用，并因此表征了他们的监管网络或交叉谈话。

植物材料

本研究以红越花卉有限公司的南高丛蓝莓品种“碧洛西”为材料，在上海农业科学院庄行综合实验站进行栽培。春季，随机采到长10-15 cm的绿色插枝约150条，取去大部分叶片，保留顶部1-2片叶片。岩屑是沉浸在去离子水(控制)和1000 ppm indole-butyric酸(IBA, 1 g溶解在600毫升75%的酒精与水稀释1 L) 1分钟,然后插入由泥炭藓的生长介质,蛭石和花园土壤3:1:1的比例(v / v)。a等人(2019)曾详细描述过水资源管理[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 7" title="7" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2170">7］．试验安装后约40 d，对生根率、平均根数和平均根长等表型进行调查。所有实验都有三个重复。

蓝莓扦插植物激素分析

试验安装后，每隔7天随机抽取插枝根部的茎干(即7 d、14 d、21 d、28 d、每个采样时间取大约0.5 g新鲜组织在液氮中研磨，在5 mL乙酸乙酯中4℃消化12 h，然后在4℃10000 rpm离心10 min。残渣成分用3 mL乙酸乙酯进一步消化，在4°C, 10000 rpm离心10 min。上清液25℃氮气流干燥，用300 μL色谱甲醇溶解，超声提取10 min。最后用0.22 μm滤膜过滤，注入5 μL进行分析。Niu et al.(2014)采用液相色谱-质谱(LC-MS)分析内源植物激素(包括IAA、ABA、GA3和玉米素)的水平[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 68" title="68" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2181">68稍作修改。简单地说，流动相由乙腈(溶剂A)和0.02% (v/v)冰醋酸水溶液(溶剂B)组成。样品在液相色谱系统(ACQUITY I-CLASS, Waters)的C-18柱中纯化，最后用质谱(AB SCIEX analyst, QTRAP™5500)进行测定。采用IAA标准(cas: 87-51-4, Sigma)、ABA标准(cas: 21293-29-8, Sigma)、GA3标准(cas: 77-06-5, Sigma)和玉米素标准(cas: 13114-27-7, Sigma)优化质谱参数和片段谱。采用6种不同浓度(0、2.5、5.0 10、12.5、25、50和100 ng/mL)测定IAA、ABA、GA3和玉米素标准品的校正曲线。校准曲线的线性回归在附加文件中有详细说明<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">9S1:表。

显微组织观察

插入后，从扦插底部的1cm部分以7天的间隔进行采样，以观察到不定根的形成。所有样品从三个生物重复中收集n每个复制= 10。样品固定在FAA溶液(甲醛/乙酸/70%乙醇= 5:5:90,v/v/v)中。显微结构观察前，样品用4%乙二胺软化约10天，然后用分级乙醇(75、85、95和100%)脱水。用二甲苯进行玻璃化处理，然后用石蜡包埋样品。然后用旋转切片机(LEICA, RM2265)切割10 μm厚的横切面，拍照并在光镜(NIKON ECLIPSE E200)下观察。

总RNA提取，测序和DE Novo转录组组件

每隔7天取样1 - 2cm的插枝基部茎部，立即用液氮冷冻保存在−80°C中，然后进行分析。用TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies, USA)提取总RNA。然后使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦，CA，美国)确认RNA的完整性。RNA-seq文库由TruSeq RNA样品制备试剂盒(Illumina, San Diego, CA, USA)生成，并由上海个人生物技术有限公司(Shanghai Personal Biotechnology Co.， Ltd)应用HiSeq平台(Illumina)进行RNA_seq分析。利用Trinity进行转录组从头组装。

序列注释和鉴定显着不同的表达基因（DEGS）

所有Unigenes都被Blastx搜索注释了五个数据库，即NR数据库，Go Database，Kegg Database，eggnog数据库和Swiss-Prot数据库E值≤10⁻⁵，并根据最优对齐结果确定序列方向。利用BLAST2GO软件和KEGG自动注释服务器分别获得氧化石墨烯富集和KEGG通路注释。的意义P-Value≤0.05的DEGS通过DESEQ软件测定，具有阈值| log2foldchange | > 1 [<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="69" href="#ref-CR69" id="ref-link-section-d13040e2223">69，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="70" href="#ref-CR70" id="ref-link-section-d13040e2223_1">70，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="71" href="#ref-CR71" id="ref-link-section-d13040e2223_2">71，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 72" title="72" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2226">72］．

qRT-PCR分析基因表达

对于QRT-PCR，逆转约1μg的总RNA以使用具有GDNA橡皮擦（RR047，Takara，Japan）的PrimerScript TM RT试剂盒获得cDNA。QRT-PCR在含有5.0μL的总体积为5.0μLSYBRpremix ExtAQ TM（RR820A），每次底漆（10μm）的总体积为10μL的总体积。，2μlcDNA和2μLDDH₂O.在江等人中描述了PCR条件。（2016）[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 73" title="73" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0" id="ref-link-section-d13040e2239">73］．GAPDH.用作内部控制。每次反应用三种生物学重复进行，并一式三份（技术重复）分析每个样品。QRT-PCR分析的特殊引物序列在附加文件中显示了细节<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0">10S2:表。

统计分析

采用SPSS 18.0软件(SPSS Inc.， Chicago, USA)进行单因素方差分析(ANOVA)。图形使用GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc.)创建。

所有原始数据存储在两个数据库中，即NCBI Sequence Read Archive (SRA)，登录号为SRR11517305 (CK7)、SRR11517304 (CK14)、SRR11517303 (CK21)、SRR11517302 (CK28)、SRR11517301 (CK35)、SRR11517300 (T7)、SRR11517299 (T14)、SRR11517298 (T21)、SRR11517297 (T28)、SRR11517296 (T35);CRR078491 (CK7)、CRR078492 (CK14)、CRR078493 (CK21)、CRR078494 (CK28)、CRR078495 (CK35)、CRR078496 (T7)、CRR078497 (T14)、CRR078498 (T21)、CRR078499 (T28)和CRR078500 (T35)的基因组序列档案(GSA)在国家基因组数据中心。两个数据库中的所有数据都已公布。

阿坝:

脱盐酸

方差分析:

方差分析

易于：

生长素极性运输

基于“增大化现实”技术:

不定根

东盟地区论坛:

助线响应因子

辅助/ IAA:

生长素/ INDOLE-3-ACETIC酸

DAC:

切割后的几天

可见：

差异表达基因

DRMH3:

相关蛋白质同源3

蛋酒：

基因的进化谱系:非监督的同源组

FPKM:

kb碎片/百万碎片

赤霉素:

赤霉素3

去：

基因本体论

GSA:

基因组序列档案

IAA：

吲哚-3-乙酸

IBA:

Indole-butyric酸

Kegg：

基因和基因组的Kyoto Encclopaedia

LAX：

AUX1-LIKE

LBD：

含有含域域的蛋白质

质:

液相色谱-光谱法

LRP1：

侧根原根1

NR:

非冗余蛋白质

而得利:

PIN喜欢

别针：

PIN-FORMED

RGF9：

根业经生长因子9

RNAi：

RNA干扰

RP：

根产业

RPI：

根原基开始

我们会感谢Zia-Nan Zhang博士的帮助，帮助通过LC-MS分析内源性植物激素。

这项工作受到上海（17391900800）的农业系统重点科技项目的财务支持，以及上海农业委员会（2015-6-2-2）的农业应用技术开发计划。资助机构在研究和收集，分析和解释的设计中没有作用，以及编写手稿。

隶属关系

1. 上海市农业科学院林业与散孔研究所，奉贤区奉贤区金奇路，201403

   海山，嘉盈张，方杰徐，双江＆薛莹张

2. 上海市农业科学园艺科技重点实验室，上海市农业科学院，上海市奉贤区金奇路1号。201403

   海山，嘉盈张，方杰徐，双江＆薛莹张

贡献

XY和HA组织了整个项目;HA，JZ，XF和SJ进行实验和数据分析;和XY和HA写了并编辑了手稿。所有作者阅读并认可的终稿。

相应的作者

对应于<一个id="corresp-c1" rel="nofollow" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0/email/correspondent/c1/new">双江或<一个id="corresp-c2" rel="nofollow" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02398-0/email/correspondent/c2/new">Xueying张．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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