这GydF4y2Ba茄科植物施肥相关激酶3 (ScFRK3)GydF4y2Ba参与男性和女性配子体发育GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

受精相关的激酶（FRK）形成属于植物MAPKKKS的MEKK亚家族的课程。最近据表明，FRK类激酶在高昂的植物演变期间扩大，达到了导致索甘蓝物种的最大数量，并在Solanum Genus中达到了超过40％以上的百家能。第一批成员学习，GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba和GydF4y2BaScFRK2型GydF4y2Ba显示在野生土豆种的配子体发育中发挥关键作用GydF4y2BaSolanum chacoense。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

ScFRK3型GydF4y2Ba也参与配子体发育。GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在开发花粉和年轻胚珠中表达，在减数分裂后立即达到其最高水平，并且在染色体中的吐痰中达到了最高水平。因此，三条独立的线条GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2BaRNAi突变植物显示每个果实的种子数量下降。我们还观察到成熟卵巢中的重要胚胎囊。胚珠发育分析显示，大多数胚囊囊在SC中没有进入丝分裂GydF4y2BaFRK3GydF4y2BaRNAi突变植物。在雄性配子体发育期间也观察到严重的致死率，花粉在雌性配子体中观察到的含有丝分裂I之前被捕。未观察到营养器官中明显的缺陷，强调FRK类激酶的生殖作用。孤立地图激酶作用下游SCFRK3，DE NovoGydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba组装来自雄性和雌性生殖器官的转录组。在检索的五个SCMKK和16个SCMPK中，只有SCMKK3与SCFRK3互动，而SCMPK13只与SCMKK3相互作用，导致涉及SCFRK3-SCMKK3-SCMPK13的表观单一三层规范映射激酶级联组合。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

ScFRK3 MAPKKK参与调控雄性和雌性配子发育的信号级联，最可能的作用是在ScMKK3和ScMPK13的上游。GydF4y2Ba

与动物不同，植物的配子发育是一种高度监管的过程，不仅导致减数分裂，还导致几种有丝分裂，产生多细胞配子体。在大多数物种中，称为胚胎囊的雌性配子体在成熟的八个细胞核中包含七个细胞[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．雌性配子细胞的发展分为两步，巨型成分和兆甘油发生。在甲孢子发生中，Megaspore母细胞（MMC）通过减数分裂进行，导致四倍的单倍体四倍石，其中只有一个人将生存成为功能兆（FM）。在MegagameTogenesis期间，雌性配子体（FG）经历三个连续有丝分裂。然后得到的八个核Es被偏振，在小藻杆上有四个核，四个核在微囊杆处。每个杆的一个核迁移到中心，而其他杆子通过细胞化和分化。在成熟的阶段（FG7），两个合酶和一个蛋细胞位于微囊杆上，而另外三个细胞，抗癫痫杆，占据着种族杆。中心的两个核聚在一起成为独特的二倍体中央细胞[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．在男性方面，花粉母细胞（PMC）经历两轮减数分裂，以产生四种微微孢子。第一种花粉作用（PMI）发生在单倍体微孔的成熟后发生，在花粉晶体内产生两种不同的细胞：一个称为营养细胞的大型中央细胞，以及更小的中央细胞，生成细胞[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．一旦花粉谷物造成相同物种的合适花的耻辱，营养细胞会产生一个花粉管，将通过朝向胚珠伸长的花粉管。在索甘蓝物种中喜欢GydF4y2Ba茄GydF4y2Ba，在管伸长期间发生第二花粉丝分裂（PMII），以形成两个相同的精子细胞[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．当花粉管达到胚珠的微米时，两种精子从花粉管中释放以施肥，以施肥蛋细胞和中央电池，导致双重施肥产生二倍体胚胎和三倍体胚乳[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

细胞 - 细胞通信和男性和女性配子体发育的协调涉及复杂和紧密的步骤。因此，在各种功能中发现了对配子体发育至关重要的基因[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．其中一些是Megaspore Mother Cell（MMC）Meiosis所必需的[GydF4y2Ba5.GydF4y2BaDNA重组和染色体完整性[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]另一些参与FG的维持和有丝分裂，其突变导致胚囊在有丝分裂前发育停滞[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．由于其结构简单，花粉被激烈地用作研究植物有丝分裂和细胞因子的模型。实际上，许多基因中的突变导致通过PMC减数分裂，PMI（花粉丝分裂I）或PMII（花粉丝分裂II）进行缺陷。例如，突变GydF4y2BaTIO.GydF4y2Ba（GydF4y2Ba一分之二GydF4y2Ba）基因，编码融合的Ser / Thr蛋白激酶，也显示PMI的细胞因子缺陷，产生由于在细胞因子期间形成的细胞板的不完全细胞板而产生的细胞内花粉[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．TiO在初生脊髓晶状体中线定位，与PAKRP1 / Kinesin-12a蛋白相互作用，表明其在细胞因子微管组织中的作用[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]．在酵母双杂化测定中，TIO也与ATNACK1 / Tetraspore相互作用[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]另一种已知在植物细胞因子上起作用的kinesin [GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]．的确,GydF4y2Ba塔GydF4y2Ba和GydF4y2BaHinkel.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]两个多余的驱动蛋白参与PMI胞质分裂吗[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba]．它们与烟草是同源的GydF4y2BaNACK1.GydF4y2Ba，参与体细胞分裂。NtNACK1是MAPK信号级联的上游，在那里它激活MAPKKK NtNPK1 (AtANP1, 2,3)。一旦被激活，NtNPK1激活MAPKK NtNQK (AtMKK6)，最后，NtNQK激活MPK NtNRK1/NTF6 (AtMPK4) [GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]．活化的NTNTF6然后通过磷酸化MAP65和其他微管相关蛋白（MAPS）促进脊髓囊膨胀[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

MAPK信令广泛用于将信号从小区转换为细胞，并且植物拥有所有真核生物中最大的MAPK家族。例如，基因组GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba包含> 60 mapkkks分为三个家庭：rafs，ziks和mekks，10 mapkks（mkks）和20个mapks（mpks）[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]．Mapks已被证明参与了许多过程，例如压力响应[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]，防守[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba，激素信号[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]，和发展[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]．最后一个过程可能是最不调查的，因为相对较少的是已知的，尤其是在配子体发育中。在GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba在21个mekk中，发现两个功能冗余的mekk在花粉发育中起作用：GydF4y2BaMAP3Kε1;map3kε2.GydF4y2Ba（GydF4y2Bamapkkk7;mapkkk6GydF4y2Ba)双突变体在花粉发育过程中存在质膜形成缺陷，在球形或心形胚发育过程中也存在缺陷[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]．胚胎发育也受到影响GydF4y2Ba尤达GydF4y2Ba突变体，证明了MAPKKK在受精后合子不对称分裂中的作用[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]．一些MPKs也被发现在配子体发育中起作用，如GydF4y2BaAtMPK4GydF4y2Ba，参与男性特异性减数分裂细胞内的细胞板膨胀[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba]， 或者GydF4y2BaAtMPK3GydF4y2Ba和GydF4y2BaATMPK6GydF4y2Ba，在花药和ovule Integument Developmend中冗余的功能[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]早期花粉发育[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]，以及花粉管伸长和受精前引导[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．最近，番茄中有两个MPKs，GydF4y2BaSlMPK7GydF4y2Ba和GydF4y2BaSlMPK20型GydF4y2Ba，分别影响花粉发育的击倒或敲除[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]．GydF4y2BaSlMPK7GydF4y2Ba突变体表现出异常的花粉形成，可能是由于它参与了绒毡层的降解[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]，而GydF4y2BaSlMPK20型GydF4y2Ba通过调节糖和生长素代谢的基因表达来参与减数分裂发育[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

在GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba，一种接近栽培马铃薯的二倍体物种(GydF4y2Ba美国tuberosumGydF4y2Ba），两种Mapkkks被证明可以在女性和男性配子体发育中发挥作用[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]．这些MAPKKKs是最近被称为受精相关激酶(FRKs)的MEKK类的成员，该类在茄科物种中显示了快速的进化和扩展[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]．GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba表达下调基因突变(GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]以及GydF4y2BaScFRK2型GydF4y2Ba过表达突变(GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]导致小水果的生产，严重减少种子套装。MegAgametogenesis和微酰胺发生在雌性配子粒细胞阶段（Mazin B.等，Un Loblish）表现出显影停滞。在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba那GydF4y2Baatmapkkk19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba是他们最接近的orthologs。近年来，角色GydF4y2BaAtMAPKKK20GydF4y2Ba已经开始被发现。GydF4y2BaAtMAPKKK20GydF4y2Ba被证明与钙调汀和钙调蛋白样蛋白相互作用[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]，并且可能参与花粉发育，在花粉中高度表达，作为Duo1 R2R3 MYB转录因子的目标[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]．在GydF4y2Ba芸苔属植物显著GydF4y2Ba那GydF4y2BaBnMAPKKK20GydF4y2Ba和GydF4y2BaBnMAPKKK19GydF4y2Ba被证明是压力调节的[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]．酵母双杂交测定还显示BNMAPKK19与BNMKK8和BNMKK9相互作用，而BNMAPKK20与BNMKK3强烈相互作用，并在较小程度上对BNMKK8和BNMKK9进行较小GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]. 最近，GydF4y2BaAtMAPKKK20GydF4y2Ba通过MKK5-MPK6激酶级联调节脱落酸反应，也参与GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba皮质微管通过两个非互补的途径发挥作用，一个是MKKK20, MKK3和一个未知的MPK;第二种，作为由MKKK20和MPK18组成的非规范MAPK级联，绕过了对MKK中间体的需要。GydF4y2Ba

在这里，我们提供了MAPKKK的表征GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba，Frk家族的第三个成员GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba这是一种亲缘关系GydF4y2Baatmapkkk19,20和21。GydF4y2Ba我们在雄性和女性配子体发育中描述其作用，在哪里GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在配子上发育过程中的主要作用。我们还提供了一个推定的MAPK信令级联，涉及SCFRK3，SCMKK3和SCMPK13在生殖开发中。GydF4y2Ba

植物材料与转化GydF4y2Ba

茄GydF4y2BaBITT。植物（基因型G4，SGydF4y2Ba_12.GydF4y2BaS.GydF4y2Ba_14.GydF4y2Ba自交不亲和等位基因和V22 SGydF4y2Ba_11.GydF4y2BaS.GydF4y2Ba_13.GydF4y2Ba自交不亲和等位基因)来源于GydF4y2BaS. Chacoense Bitt。GydF4y2Ba从NRSP-6美国马铃薯基因库（威斯康星州鲟鱼湾）的PI458314和PI230582和温室生长在漫长的状态下（16小时光/ 8小时黑暗）。对于十字路口，基因型V22用作花粉供体。通过以前描述的农药和愈伤组织再生在G4基因型中产生转基因植物[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba)使用GydF4y2Ba农杆菌突然造影杆菌GydF4y2Ba菌株LBA4404。使用PDONR™/ Zeo作为进入载体和RNAi突变植物的PK7GWIWG2（I）进行DNA克隆。GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba作为目标向量。RNAi表达在CaMV35S启动子的控制下[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]．在适当抗生素的体外选择后，选择20种独立植物进行进一步分析。通过气孔防护细胞叶片数鉴定多倍植物并丢弃。使用Moloney鼠白血病病毒逆转录酶（Invitrogen）的半定量RT-PCR逆转录酶（Invitrogen）与来自雄蕊的2.5μg总RNA和从6mm生长的芽和野生型和每个突变体的胚珠中提取的胚珠。所有用于PCR的引物和每个基因的循环次数都列于附加文件中GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1。GydF4y2Ba

RNA表达与原位杂交GydF4y2Ba

用TrizoL™试剂（Invitrogen）提取来自不同组织（叶，茎，根，瓣，花瓣，卵巢，样式和芽）的RNA。如前所述进行RT-PCR [GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]．原位杂交在6毫米花蕾上进行。如Lantin等人所述制备8μm的组织切片。（1999）[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]用VistaVision组织键显微镜载玻片（VWR）。从600个细胞中合成了正、反义RNA探针 英国石油公司GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba包含可变c端结构域的PCR扩增子(引物见附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1）使用Digoxigenin-11-UTP具有T3（读取探针）和T7（用于反义探针）RNA聚合酶（Roche）。显微镜载玻片与对应于比率浓度的最佳信号的50 ng感测或反义RNA探针杂交。在室温下使探针杂交过夜，同时在37℃下进行抗挖掘抗体的检测。使用NBT / BCIP溶液（Roche）在室温下进行组织截面染色。GydF4y2Ba

胚珠清除和显微镜GydF4y2Ba

胚珠从3到8 从子房中提取mm芽和成熟花，如前所述固定和清除[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]. 使用蔡司Axio成像仪M1显微镜和蔡司Axiocam HRc相机，通过差分干涉对比显微镜观察清除的胚珠。GydF4y2Ba

花粉发育和活力分析GydF4y2Ba

通过使用Hoechst 33342核污染（Nucblue®VIVEDProbes®试剂; Life Technologies）来研究微孔开发。使用蓝色/青色过滤器以及1％aceTocarmine的紫外线波长（358nm）在紫外线波长（358nm）下观察在紫外波长（358nm）下观察到花粉颗粒。如前所述，还通过荧光素二乙酸酯（FDA）染色来分析花粉活力。对于花粉活力测试，使用了从六种不同的花粉中使用花粉的三次重复。在Zeiss Axio Imager M1显微镜上用Zeiss Axiocam HRC相机进行观察。对于SEM，用JEOL JSM-7400F高分辨率现场发射扫描电子显微镜直接观察到新鲜成熟花粉晶粒，延伸真空模式。GydF4y2Ba

mkks和mpks检索和比赛GydF4y2Ba

从De Novo胚珠和花粉管转录组中检索花粉和表达的MKKS和MPKsGydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba（转录组鸟枪装配，基因库加入：GDZW00000000。蛋白质激酶结构域的氨基酸序列GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba10 MKKS和20 MPKS用于筛选GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba转录组。爆炸（TBLASTN）算法用于比较GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba序列对抗GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba数据库。然后将匹配的转录物与NCBI数据库进行比较，以确保其对应于真正的MKK或MPK。由于大多数转录物缺乏完整的5'或3'片段，因此使用连接酶介导的CDNA末端（RLM族）（Generacer试剂盒，寿命技术）获得全长RNA。GydF4y2Ba

定向酵母-两种杂交测定GydF4y2Ba

将ScFRK3和ScMPKs克隆到含有结合域(BD)的pGBKT7载体中，将MKKs克隆到含有激活域(AD)的pGADT7载体中(Clontech)。在Y2H Gold和Y187酵母株中分别引入单饵(ScFRK3或ScMKK3)和猎物(全部MKKs或全部MPKs)。饵料和猎物在SD(−)Trp和SD(−)Leu培养基中生长，混合在2X YPAD中，30°C慢摇培养16 h。每次交配后，将1 ~ 2微升(μL)储存在选择性培养基上([SD(−)Leu(−)Trp];[SD(−)低浓缩铀(−)Trp(−)他(−)正面(+)Aureobasidin);[SD(−)Leu(−)Trp(−)His(−)Ade (+)Aureobasidin A (+) 50mm 3AT])， 30°C孵育3 - 6天。酵母两杂交试验在三次重复中进行。GydF4y2Ba

亚细胞定位和双分子荧光互补分析GydF4y2Ba

对于亚细胞定位，GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba那GydF4y2BaSCMKK3GydF4y2Ba和GydF4y2BaScMPK13GydF4y2Ba使用PMDC83质粒的Gateway®技术融合ORF在绿色荧光蛋白（GFP）的N-末端，如目的地向量[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba]．对于BIFC，PUC-SPYNE和PUC-SPYCE目的地载体用于使黄色荧光蛋白（YFP）的N（PUC-SPYNE）或YFP的C（PUC-SPYCE）部分的一部分熔化到C-Terminus End其中一种蛋白质[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba]．使用抗体PDS-1000 / HE颗粒递送系统（Bio-rad），通过DNA涂覆的微粒轰击瞬时表达标记的蛋白质。洋葱表皮细胞（〜1厘米GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba）从9cm的距离和1100psi的压力下轰击1.0μm金颗粒。对于亚细胞定位测定，以及BIFC相互作用，所有实验均以每次重复至少10个荧光细胞的三倍一次进行，以验证结果。GydF4y2Ba

SCFRK3，梅克克与...有关GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaMapkkk19,20和21GydF4y2Ba

从合并后的GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba胚珠和花粉管转录组，其中21种不同的百慕克与其中六个（SCFRK1-6）属于FRK类[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]．其中，ScFRK3和4是最接近的同源物GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2BaMAPKK19,20和21（图GydF4y2Ba1GydF4y2Baa），共享43至75％的氨基酸成对与那些人GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba．FRK类激酶最近被证明在茄科植物中有很大的扩展[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]．在完全表征的溶于溶于索拉甘蓝基因组中，如GydF4y2BaSolanum Tuberosum.GydF4y2Ba和GydF4y2BaSolanum lycopersicum.GydF4y2Ba，他们的总数（分别为15和17个，分别）占整个百慕大的40％以上。至于FRK类的其他成员，SCFRK3是一个小型MEKK，其具有352个氨基酸序列（39kD），主要由蛋白激酶结构域（3至260）和短的C末端结构域（从261-352）组成．与scfrk1不同[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]以及FRK类的其他一些成员[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba它预测为核蛋白，SCFRK3没有含有单级或二分核定位信号。尽管如此，即使链接到GFP荧光标记物，仍然在细胞质和核中发现SCFRK3（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

ScFRK3型GydF4y2Ba表达模式表明在生殖发育中的作用GydF4y2Ba

最近的研究表明GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在叶子，茎，根等叶状组织中表达，以及花蕾[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]，表明其在生殖发育中的作用类似于前面描述的两个FRK类成员，GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba和GydF4y2BaScFRK2型GydF4y2Ba[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]．精确地确定其中组织和发育阶段GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba半定量rt - pcr分别在3 ~ 8mm长度的花蕾、开花期的花和授粉后1 ~ 3天的果实上进行。如图1所示。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种，GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在幼芽(3毫米长)的生殖组织中表达。而GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在卵巢中的表达在所有阶段保持不变，鼻甲表达在7-8毫米的芽中增加（对应于开发前的1天; 1 dBA）。雄蕊mRNA表达是总体上最强的，陡峭的增加5-6毫米芽，直到波纹前一天稳定。在原始阶段，雄蕊表达急剧下降，而透过官方表达仍然很高。GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba从DAP的1 ~ 3dap，在幼果中也检测到mRNA的表达。GydF4y2Ba

精细定义GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在发育花蕾上进行表达模式，原位杂交。如图1所示。GydF4y2Ba2GydF4y2BaB，GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在6毫米整个花蕾中表达，特别是在胚珠，花粉和绦虫中。GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2BaMRNA在幼花粉中检测到，特别是在四面体中（图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaD和F）和PMI前的幼儿孢子（图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaG）。在卵巢里面，GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba与胎盘和果皮相比，在胚珠中高表达(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bai），但表达仍低于花粉。GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在整数和年轻胚囊中观察到姿势表达。如图1所示。GydF4y2Ba2GydF4y2Bak和l，GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2BaMRNA在MMC级的胚珠中检测到（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bak)以及FG的第一次有丝分裂期间(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bal）。一起携带，GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba表达谱很强地表明在配子体发育中的作用，特别是在年轻的发展阶段。GydF4y2Ba

ScFRK3型GydF4y2BaRNAi植物显示生殖缺陷GydF4y2Ba

阐明的功能GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba基因，产生RNAi突变植物并测试下调GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2BamRNA表达水平。在雄蕊和从6mm生长芽中提取的雄蕊和胚珠进行RT-PCR（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种）。三种不同的线条（GydF4y2BaIFRK3-1GydF4y2Ba那GydF4y2BaIFRK3-2GydF4y2Ba和GydF4y2BaIFRK3-3GydF4y2Ba)显示显著下降GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在开发期间的花药和胚珠中的mRNA水平进行进一步调查。由于成对核苷酸序列同一性GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba及其五个GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba近亲(无花果。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）测定40％至69％，进行半定量RT-PCR分析以确定其他五个的表达GydF4y2BaSCFRK.GydF4y2Ba会员可能受到影响GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2BaRNAI构造。如图1所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa, RNA表达水平从其他5个GydF4y2BaSCFRK公司GydF4y2Ba在所有三个中保持不变GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2BaRNAi突变体检测，表明繁殖表型观察到GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2BaRNAi线路与下调的线条相关联GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba仅限基因。他们三个GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba然后rnai线与兼容的交叉授粉GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba果实大小和结实率分析。第一行GydF4y2BafrGydF4y2Ba3-1，I.GydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba–2和iGydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba-3显示严重缩小的果实大小(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba三种干涉线的结实率也大幅降低，平均为28 ~ 87粒，而野生型为155粒。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac和d)。GydF4y2Ba

胚珠发育受到影响GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2BaRNAi突变体GydF4y2Ba

自从GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在生殖发育早期检测到表达（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)和结实率明显受RNAi影响GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba突变体行(无花果。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC和D），我们在清除胚珠上进行显微镜观察杂草型发育。至于其他溶于索甘露物种，GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba有一个薄粒型胚胎囊。为了确定卵子在RNAi突变线中大部分受到影响的阶段，分析来自WT和突变花芽（3至8mm长度）的胚珠。结果总结在表格中GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．微观分析〜3-4 mm wt芽显示MMC阶段的高比例胚珠（红色），胚珠的低比例（黄白色）开始了减数分裂。相反，在〜4-5毫米的芽中大多数胚珠（红色）通过了减数分裂阶段（功能性兆孔）并开始有丝分裂。在三个有丝分裂之后，在〜6-7毫升芽中观察到八个核ES（FG5-FG6）。中央细胞karyogamy，细胞化和脱叠细胞变性是ES成熟（FG7）的最终步骤，通常在〜7-8毫米的芽中发生，大约1天的前波纹。这三个步骤被分组在一起，由表中的垫（用于成熟）表示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．来自三个的胚珠GydF4y2BaiFRK3GydF4y2Ba突变体开始正常发育，但与WT不同的是，大多数ES在功能大孢子期(FM)之后没有进一步发展(红色隔间，表)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.一小部分ES表现为发育迟缓，可经历一次、两次或三次有丝分裂。数字GydF4y2Ba4.GydF4y2BaA显示正常ES（黑色），退化的ES（深灰色）和ES的比例在其中一项有丝分裂阶段（浅灰色）中停止GydF4y2BaiFRK3GydF4y2Ba突变体和WT花在花期。在成熟花中，93%的WT ES正常，而只有52、46和22%的iGydF4y2BafrGydF4y2Ba3-1，I.GydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba–2和iGydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba-3 es是正常的。相比之下，只有6％的WT es完全退化，而I中的43,45％和69％GydF4y2BafrGydF4y2Ba3-1，I.GydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba–2和iGydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba3,分别。典型表型GydF4y2BaiFRK3GydF4y2Ba突变体如​​图所示。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba（b-i）。图形GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba表明调频发展不受影响GydF4y2BaiFRK3GydF4y2Ba突变体(无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab和c），与第一有丝分裂步骤或fg2不同（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad和e），导致成熟花的雌性配子细胞的退化（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba外:我)。这些结果表明GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba参与女性配子化的发展。GydF4y2Ba

花粉发育和可行性也受到影响GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2BaRNAi线路GydF4y2Ba

自从GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在雄蕊中检测到mRNAs，并对花粉生活力进行了分析GydF4y2BaiFRK3GydF4y2Ba突变体。来自wt的花粉，我GydF4y2BafrGydF4y2Ba3-1，I.GydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba–2和iGydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba-3成熟的花朵染色1％的乙酰律溶液，并计数可行的和不可行的花粉晶粒。如图所示。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA，96％的WT花粉晶粒是可行的，而I的55,60和13％相比GydF4y2BafrGydF4y2Ba3-1，I.GydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba–2和iGydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba分别为3。用乙酰胭脂染色法，活花粉粒呈圆形，均匀染成粉红色(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA，I-IV），而死花粉晶粒较小，半透明，大多数变形。为了更准确，荧光素二乙酸酯（FDA）染色也用于分析WT和的Pollen活力GydF4y2BaiFRK3GydF4y2Ba突变体(无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa、 第五至八节）。与野生型相比，大约一半的花粉粒被认为是死的，没有显示FDA荧光GydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba1,我GydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba-2突变体。为我GydF4y2BaFRK3GydF4y2Ba–3，只有6%的花粉粒显示FDA荧光，被认为是活的。目的：分析花粉缺损的超微结构GydF4y2BaiFRK3GydF4y2Ba植物线在更多细节中，通过扫描电子显微镜观察花粉晶粒。一般，GydF4y2Ba茄GydF4y2Ba花粉粒由三个沿花粉轴纵向均匀分布的孔组成。然而,GydF4y2BaiFRK3GydF4y2Ba突变体产生了许多枯萎和塌陷的花粉颗粒（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一、ix-xii)。在胚珠发育方面，花粉活力表现型也比较严重GydF4y2BaIFRK3-3GydF4y2Ba线。GydF4y2Ba

以确定花粉发育究竟何时受到影响GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba植物中断，花粉活力测定和DNA染色在显影WT和突变花粉中进行。WT和WT和WT的比较GydF4y2BaIFRK3-3GydF4y2Ba植物如图所示。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab.在PMC期，来自WT和GydF4y2BaIFRK3-3GydF4y2Ba植物完全可行，如乙酰臂染色所观察到的（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab, i-iv)。在小孢子四分体期，WT和WT均有花粉GydF4y2BaIFRK3-3GydF4y2Ba植物完全受到的减数分裂（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab, v-viii)，包括小孢子释放(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab，ix-xii）。随着微微孢子的增长，PMI通常在WT中发生，并产生两种细胞花粉晶粒，植物植物和生殖细胞（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab、 十三和十四）。与野生型花粉不同的是，花粉母细胞中大多数花粉粒没有PMIGydF4y2BaIFRK3-3GydF4y2Ba突变体已经开始崩溃和死亡（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab，xv-xvi）。WT成熟花粉颗粒（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaB，XVII和XVIII）随着acetocarmine染色观察，而花粉谷物来自GydF4y2BaIFRK3-3GydF4y2Ba突变体大多死（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa, iv和b, xix和xx)。能通过PMI的剩余花粉粒很少，WT花粉成功生长成熟。这些结果表明GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba不仅涉及在女性配子上，还涉及到男性方面，在花粉发育中。GydF4y2Ba

ScFRK3与ScMKK3相互作用GydF4y2Ba

在Mapkkk家族中，SCFRK3被归类为Mekk亚家族激酶，因此预期其参与规范MAPK信号通路。为了将三层激酶模块与SCFRK3重构为上游激酶，用SCMKKS和SCMPK进行酵母 - 两个杂合（Y2H）测定GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba组合胚珠和花粉转录组。使用10个MKK和20 MPKGydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba筛选GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba转录组，检索5个SCMKKS和16个SCMPK（参见附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S2）。两者的系统发育分析GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2BaMKKs(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S1)和MPKs(附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：执行图S2）以分配最接近的ortholog（s）GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba和GydF4y2BaSolanum lycopersicum.GydF4y2Ba．组合花粉和胚珠转录组中表达的所有SCMPK在番茄中有透明的直晶，而其他三个（ISOTIGS 27,038,27,937和36,598）不能明确分配（附加档案GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S2和附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：图S2）。GydF4y2Ba

然后使用与结合结构域（BD）融合的SCFRK3进行指导Y2H测定作为诱饵和来自我们合并的花粉和胚珠转录组的所有SCMKks融合到活化结构域（Ad）中作为捕发剂。由于SCFRK3的完整版本与所有拍摄的相互作用，包括负对照（PGADT7，未示出），所以进行三种不同版本的SCFRK3-PGBKT7构建体（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa） 是的。N-末端结构（ScFRK3 Npart）包含氨基酸1至176，中间部分（ScFRK3 Mpart）包含氨基酸89至264，而ScFRK3 Cpart包含氨基酸177至352。虽然没有单独的ScFRK3结构与空载体（pGADT7）相互作用，但ScFRK3 Cpart仅与isotig15708相互作用，它被重新命名为ScMKK3，是最接近GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaMKK3（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab）。这种互动是独家的，因为只有SCFRK3-CPART与SCMKK3互动，而SCFRK3-NPART和-MPART没有与任何SCMK互动。使用BIFC测定，还在洋葱表皮细胞体内进行SCFRK3-SCMKK3相互作用。当SCFRK3-NYFP和SCMKK3-CYFP在洋葱细胞中表达时，在细胞核内和细胞质内观察到荧光（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC，I和III）。而且，表达模式GydF4y2BaSCMKK3GydF4y2Ba通过使用特异性引物进行半定量RT-PCR验证，发现以体细胞和生殖组织（风格，卵巢，雄蕊和芽）表达（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:图S3A)，重叠GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba表达式模式。至于SCFRK3，单独的SCMKK3-GFP也局部化在细胞核和细胞质内（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：图S3B、i和ii）。总之，这些结果表明ScFRK3在细胞核和细胞质中与ScMKK3相互作用。GydF4y2Ba

SCMKK3与SCMPK13交互GydF4y2Ba

为了鉴定可以在SCMKK3下游作用的MPK（S）并在SCFRK3下游形成可能的信号传导级联，使用SCMKK3融合到AD作为诱饵的SCMK3进行指导的Y2H测定，并且来自我们合并的花粉和胚珠转录组的所有16个SCMPKS融合到BD作为猎物[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]．由于SCMKK3的完整版本与所有SCMPKS猎物以及负控制向量（PGADT7，空向量，未示出）进行交互，这是三个新版本GydF4y2BaSCMKK3GydF4y2Ba被生产。ScMKK3结构如图所示。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba一种。在16个SCMPK中，没有与SCMKK3-N和-C部件互动，而只有一个与SCMKK3-MPART互动，那么GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Baisotig37333（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bab）。其他15个SCMPK，也没有负面控制，在-LTHA / + ABA选择性介质上增长（除了ISOTIG37161之外未显示，因为其他14个也是负面的）。与...相比GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2BaMPKs, isotig37333最接近的同源物显然是GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2BaMPK13（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:图S2)，因此，isotig37333被重新命名为ScMPK13GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba命名法。ScMKK3和ScMPK13之间的Y2H相互作用也通过在洋葱表皮细胞中使用BiFC的体内互补实验得到证实（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaC）。在COMKK3-CYFP和SCMPK13-NYFP的细胞核和细胞质中观察到黄色荧光。喜欢大多数MPK [GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba[SCMPK13-GFP在细胞核中局部化（细胞质（附加文件）GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：图S3 III）。因此，上述结果强烈建议SCMKK3和SCMPK13在SCFRK3下游的潜在信令级联中相互作用。正如预期的那样，RT-PCR分析显示GydF4y2BaScMPK13GydF4y2Ba在芽和其他生殖组织中也有表达（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:图S3A)，重叠GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba和GydF4y2BaSCMKK3GydF4y2Ba表达式模式，支持SCFRK3-SCMKK3-SCMPK13形成一个可能的三层MAPK级联的假设。GydF4y2Ba

植物基因组是真核生物中最大的MAPK家族，在各种生物过程中发挥着重要作用。在这里，我们介绍GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba,一个GydF4y2Ba茄GydF4y2Ba梅克家族中的梅克。GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba是FRK类（受精相关激酶）的一部分，其中另外两个成员以前已经表现出[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]. FRK类是MEKK亚科中的一个单系群，出现在GydF4y2BaAgeniSpermae.GydF4y2Ba并且在很大程度上扩大了GydF4y2BaSolanaceae.GydF4y2Ba家庭 [GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]．FRK类可以进一步细分为4组。相比GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba（GydF4y2BaBrassicaceae.GydF4y2Ba)以及GydF4y2BaG. Raimondii.GydF4y2Ba（GydF4y2Ba麦芽糖素GydF4y2Ba），分别有三个和两个FRK类激酶，GydF4y2Ba美国tuberosumGydF4y2Ba和GydF4y2Ba美国lycopersicumGydF4y2Ba（GydF4y2BaSolanaceae.GydF4y2Ba）分别拥有15和17名成员。此外，在其中发现的四个FRK组GydF4y2BaSolanaceae.GydF4y2Ba那GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba和GydF4y2BaG. Raimondii.GydF4y2Ba只有一个港口，第4组，双子叶中最古老的组[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]．表征前两辆发器的高度特异性组织表达和观察到的表型GydF4y2BaScFRK2型GydF4y2Ba过度表达植物线[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba， RNAi下调GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba线[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba[表明，这些激酶在生殖组织中起重要作用，表明FRK类的其他成员也可能在生殖发展中发挥作用。目前的分析GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba基因支持这一假设。至于GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba和GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在显影胚囊和雄蕊中表达，这与雄性和雌性配子体中观察到的发育缺陷一致GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba下调的RNAi突变体。但是，与GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba和GydF4y2BaScFRK2型GydF4y2Ba那GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在叶片中的表达水平与生殖组织中的表达水平相似，而在表现出严重生殖缺陷的RNAi株系中没有观察到明显的叶片表型。因为没有一个突变体能被其他FRK拯救，GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba显然不是基因冗余。考虑到氨基酸之间的两重性GydF4y2BaScFRK1 3GydF4y2Ba范围从32％到42％（来自ORF的42％至57％），没有令人惊讶的是，没有任何RNA干扰GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba，如图所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba．此外,虽然GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba至GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba在雄性和雌性生殖组织中表达，它们各自的mRNA表达不遵循相同的模式。GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba在胚珠和花粉发育期间，在整数和兆多孔母细胞（MMC）和花粉母细胞（PMC）中，在胚珠和花粉发育期间非常早期检测mRNA表达。在花序前，GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba卵巢的mRNA水平增加，达到开花的最大值，是强烈的积累GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba在珠被、助细胞和卵细胞中均可观察到mRNAs。在没有授粉的情况下，GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2BamRNA水平缓慢下降，在花后72 h仍处于高位。传粉和受精对植物生长有显著影响GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba在授粉后，mRNA积累已经陡峭地减少了12小时，并且几乎完全没有GydF4y2BaScFRK1型GydF4y2Ba受精时的mrna [GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]．相反，GydF4y2BaScFRK2型GydF4y2Ba所有组织中的mRNA水平非常弱，在成熟的卵巢中几乎不可检测到，在施肥后它们会显着增加[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]．GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba然而，MRNA在显影雄蕊中比在显影胚珠中更丰富。GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在5-6mm的芽中的胚珠中的RNA水平略高，并且在开孔处减少以达到未检测的表达（在RT-PCR），而表达仍然在雄蕊中检测。授粉后仍然检测到弱表达和发展果实。原位杂交证实了RT-PCR结果，表明了这一点GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在开发花粉（四分色谱和微孔）以及花药绦虫中表达，并且在较低水平下也以年轻的胚珠表达。GydF4y2Ba

与之前描述的其他两种FRKs不同，ScFRK3既存在于细胞质中，也存在于细胞核中，在那里它可能启动了信号级联。酵母的两个杂交筛选显示只有ScFRK3(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)，而没有ScFRK1或ScFRK2(数据未显示)可以与ScMKK3相互作用。虽然完整的ScFRK3序列与所有的祷物和阴性对照相互作用，但在三个部分的分段显示只有ScFRK3 c端部分与ScMKK3相互作用(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba). 使用Y2H和BiFC分析，ATMKK20和AtMKK3之间的相互作用表明，ATMKK20 C末端部分包含一个能够与AtMKK3强烈相互作用的基序，支持ScFRK3和ScMKK3之间的相互作用GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba]. 此外，对ATMKK20 C端部分进行精细解剖，精确定位到ATMKK19和21以及ScFRK3和4（附加文件）中也存在的较小片段GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba：图S4）。该段包括典型的DEF哺乳动物MAP激酶对接网站（用于ERK，FXFP的对接网站），强烈支持其与SCMKK3的互动。这种DEF结构域通常具有位于6至20个氨基酸C末端的FXF [P / D / e）]基序，其与[S / T] -P磷酸感受态位点进行[GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba]．从GydF4y2BaS. Chacoense.GydF4y2Ba花粉和胚珠转录组，只有一个，Isotig37333重命名SCMPK13，最接近GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba与SCMKK3相互作用的ATMPK13（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.两个都GydF4y2BaSCMKK3GydF4y2Ba和GydF4y2BaScMPK13GydF4y2Ba基因也与之相同的组织中GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba（比较图。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa和附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:图S3A)。此外，BiFC分析显示ScFRK3与ScMKK3共定位(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac）和SCMPK13的SCMKK3（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bac)在细胞质和细胞核中，提示可能存在ScFRK3特异的信号级联，涉及ScMKK3和ScMPK13。GydF4y2Ba

在GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba，已经鉴定了几种突变体用于其在配子体发育中的缺陷，特别是在雄性和雌性有丝分裂步骤中。例如，与微管和细胞因子相关的一些蛋白质，如雄性配子体中的TiO，对雄性和雌性有丝分裂是至关重要的[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]．一个例外是涉及PMI的潜在信号级联，它以HINKEL和TETRASPORE作为受体/传感器开始，将信号传递到MAPK级联(ANP1-3 - MKK6 - MPK4)，以磷酸化MAP65和其他参与微管组织的map [GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]．在雌性侧，尽管所有突变体在FG1阶段受阻，但尚未发现潜在的信号级联。例如，参与微管动力学和FG有丝分裂的驱动蛋白AtKin-1，也在细胞器、囊泡和染色体的长距离运输中发挥作用。然而，还没有发现有相互作用的伙伴[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．在ES成熟中，CKI1组氨酸激酶已被证明在MYB119转录因子的上游作用，表达水平较低GydF4y2BaCKI.GydF4y2Ba突变体[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba]．同样，在这一途径中还没有发现中间蛋白。GydF4y2Ba

最近，来自D组SLMPK20的番茄MAPK显示在减数分裂后调节花粉发育，对母体侧没有影响[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]．另一个番茄MAPK，SLMPK7，正交到ATMPK4，分类为SCMPK13，如SCMPK13，被称为Tapetum和早期花粉发育中的演员[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]．这里，我们展示了GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在配子体发育过程中，一种明显作用于雄性和雌性配子体发育的mapkk3，它只与ScMKK3相互作用。我们的蛋白质相互作用结果表明，ScFRK3-ScMKK3-ScMPK13可能是植物配子体发育过程中一个真正的三级级联。两种下游激酶的遗传分析GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba应该揭示这个新级联的全部作用。GydF4y2Ba

MAPKKK SCFKR3的本研究证实了SCFRK系列在生殖发展中的含义。这GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2Ba在花药和卵巢发育过程中表现出强烈的表达，特别是在雄性和雌性的配子体中，因此GydF4y2BaScFRK3型GydF4y2BaRNAi突变植物在繁殖中显示出严重的缺陷，胚胎囊和花粉发育在有丝分裂I中被捕。蛋白质 - 蛋白质相互作用测定还提出了一个三层MAPK级联，SCFRK3-SCMKK3-SCMPK13。该研究强化了MAPK激酶级联在植物生殖组织开发中的重要作用。GydF4y2Ba

BCIP:GydF4y2Ba

5-溴-4-氯-3-吲哚基 - 磷酸盐GydF4y2Ba

BIFC：GydF4y2Ba

双分子荧光互补GydF4y2Ba

迪拜国际资本:GydF4y2Ba

差动干扰对比GydF4y2Ba

挖：GydF4y2Ba

地高辛GydF4y2Ba

食品药品监督管理局:GydF4y2Ba

荧光素二酸GydF4y2Ba

FG:GydF4y2Ba

雌配子体GydF4y2Ba

调频：GydF4y2Ba

功能大孢子GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白:GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白GydF4y2Ba

KD：GydF4y2Ba

千达尔顿GydF4y2Ba

地图：GydF4y2Ba

微管相关蛋白GydF4y2Ba

地图，MPK：GydF4y2Ba

促丝糖型活化蛋白激酶GydF4y2Ba

Mapkk，MKK，MEK：GydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶GydF4y2Ba

MAPKKK、MKKK MEKK:GydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶GydF4y2Ba

MMC:GydF4y2Ba

大孢子母细胞GydF4y2Ba

兆瓦:GydF4y2Ba

分子量GydF4y2Ba

电视台:GydF4y2Ba

硝基蓝色四唑唑唑GydF4y2Ba

NLS：GydF4y2Ba

核定位信号GydF4y2Ba

PMC:GydF4y2Ba

花粉母细胞GydF4y2Ba

采购经理指数：GydF4y2Ba

花粉丝分裂I.GydF4y2Ba

PMII:GydF4y2Ba

花粉丝分裂IIGydF4y2Ba

RLM-RACE:GydF4y2Ba

RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增GydF4y2Ba

RNA:GydF4y2Ba

核糖核酸GydF4y2Ba

RNAi:GydF4y2Ba

RNA干扰GydF4y2Ba

RT-PCR：GydF4y2Ba

逆转录聚合酶链反应GydF4y2Ba

SCFRK3：GydF4y2Ba

茄GydF4y2Ba施肥相关激酶3GydF4y2Ba

扫描电镜:GydF4y2Ba

扫描电子显微镜GydF4y2Ba

Y2H:GydF4y2Ba

Yeast-two混合GydF4y2Ba

yfp：GydF4y2Ba

黄色荧光蛋白GydF4y2Ba

YPAD公司：GydF4y2Ba

酵母提取物，蛋白胨，腺嘌呤GydF4y2Ba

D.P.M.承认在功能基因组学和植物信号转导中的Universitédemontréal研究椅的支持。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

加拿大自然科学与工程研究委员会支持资金（RGPIN-2014-03883）。光盘。是来自加拿大自然科学和工程研究委员会的博士奖学金的受援人员，来自LeFondsQuébécoisde la Recherche Sur La Nature et Les技术（FRQNT）。GydF4y2Ba

可用性数据和材料GydF4y2Ba

Contigs组件可以从NCBI霰弹枪装配序列下载：基因组（WGS）和转录组[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba]在以下URL下：GydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/traces/wgs/?val=gdzx01GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

1. Caroline Daigle和Benjamin Mazin同样为这项工作贡献。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 生物研究所végétale, Département生物科学，Université de Montréal, 4101 rue Sherbrooke Est, Montréal, QC，加拿大GydF4y2Ba

   Caroline Daigle，Benjamin Mazin＆Daniel P. MattonGydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

CD, BM和DPM构思研究，解读结果并撰写稿件。CD和BM进行了实验工作。DPM监督了这个项目，并对图形编辑做出了贡献。所有作者阅读并批准最终稿件。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba丹尼尔。p . MattonGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba)，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的信任，提供知识共享许可的链接，并说明是否有更改。“创作共用公共领域”豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。GydF4y2Ba

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