一种珍稀报春花非对称渗入和生殖障碍的保护意义

永鹏马^1.^NA1.,
托拜厄斯Marczewski^1.^NA1.,
丹雪^2.,
吴村吴^1.,
荣利廖^1.,
威义阳光^1.&
Jane Marczewski.^2.

BMC植物生物学体积19，文章编号：286(2019年)引用这篇文章

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指标细节

摘要

背景

报春是一种大属的开花草药，众所周知的异形草药。目前少量的天然杂种是已知的，并且在野外的这种属中是繁殖的繁殖障碍接受了很少的关注。然而，有罕见和广泛的种类之间存在杂交的实例，并且这种情况的保护意义却很差。在本研究中，我们调查了广泛的涂抹物种之间的杂交模式和生殖障碍物，樱草属植物poissonii是一种罕见的物种P.Anisodora其中，目前已知的只有三种。

结果

传粉者介导的生殖隔离在亲本间较强，而在杂种与亲本间不显著。人工授粉试验表明，与双亲同种授粉相比，异种授粉的结实率和结实率都显著降低。此外，杂交种在授粉时具有较高的结实率和结实率P.Anisodora花粉和反对p . poissonii花粉。微型卫星识别回交P.Anisodora在三个种群中的两个p . anisodora另外更多的人P.Anisodora显示出迟钝p . poissonii比反之亦然。

结论

这些结果提供了潜在的遗传淹没的证据P.Anisodora这可能会对这种当地特有的物种造成严重威胁。

背景

自然杂交在研究进化的几个方面具有重要意义，包括新的生态型或物种的起源，遗传适应的起源和转移以及生殖障碍的加强或分解[1.,2.,3.]. 然而，如果杂种不育和/或生活力低，由于杂交过程中花粉和/或胚珠的减价，自然杂交也可能对稀有植物物种构成严重威胁。此外，可能存在基因淹没的风险，部分可育和可存活的杂交种正在取代纯亲本基因型[4.,5.］.

一般认为生境干扰是杂交的驱动力[6.,7.,8.]，因为它可以改变生殖相容物种之间的接触模式，例如，由于创造了合适的中间栖息地，有利于杂交物种的成功建立。人类介导杂交预计将在全球范围内增加，因此对稀有物种的潜在威胁比以往任何时候都更加严重。在发达国家(如美国、加拿大)，杂交引起的保护问题已经得到了充分的探讨，甚至通过国家保护法规得到了解决[4.,7.,9,10］.相比之下，发展中国家似乎没有多少研究努力来处理这个问题，这对决策者认识到人为环境变化所造成的有关威胁产生了负面影响。

虽然经常有植物杂交的报道，但大多数案例涉及广泛分布的物种，杂交带数量有限，只发生在同域分布地区[7.,11,12,13］.在这种情况下，由于地理隔离仍然足够强大，以维持两种物种的群体，因此对任何物种都足够强大而没有迟钝。然而，如果其中一个杂交物种具有狭窄的分布，则其所有群体可能会从其他物种中暴露于Geneflow。

报春是一种大型植物属(> 500种)，以其异型花柱而闻名。两个欧洲物种的种间杂交和生殖隔离已经研究了一个多世纪;然而，该属的其他物种在这方面几乎没有受到任何关注[13］.在本研究中，我们研究了广泛的涂抹物种之间的杂交和生殖障碍的模式樱草属植物poissonii和罕见的物种P.Anisodora目前已知的只有三种。两种都是异柱的。我们的目的是:(1)阐明这两个物种杂交群体的遗传结构，(2)研究繁殖障碍如何影响杂交模式;然后(3)评估杂交在保藏中的作用P.Anisodora为了开发有意义的保护管理策略。

结果

粉丝犬介导的生殖分离（RI）

对于自然环境下的传粉者观察，以纯亲本物种为重点，共观察了804次昆虫访花p . poissonii：Bumblebees（43％），224次访问Bees（AnthophoraSp .， 28%)，蝴蝶为217(27%)，食蚜蝇为16(2%)。为P.Anisodora植物，435次访问录制：Bumblebees（77％），96名蜜蜂（AnthophoraSP。，22％），蝴蝶只有三次访问（0.3％）。虽然大黄蜂是父母种类的主要粉碎机，但它们的总体访问比例明显更高P.Anisodora（77%对43%，χ^2. = 131.2;p< 0.001)。此外，蝴蝶是重要的传粉者p . poissonii，但似乎只意外地结束了P.Anisodora花。

在图1中观察到总共124次授粉突发，其中包括31个交叉特异性和93个CON特异性的回合。总共观察到276次过渡，包括71个异相转变。因此，父母物种之间的图1中的整体术语Ri = 1-31 / 124 * 71/276 = 0.940。对于曲线2，总共观察到144个突发，其中包括39个交叉特异性和105个细胞的回合。共观察到共有443个过渡，包括88个具有异质转变的回合。Plot 2之间的整体道德RI在父母物种之间= 1-39 / 144 * 88/443 = 0.946。

在图3,114中，观察到114个Bout（仅在物种/杂种中的39），并且将总共561个过渡从一个植物观察到另一个植物。在这些过渡，404中，占总数的72％，在分类群内。其余的157转换，占物种之间总量的18％（图。1.；附加文件3.：表S3）。大多数拜访和因此过渡的粉丝器组是蜜蜂（Anthophora sp。），但对于p . poissonii蝴蝶(难点共有)是更频繁的访客(图。1.）.对于蝴蝶之间，两种物种之间没有观察到异质转变，但之间的过渡p . poissonii杂交也发生了。1.）;只有蜜蜂和大黄蜂实现异常的转变，而且与面临的过渡相比也很少。然而，在任何一种物种和杂种之间的转变更频繁地发生（图。2.)没有偏向任何亲本物种（杂种xP.Anisodora与杂交种X.p . poissonii: 66对63;χ^2. = 0.09;p = 0.7). 因此，我们能够拒绝杂交和/或回交的方向是由传粉者的飞行行为决定的假设。

人工授粉试验

家长之间

结实率和结实率的结果显示出几乎完全相同的模式:当某种类型的杂交更容易结实率时，这种类型的杂交平均每个果实的种子数也更高。3.此外，由于“母种”因子对坐果率或结实率没有显著影响，两个物种产生的种子数量相当(表1.）.如预期的那样，形内(针-针，线头-线头)异花授粉比形间(针-针，线头-线头)异花授粉产生的果实和种子数量显著减少(图1)。3.A，B;表中的'交叉类型'1.). Thrum花似乎更具选择性，因为它们从种间花粉中产生的果实/种子更少。总体P.Anisodora是更成功的花粉父母，这在变形内粉粉粉末最典型（图。3.a、表中b‘花粉源’、‘花粉源×杂交型’、‘花粉源×母种’、‘花粉源×花型’1.）.

表1水果套和种子数字的Anovas。ANOVAS测试2015年授粉治疗中若干因素对种子产量的贡献的结果。评估了三个阶段：水果套（导致水果的授粉百分比）;种子数为每种水果;每朵花种子编号。包括以下因素（具有给定水平）：母亲物种（Anisodora，Poissonii）;花型[母植物]（PIN，THRUM）;花粉来源(山莨菪属、泊松属);交叉类型（变形内，互相）。粗体突出显示了显着的结果。提名者自由度（d。f。）= 1，分母d。 f. = 91

全尺寸表

对种内杂交（8个处理）的三因素方差分析表明，异种授粉可显著提高果实产量（F = 159.8,p< 0.001)，每个果实的种子数(F = 168.4，p < 0.001) and seed numbers per flower (F = 115.4,p< 0.001)，而不是从形态内授粉处理(“交叉型”在附加文件2.：表S2）。

亲本物种和杂种物种之间

16种杂交处理中，有7种没有结果。特别是,p . poissonii花粉在杂交母本上不能产生任何种子(图。3.a、 b，“杂种”，占授粉失败处理的6个（附加文件）1.：表S1）。这导致杂种和粉粉粉授粉后的水果套和种子编号显着降低p . poissonii(16/143 = 11.2%)P.Anisodora（37/168 = 22.0％），（水果集：χ^2.= 5.67;p = 0.02); seed numbers (hybrids xp . poissonii6.25 vs.混血儿xP.Anisodora10.75;Mann-Whitney U = 14，p = 0.048, Additional file1.：表S1）。

分子的结果

人口遗传分析

我们对168份材料进行了基因分型，这6个核微卫星位点在3个不同地域的群体和杂交区进行了筛查:只有2份材料没有扩增出所有的位点(P39450-2的Ab17和P28273的AX9)。在白水台群体中，P39450-2 /P47381位点间存在单一连锁不平衡。小燕京群体中有一个位点(P33802)偏离Hardy-Weinberg平衡(HWE)。由于各位点间未检测到HWE或连锁平衡的一致偏差模式，下游分析基于所有微卫星位点的基因型数据[14,15］.

群体遗传分析表明，假设的杂交种具有最高的有效等位基因数(2.136)，最高的观察等位基因数(0.573)，最高的期望杂合度(0.511)和无偏期望杂合度(0.518)4.：表S4）。成对F_圣亲本种之间和居群间假定杂种之间的值最高p . poissonii在香格里拉,P.Anisodora在兰都（0.614）和P.AnisodoraBaishuitai和Langdu人口（0.045）之间。在Baishuitai的混合区内，最高的成对_圣亲本种间为0.472，杂种种间为0.472P.Anisodora具有最低的F_圣值(0.119)，中间值F_圣杂种和杂种之间的价值（0.177）p . poissonii（附加文件）5.：表S5）。

亲本和混合分配

ΔK的值对于k = 2显然是最高的，因此我们进行了假设两个群集的进一步分析（附加文件7.：图S2）。以下十个独立的结构与K一起运行 = 2、香格里拉人群中形态学上被鉴定为p . poissonii被分配给一个具有很高的概率的集群，而我们被美国识别的那些集群P.Anisodora都以同样高的概率被分配到第二个聚类(图。4.a）是的。然而，在小燕京群体中，有三份材料表现出一定数量的混合血统(P.Anisodora集群比例<90％），表明过去的杂交发生。在Baishuitai杂交区内，13个进入P.Anisodora和三个进入的p . poissonii显示相同的模式，与主要集群血统是< 90%表明渐渗。

回复个体的比例P.Anisodora是否高于回交个体的比例p . poissonii在杂交区（13：3;χ^2. = 5.67, df = 1,p= 0.018)。总的来说，三个人中的两个被调查了P.Anisodora人口表现出现在或过去的渐渗迹象p . poissonii(无花果。4.一种）。

NewHybrids的输出结果与结构上的聚类一致:相同的13个个体P.Anisodora还有三个人p . poissonii具有少于90％的后概率，它们不是混合源性的（图。4.b).因此，明显更多P.Anisodora个体表现出基因渗入的痕迹p . poissonii(χ^2. = 6.71, df = 1,p = 0.01). Of the 39 putative hybrids, two were identified as pureP.Anisodora后验概率>为90%，而30为回交P.Anisodora后验概率>为60%其余杂种的后验概率均小于60%，均归为后代杂种(图1)。4.b）。明显地，杂交区中没有杂交区的个体被确定为f_1.(在所有情况下，这类的后验概率都低于30%)。

在白水台数据模拟的150个个体中，134个个体以90%的概率被分配到正确的类别，因此根据我们的SSRs确定了89.4%的分配成功。的F_1.S和模拟家长物种，100％被正确分配。

讨论

杂交形成前后的血液生殖障碍

在Baishuitai的Sympatric混合区，开花时期p . poissonii和P.Anisodora完全重叠。然而，尽管如此，没有F1 s检测到近100%的区别功率从混合模拟这一类别。这种缺乏的部分原因可能是传粉者相对较高的稳定性(图。2.，Conspecific Vs. heterspecifc），结合观察p . poissonii大部分受蝴蝶授粉（图。1.)，通常不会来P.Anisodora根本可以预期这种杂交的初始阶段是罕见的，也可以从两者授粉阶段的整体道德生殖隔离指标中看到罕见p . poissonii -和p . anisodora -占人口的主导部分（图1和图2），其均高于0.94。此外，物种之间的某些内在素质似乎存在，因为本发明的授粉产生的果实和种子显着多于异质纤维，而不是异常的授粉（图。3.；尽管产生了相当数量的种子，特别是在物种内形态不亲和存在的配对(图。3.销/销)。

不同的隔离障碍以分层顺序行动，因此早期障碍可以促进总分离的贡献而不是晚期障碍[16,17)，表明授粉者介导的亲本物种之间的生殖隔离起着关键作用，高行为学生殖隔离证明了这一点。我们假设不同的花朵颜色(深红色vs.品红)对两种主要传粉者群体(蜜蜂/大黄蜂vs.蝴蝶)具有不同的吸引力，但除此之外，花朵的朝向P.Anisodora（下垂）使蝴蝶很难访问它们。这导致蜜蜂和大黄蜂更喜欢P.Anisodora，但偶尔来访p . poissonii，而蝴蝶则被限制在一起p . poissonii．然而，由于不存在机械障碍，蜜蜂/大黄蜂的转换率可以被环境依赖的选择局部改变，例如杂交模式之间Rhinanthus小和R. angustifolius[18］.虽然F的初始形成_1.如果存在一些杂交种，普遍存在的人群歧视的部分崩溃似乎促进了进一步的杂交，因为粉丝患者显示杂种和父母种类之间的过渡，而不是亲本物种（图。2.异种与杂种）。

高度不对称血气

遗传数据提供了显着血气的证据P.Anisodora，而只有很少p . poissonii个人表现出这样的迹象（图。4.a, b).回交的不对称性在自然界中并不罕见，假设在合子前和合子后阶段生殖障碍的强度不对称-甚至可以预期[4.,19,20.,21,22］.关于预触诊分离，从杂种的过渡率之间没有显着差异P.Anisodora(66)和杂交种p . poissonii（63）在观察到的粉碎机中显而易见，因此不太可能对回程的方向产生影响。另一方面，内在的崇拜似乎有利于回复p . anisodoraAshybrid母亲只能成功受精P.Anisodora花粉。应该指出的是，没有f_1.在杂交区中检测到S中，大多数包含在粉碎机观察和手授粉实验中的杂交种是可能的回复P.Anisodora可能还有其他类型的后代杂交，但可能会减少p . poissonii遗产。这可能导致我们研究中的杂种之间的相对较低的RIP.Anisodora植物，如果f如果是_1.S也参与其中，但并不能完全解释为什么杂交品种不能结出果实p . poissonii花粉，as.P.Anisodora植物可以施肥。

另外，对不对称有贡献的一个因素可能是两种物种丰富的差异：许多开花植物p . poissonii比P.Anisodora存在于Baishuitai的人口中，在SympaTric区域达到近4：1的比例（2017年）。假设一些f_1.传粉者在种与种之间的区别很好，而在杂交种与任一种之间的区别更差，亲本种的丰度差异仅仅通过取样偏差就会导致偏差。例如，比例为4:1(p . poissonii来P.Anisodora)，其中包括4%或76.8%p . poissonii, 19.2%的P.Anisodora，4％的杂种，假设花粉将源自物种和杂种，杂交花粉（与连带花粉相比）存入p . poissonii和P.Anisodora鲜花是4 /(4 + 76.8)= 4.95%,4 /(4 + 19.2)= 17.2%,分别。此外，对于杂交种，只有花粉来自P.Anisodora会导致受精，加剧偏倚。

保护管理P.Anisodora防止遗传沼泽

作为P.Anisodora目前已知的野生种群只有三个，而且已知它与一个分布广泛的物种杂交，保护可能是必要的，以防止遗传沼泽。根据我们的结果，人口P.Anisodora在Baishuitai受到严重影响的p . poissonii标记，表明可能存在基因淹没的威胁。在小燕京的第二个人口中，没有其他人报春发现的种中，20个个体中只有4个表现出可能的渐渗p . poissonii．的最后一个抽样群体p . anisodora在Langdu，没有任何过去血气的证据，我们建议应采取紧急的保护行动来保护这一人口。

最近提出的指引概述了当杂交涉及濒危物种时应采取的行动[9,10］.首先需要澄清的是杂交是自然发生的还是人为引起的[10］.我们认为杂交之间p . poissonii和P.Anisodora可能是由人类活动引起的，因为在21世纪初修建了一条穿过混合区的新路，附近修建了酒店来吸引游客。随着人口压力的加大，畜牧业的放牧成为一个更严重的威胁。例如，在田间试验期间，经常可以看到牛吃草的叶子和花P.Anisodora．此外，所有假定的杂交物种都与亲本物种一起生长，我们没有观察到任何杂交物种占据新的栖息地，这表明对剩余栖息地的潜在竞争。相比之下，“纯”P.AnisodoraLangdu的人口没有人类活动的证据，并且位于远离任何村庄的偏远地区。剩下的人口P.Anisodora在小燕京，虽然远离任何村庄，但非常接近一条柏油路，因此可能受到威胁。

此外，本研究表明，杂交种干扰了传染案介导的RI，并且可以导致侵入Genepool的加速P.Anisodora，这在某些情况下尤其危险p . poissonii更频繁。而杂交的第一步（F_1.S)似乎是一个困难的，稍后回交似乎发生更容易。

因此，基于我们的主要调查结果，我们建议我们的保护行动计划P.Anisodora．(i)考虑到经过白水台混合区的道路，应分别设置2个保护地块。第一块地块将位于道路上方，离当地村庄非常近。这块地应该受到保护，因为数量最多的P.Anisodora个人可以在这里找到。在路下面的第二个剧情将包括一些P.Anisodora，一些混血儿和许多个体p . poissonii．优选在当地人民的帮助和支持中进行这些行动，而不是通过严格的监管执行保护。（ii）在几年内，应在开花季节期间筛选杂种的血液中，应当删除两个地块中类似形态杂种的植物。因此，将恢复没有开花杂种的SympaTric区域。我们期望在介于之间保持更强大的生殖隔离p . poissonii和P.Anisodora在这样的背景下。(3)在小岩井进行详细的实地调查，核实是否有其他的p . poissonii种群分布在同一座山上。这两种植物都生长在小溪边，而且种子很容易通过水传播。因此如果一个p . poissonii人口甚至存在一些距离远离P.Anisodora如果一条河流是共享的，那么一个同域区域就可以形成。如果没有p . poissonii发现，这里不需要采取任何保护行动，因为我们预计在这些物种之间经过连续几代的回交之后P.Anisodora植物p . poissonii遗传物质和P.Anisodora，这里的所有个体最终都会变得几乎纯净P.Anisodora．鉴于…的人口P.Anisodora与其他两个居群(F_圣兰迪＆小玉= 0.433;F_圣对于兰迪＆baishuitai = 0.347;F_圣对于白水泰和小燕京= 0.045)，该群体可用于加强其他群体的遗传多样性。为此，应该收集种子，并在引种到其他两个种群之前进行繁殖。

结论

我们研究了一种广泛分布的(p . poissonii）和一个难得的承诺物种（P.Anisodora）.杂交种的微卫星分析表明了回交的发生P.Anisodora在三个种群中的两个p . anisodora和更多个人P.Anisodora显示出迟钝p . poissonii在同域区域，反之亦然。传粉者观察发现，传粉者介导的生殖隔离在亲本种之间仍然很强，但在杂交种和亲本种之间不显著。手授粉处理在亲本种间表现出内在的不亲和性，而且用手授粉的杂交组合具有较高的结实率和结实率P.Anisodora花粉和反对p . poissonii说明非对称杂交不亲和也可能对杂交带的遗传结构起作用。全面证据表明，潜在的遗传沼泽P.Anisodora在本研究中检测到群体，以及详细的保护管理，以降低遗传沼泽的风险P.Anisodora我们得到了建议。

方法

植物种类、研究地点和取样

这两个研究物种p . poissonii和P.Anisodora是多年生草本植物，在高山的高山草地上生长在2500到3700米之间的海拔地区[23］.而p . poissonii相对普遍，发生在喜马拉雅山东部（西藏，云南和四川），P.Anisodora仅在云南省(中国)有三个种群:香格里拉县的两个种群(浪渡和白水台)和怒江县的一个种群(小燕井)(附加文件6.:图S1)。我们只知道一个地区，这两个物种都生长在共生体中，似乎形成了混血儿(白水台)。这个混合带的面积约为15公里^2.在云南西北部香格里拉白水台(27.6°N, 100.04°W, 3100米)。该种群位于潮湿的高寒草甸，有一条小溪穿过。2017年，个人很重要P.Anisodora和p . poissonii开花植物分别为517株和2349株。

父母种类和杂种可以通过花卉颜色和花香方向轻松区分：P.Anisodora有深红色，下垂的花朵;p . poissonii有与茎垂直的洋红色的花;公认的杂种具有中间的颜色和花取向(图。5.a, b, c)。

在2014年开花期间，共对168个个体被取样：108来自杂交区（P.Anisodora：36个人;p . poissonii：33个人;推定的杂交种：39个人）;20来自两种各种产物P.Anisodora小燕京(26.58°N, 99.44°W)、朗都(27.95°N, 99.7°W)种群;和20p . poissonii来自香格里拉县附近的各种参考人口（28.2°N，100.04°W）。在单独编号的容器中收集并在硅胶中收集并保存。我们在这里陈述了本研究中收集和使用的所有样品以及在该研究中进行的授粉实验不需要任何许可。我们宣布目前研究中使用的植物材料符合政府法规。

杂交区的生殖障碍

两种植物的花期完全重叠，7月初开始，8月中旬结束。因此，我们预测传粉者介导的隔离和内在不亲和可能起到隔离亲本物种和杂种物种的作用，并可能决定同域杂交模式。

授粉介导的生殖隔离

传粉昆虫观察主要在两种环境下进行:(1)自然环境(2015年7月6日~ 7月10日)p . poissonii -或者p . anisodora -占人口的主导部分，评估他们的粉刷司机组合;（2）人工控制的绘制绘制绘制设定 - 在杂交区内建立了三个地块，以评估父母物种之间的生殖障碍。这些图中的第一个（图1）设置为ap . poissonii -结果表明，两种亲本植物(各10株)均占种群总数的绝大部分。5.d);第2块与第1块布局相同，但被放置在p . anisodora -占人口的绝大部分(图。5.F）;将图3放入杂交区内，并包含父母和杂种（图。5.e).栅格设置的单株植物间距约为50 cm，根据形态特征进行种/杂种鉴别。2015年7月6日至7月12日，对图1和图2进行了7天的观测;每日观察时间为09:00至17:00。然而，如果天气条件对传粉昆虫不利(如下雨)，野外观测就会在这段时间内停止。图3为2015年7月7日至11日5天晴天观测。我们将传粉者接近花朵的行为记录为访问，仅当传粉者觅食或通过触摸植物的生殖结构与花朵发生互动时。对各类观赏花卉进行拍照、鉴定，并保存在昆明植物研究所昆虫标本中。

继Natalis和Wesselingh [18，我们计算了总体行为学生殖隔离(RI)p . poissonii -以及p . anisodora -占人口大多数为:1 - (No。跨物种觅食次数/总觅食次数)×(异种转变/所有转变)。在这里，一回合是指昆虫从接近小区到离开小区的访问，不管小区内访问了多少植物，而过渡是指类型(同种植物vs异种植物)和一回合内访问的次数。