抑制als的配子杀菌剂甲基苯磺隆是如何诱导油菜雄性不育的gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制除草剂甲基苯磺隆(TBM)是一种高效的杀配子剂，可导致油菜(gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2Bal)成为雄性不育和异交。为了找出TBM治疗导致男性不育的原因，我们采用细胞学、生理学和转录组学的方法进行了综合研究。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在暴露于TBM的油菜植物中，在暴露于TBM的油菜植物中观察到一些临时症状，包括幼叶的变色和短暂停止的Raceme伸长率，以每株植物为1μg。在花药中的幼叶和塑体中的叶绿体都变形。TBM还减少了叶片光合速率和叶绿素，可溶性糖和丙酮酸含量的含量。在处理的植物中的胶质细胞和单核微生孢子均显示出大的自噬液泡，并且组织快速退化。与对照鉴定的200上调和163个下调的TBM治疗中的下调和163个下调差异表达基因的转录组。编码功能上重要的蛋白质的基因，包括葡聚糖肠胃1,3-β-葡糖苷酶A6，Quartet3（QRT3），拟南芥花药7（ATA7），非特异性脂质转移蛋白LTP11和LTP12，组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶ATXR6，通过TBM暴露下调亚硫胺胺香豆酰基酰基转移酶（SCT）和光系统II反应中心蛋白PSBB。上调了编码自噬相关蛋白ATG8A和代谢解毒相关蛋白质的一些重要基因，包括DTX1，DTX6，DTX35，胞质磺基转移酶SOT12和六个谷胱甘肽S-转移酶的六个成员。此外，几种与激素刺激有关的基因，如gydF4y2Ba1-aminocyclopropane-1-carboxylate合酶8gydF4y2Ba（gydF4y2BaACS8gydF4y2Ba), ethylene-responsive因素gydF4y2BaErf1a, erf1, erf71, crf6，gydF4y2Ba和gydF4y2BaRAP2-3gydF4y2Ba，也被上调。其转录调控与花粉壁形成、脂质代谢、叶绿体结构、乙烯生成、细胞周期和组织自噬等功能异常一致。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

结果表明，除了ALS，与脂质代谢，花粉外来形成，光合作用和激素反应相关的代谢途径与TBM诱导的雄性不育相关。结果提供了新的见解磺脲类诱导雄性不育的分子机制。gydF4y2Ba

乙酰乳酸合酶（ALS; EC 4.1.3.18）是亮氨酸的生物合成中的关键酶，其是支链氨基酸（BCAAs），并且可以通过B组的各种除草剂来抑制（根据除草剂来自磺酰脲（Su），咪唑啉酮，三唑基嘧啶，嘧啶基苯甲酸盐和磺酰氨基 - 羰基三唑啉酮家族的抵抗作用委员会分类gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．虽然Als被称为数十种除草剂的常见目标，但Als-抑制剂导致植物毒性的原因仍然非常难以捉摸。已经提出了各种假设，包括BCAA池的耗尽，阻断DNA合成，底物的积聚以及厌氧呼吸的阻断，以及Als抑制除草剂的细胞毒性基于生理性状的机制细胞改变，以及植物和微生物暴露于抑制als抑制除草剂的微生物（由周等，[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba])。不幸的是，als抑制除草剂引起细胞死亡的机制尚未达成共识。gydF4y2Ba

除了Als-抑制剂的除草活性外，Su和咪唑啉酮家族的许多成员，例如呋喃酮 - 甲基（TBM），amidosulfuron和咪唑（IM），鉴定为良好的配方，可诱导完整的雄性不育（ms）在亚致死量施用时许多十字花病种或一些谷物植物[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．该质谱属于化学诱导质谱(CIMS)。在植物育种中，可遗传的MS(核雄性不育和细胞质雄性不育)和CIMS都用于促进杂交种子母系的异交。与可遗传的MS相比，CIMS方法的主要优点是大部分自交系或品种可以作为杂种的亲本，不需要为一个MS系统创建不同的系，即雄性不育系、保持系和恢复系。此外，许多可遗传的MS系统表现出较差的结实率、品质性状和/或抗病性[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]．到目前为止，基于CIMS的繁殖在中国取得了巨大的成功，超过20个商业杂交油菜籽（gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2BaL.）基于CIMS的品种已经注册[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

几个研究所进行了转录组分析，以确定抑制除草剂的植物毒性的原因。Manabe等人，[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba在IM申请和在稍后的阶段参与氨基酸和次级代谢物的生物合成中的其他基因的早期术后鉴定了一些防御和解毒的一些基因，并在后期阶段进行了相互敏感和抗性的比较gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba突变体。使用DNA阵列检测来显示Primisulfuron和Pravulfuron的Su除草剂处理之间的差异gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba属于次生新陈代谢的基因[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．同样，少数几个基因的转录变化可以区分不同的反应gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba和gydF4y2BaB. Napus.gydF4y2Ba与几种密切相关的除草剂[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．对这些除草剂亚致死率(约为建议除草剂剂量的1 - 5%)敏感的植物中发生MS的机制尚不清楚。其他一些研究[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba[咪唑吡喃（IM，IM，属于咪唑啉酮家族），研究了CIMS的机制，例如纯甲磺脲类钠（属于SU家族）的MESULFURON酯钠（IM，属于咪唑啉酮家族）。在这些研究中提出了碳水化合物和脂质代谢，叶绿体和自噬细胞死亡的破坏[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

als抑制除草剂诱导的MS为研究这些除草剂的植物毒性，特别是亚致死剂量的植物毒性提供了一个很好的机会。尽管一些SUs和咪唑啉酮可以引起芸苔属或其他植物的CIMS [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，抑制ALS酶并不是CIMS的保证。一些三唑嘧啶和嘧啶基硫代苯甲酸类除草剂虽然也抑制了ALS酶的活性，但不能引起MS [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．似乎也需要一些其他生物途径对Als抑制配方灭菌的诱导毫安。本研究的目的是探讨油菜反应对游胶TBM暴露的细胞学，生理和转录变化。讨论了这些生物反应与MS的可能缔合。这些结果可用于更好地理解通过TBM和其他ALS-抑制剂诱导MS的机制。gydF4y2Ba

植物材料和TBM处理gydF4y2Ba

油菜籽CV的植物。SP2F（TBM易感）在西北A＆F大学（陕西州杨凌，中国）的实验领域生长，植物密度为每平方米15苗。通过含有0.2mg / L（可用成分）TBM（Express TM）和0.2mL / L表面活性剂烷基硫酸钠的含有0.2mg / L（可用成分）TBM（Express TM）和0.2mL / L表面活性剂硫酸钠的工作溶液喷涂叶片植物植物（计算剂量的TBM为每株植物1μg，等于150mg / ha）。手持式高压泵喷雾器用于均匀地润湿叶子。该治疗有三种重复，每种图含有约100株植物。仅使用含有表面活性剂的水喷洒作为阴性对照的另一组植物。一个gydF4y2BaALS.gydF4y2Ba江苏省农业科学院工业作物研究所捐赠的突变体DS3（基因型TBM-R）[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]也用TBM溶液治疗，以比较基因型效果。gydF4y2Ba

细胞学观察gydF4y2Ba

进行化痰的丙氨酸染色以检查微孔和花粉发育阶段[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．根据其发育阶段收集来自TBM处理的植物和对照的叶子和花蕾。段制剂的过程与我们之前的研究中的相同[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

生理性状分析gydF4y2Ba

由于ALS是TBM的主要目标酶，因此在治疗（DAT）后，Als酶的体内活性在成熟的叶片和幼小花蕾（长度≤3mm），如我们以前的研究中[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．学生们gydF4y2BatgydF4y2Ba-test法同时比较3个重复中采集到的相同组织。植物吸收和转运的除草剂对ALS活性的抑制作用通常由体内乙酰乳酸在组织中的积累决定。本方法还涉及除草剂的底物供应或代谢解毒。此外，为了寻找除ALS外受TBM影响的生物途径，我们还确定了更多的生理性状，特别是与TBM叶片变色有关的光合系统。在0、2、4、6 d时，分别测定了5株植株上部成熟叶片的光合速率[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．叶片中叶绿素，丙酮酸酸和可溶性糖的含量和花蕾中的乙烯释放速率在我们之前的研究中进行测定[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

转录组分析gydF4y2Ba

从5 DAT植株和对照植株上分别分离出小孢子母细胞(MMC)至单核小孢子发育阶段对应的小于3 mm的幼芽(长度≤3 mm)。处理组设HS1和HS2，对照组设CK1和CK2。提取总RNA，用我们之前的方法逆转录成cDNA [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．使用上述幼花芽CDNA构建两组Illumina DGE（数字基因表达标签分析）文库。在供应商协议之后，我们在Illumina Hiseq2500平台上进行了单一结束测序。所有读数都在基因表达式Omnibus登录号GSE113681下沉积在NCBI中。经过质量检查和数据过滤器[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，用长度为36nt的获得的清洁读数与gydF4y2Ba芸苔gydF4y2Ba基因指数数据库（Dana-Farber癌症研究所（DFCI），波士顿，MA 02115，美国。URL：gydF4y2Bahttp://compbio.dfci.harvard.edu/tgi.gydF4y2Ba或gydF4y2Baftp://occams.dfci.harvard.edu/pub/bio/tgi/data/gydF4y2Ba)，使用蝴蝶结v2.1.0 (gydF4y2Bahttp://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie2/2.1.0/gydF4y2Ba）.匹配每个unigene的完美读数被归一化为每千碱基外显子模型的转录本每百万映射读(TPM)。筛选低频转录本，筛选出两组样本中显著的DETs [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．对每个DET序列进行BLAST搜索，从NCBI核苷酸收集数据库中获取更多信息。在UniProt数据库中搜索了函数注释(gydF4y2Bahttp://www.uniprot.org/gydF4y2Ba）.一些选定的DETs使用Cluster 3.0 (gydF4y2Bahttp://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htmgydF4y2Ba)，根据其TPM转换的相对表达式值。使用Cytoscape (gydF4y2Bawww.cytoscape.org/gydF4y2Ba）.通过STRING平台(gydF4y2Bahttps://string-db.org/gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

用于基因表达分析的定量实时PCR（QPCR）gydF4y2Ba

qPCR的程序与我们之前的研究相似，只是略有改动[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．使用HiPure Plant RNA Mini Kit (Magen, Guangzhou, China)提取RNA。两个gydF4y2BaALS.gydF4y2Ba位点(gydF4y2BaALS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaALS3gydF4y2Ba)编码具有必要功能的蛋白质gydF4y2BaB. Napus.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba17gydF4y2Ba使用特定引物（附加文件）通过QPCR测试其他16个选定的DET（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：根据相应的cDNA序列设计的表S1）。在Quantstudio 3热循环仪（Thermo Fisher Scientific，CA，USA）上进行PCR测定。gydF4y2Ba

TBM亚致死剂量下油菜籽的形态变化gydF4y2Ba

tbm处理植株的花药萎缩，只含有变形的死花粉粒，没有乙酰胭脂红染色(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.除MS表型外，TBM对油菜籽也有一定的形态影响，包括在最初几天茎的伸长暂时性抑制和幼叶的褪色，表明TBM对细胞生长、叶绿体结构和/或类黄酮生物合成具有植物毒性作用。5 mL 0.2 mg/L TBM处理没有降低成熟株高，但导致开花时间推迟1 ~ 2天，总状花序的伸长有较短的延迟。为抵消花期三周的代谢解毒作用，采用高剂量TBM暴露延长花药的杀配子作用。因此，一些副作用，如在上部叶片变色(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)和花青素的沉积(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaG)处理后一周，在处理植株中观察。耐tbm基因型TBM-R没有表现出这些症状，在剂量治疗下MS表型也没有(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）。gydF4y2Ba

TBM诱导MS的细胞学观察gydF4y2Ba

tbm处理植株的小孢子和花粉发育的各个阶段，绒毡层细胞、小孢子细胞和小孢子均有明显缺陷，而对照植株则没有。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba模拟)。正常绒毡层细胞和小孢子含有丰富的细胞器(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba模拟)。然而，在MMC减数分裂、四分体形成和小孢子释放阶段，TBM处理的绒毡层细胞具有比对照大得多的液泡。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae，f）。在胶质细胞的放大和液泡的膨胀之后，Tapetal细胞开始降解（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaF）。与对照相比，四胞孢子不规则地形状（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaF）。MMC和Tapetal细胞均显示出枯萎的细胞核和细胞质留下的更多空间（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba然后，在单核小孢子阶段，绒毡层和单核小孢子迅速分解，在处理后的植株小孢子中形成了大的液泡或空腔(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bag).小孢子不能变圆(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba随着绒毡层的消失，小孢子最终被降解。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bah），除了剩下的小孢子群之外，花药时刻变空。gydF4y2Ba

TEM观察显示TBM治疗中更明显的缺陷。这里，描述了一些明显的异常。在微孔阶段的中间，普通的胶束细胞被许多elioplasts和绦虫拥挤（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba(i)，但经tbm处理的植物绒毡层的结构非常模糊，没有弹力质体和绒毡体等细胞器(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba米)。在单核小孢子期，绒毡层细胞开始退化，染色变浅。(无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bam）。在TBM处理的植物中，微孔细胞质被许多自噬液泡降解，产生不规则和中空腔（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ban）。微孔墙体开发未进行，并且外部表现出比对照的更差的结构分化（图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba这些结果表明，tbm处理的植物中存在异常的脂质代谢和转运。gydF4y2Ba

进一步的细胞学观察发现，在减数分裂过程中，MMC分裂成四分体，被厚厚的胼胝质层包裹。四分体小孢子和胼胝质层畸形。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab），表明细胞结构中的异常并调用沉积和/或溶解。此外，在单核微孔的后期，正常植物变为双核花粉，并且TBM处理的植物的核逐渐消失，并且不能通过UNI-核微孔阶段结束来满足微孔丝分裂（图．gydF4y2Ba4gydF4y2BaD，F），表明TBM在微孔有丝分裂之前具有更大的早期效果。为了确认TBM工作的关键阶段，当花开始打开时，我们推迟了在正常油菜厂上的TBM喷涂。主要的Raceme上不同尺寸的花蕾由螺纹或彩笔表示。在经过治疗的植物上长于3.5毫米的花蕾将保持肥沃的阶段，并且在一周之后，随后的花朵，其初始尺寸长3毫米，其特性开发是在暴露于TBM的后期微孔的阶段。，被转化为雄性无菌状态。该观察结果还表明TBM在微孔有丝分裂之前抑制了微孔有丝分裂前的微生物发生过程，因为氨基核呋喃做了[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

TBM处理对叶绿体结构、光合作用和能量代谢的影响gydF4y2Ba

要知道叶片变色的症状是否会影响光合作用能力，我们在花药和叶子中检测到体液和叶绿体结构。正常的叶绿体膨胀，充满了麦拉拉和囊囊膜（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba相比之下，tbm处理后的叶绿体未发育，基粒较薄(Fig. a, b)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad）。这些结果表明，TBM处理的植物可能具有降低的光合速率。TBM处理植物的表皮细胞中的叶绿体丧失了囊体膜和麦拉那堆（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bae). TBM暴露也破坏了绒毡层弹力质体(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baf），并且绦虫很少形成，在花粉涂层组分（例如由这些翅膀细胞器产生的孢子醇蛋白）中的异常。gydF4y2Ba

0.2mg / L Tbm曝光明显抑制了两种叶子和花芽中的体内Als活性（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa），但暴露后，花蕾的Als活性比成熟的叶子在成熟的叶子中减少，因为Als酶在这种快速生长的组织如花蕾中更活跃。该结果证实，油菜籽对TBM的亚致死率非常敏感，并且Als活性被吸收和漂移的TBM抑制。TBM的应用还降低了叶绿素和光合速率的含量（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab，c）。此外，能量代谢的关键中间体的含量，包括丙酮酸（Als的基材）和可溶性糖（图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaD，E），在治疗后的几天内也减少。与常见的TBM-S基因型SP2F相比，TBM抗性突变体DS3（TBM-R）显示出较高的ALS活性，并且叶绿素，丙酮酸和可溶性糖的光合速率和含量较小（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）在每株植物的TBM治疗下，在TBM-R中不能引出MS（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.因此，我们认为这些伴随ALS抑制的特征，包括塑性体破坏，光合作用的抑郁和碳水化合物的缺乏，也是与Gametocide TBM诱导的雄性不育相关的重要生理性状。我们还发现，TBM处理的花蕾的乙烯释放速率在3和5日显着增加（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baf），这表明乙烯信号途径可能发生细胞死亡。gydF4y2Ba

鉴别基因表达响应ALS抑制除草剂的分析gydF4y2Ba

基于Bowtie软件映射了清洁的RNA-SEQ读数gydF4y2Ba芸苔gydF4y2Ba基因索引数据库中的序列（URL：gydF4y2Bahttp://compbio.dfci.harvard.edu/tgi.gydF4y2Ba）和NCBI数据库DGE标签分析了Illumina Solex序列测序平台上的两组CDNA文库。我们为每个样品鉴定了大约百分之一的基因。我们在每个库中通过TPM标准化标签分布，然后363 DECs（200上调和163个下调;附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:数据集S1)。前50个上调和下调的基因列在表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．下调编码的一些基因功能重要的蛋白质，如葡聚糖肠胃1,3-β-葡糖苷酶A6，PolyGalacton酶qRT3，非特异性脂质转移蛋白LTP11和LTP12，硫胺氨酸羟基氨基酰基转移酶（SHT），脂肪酰基-CoA还原酶2（MS2），组蛋白 - 赖氨酸N-甲基转移酶ATOXR6，吲哚-3-乙酸 - 酰胺合成酶GH3.17和Gibberellin调节蛋白10（GASA10）。同时，编码自噬相关蛋白ATG8A的一些其他基因[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]、1-氨基环丙基-1-羧酸合酶8 (ACS8)、乙烯反应因子1A (ERF1A)和RAP2-3、解毒1 (DTX1)、DTX6和DTX35(或多药和毒素外排家族转运体花类黄酮转运体[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba)，谷胱甘肽s -转移酶家族(U9、U10、U11、U12、U16、U24)均上调。5组DETs与脂质代谢、代谢解毒、光合作用与质体构成、激素反应、细胞分裂与生长、细胞壁构建相关的部分DETs的表达在热图中显示(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）通过在四个样本中从其TPM值转换的相对水平。gydF4y2Ba

我们试图将所有这些DETs与GO术语进行匹配，GOs通过BiNGO程序得到丰富(图1)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.上调和下调的前50个GOs列于表中gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．它被遗传网络显示，主要的GO术语，包括对化学和激素刺激的反应（对应力的反应），发育过程（花粉壁和花粉膨胀形成），脂质代谢和细胞氨基酸衍生物生物合成过程受到TBM治疗的显着影响。如丙糖核治疗[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，通过ALS酶合成BCAAs途径的基因表达水平没有明显变化。有趣的是，匹配GO:0009693(乙烯生物合成过程)的基因包括1-氨基环丙烷-羧酸合酶8和GO:0009723(乙烯刺激反应)多蛋白桥接因子1a，乙烯反应因子gydF4y2BaCRF6gydF4y2Ba和gydF4y2BaERF071gydF4y2Ba，乙烯反应转录因子gydF4y2BaRAP2-3gydF4y2Ba调节。同时，4-取代苯甲酸酯-谷氨酸连接酶gydF4y2BaGH3.12gydF4y2Ba在GO:0009733(对生长素刺激的响应)中，吲哚-3-乙酸-酰胺合成酶gydF4y2BaGH3.17gydF4y2Ba0009734(生长素激活信号通路)和ap2样乙烯反应转录因子gydF4y2BaPLT1gydF4y2Ba在GO:0009873(乙烯活化信号通路)下调。图中乙烯释放速率的升高支持了对乙烯生物合成过程和介导的信号通路的影响。gydF4y2Ba6gydF4y2Baf。gydF4y2Ba

我们通过STRING产生的网络进一步显示了DETs之间可能的蛋白质-蛋白质相互作用。得到的相互作用网络(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）涉及147个蛋白质，可以进一步分为几组。第一个组由18个蛋白质组成，所有蛋白质都涉及脂质和花粉外部形成。其中的重要成员包括葡聚糖酶A6（MEE48），PolyGalactulonase QRT3，atther特异性蛋白质ATA7，ATA20和ATA27，短链脱氢酶还原酶Tapetum 1（ATA1），3-酮酰基-CoA合酶15（KCS15），型III型聚酮酯合成酶C（AT4G00040），非特异性脂质转移蛋白12（LTP12），亚氨基羟基氨基酰基转移酶（SHT），含富含甘氨酸含有型域的蛋白2（GRDP2 / AT4G37900，参与其中发展和压力响应[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba)，细胞色素P450 98A8。第二组是关于防御反应和信号转导的，包括胞质磺基转移酶(SOT) 12、解毒DTX1、udp -葡萄糖基转移酶UGT73B1、UGT73B3和UGT73B5、植物胱抑素2 (CYS2)、sigma因子结合蛋白SIB1、富半胱氨酸受体样蛋白激酶CRK5、致病相关蛋白PR-4B、2-烯醛还原酶AT5G16990、谷胱甘肽s -转移酶(GST) GSTU4和GSTU9、解毒外排载体DTX35和转录因子MYB51。第三类主要是激素相关通路，包括纤维蛋白调节蛋白10、GH3.12、吲哚-3-乙酸-酰胺合酶GH3.17、1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶8 (ACS8)、乙烯应答ERF1、ERF071、RAP2-3、CRF6和多蛋白桥接因子1a。乙烯反应因子是一个庞大的转录因子家族，调节许多生物过程，包括生长、发育和对环境胁迫的反应。研究表明，在类黄酮代谢途径中，其他一些蛋白也可能在这一调控网络中发挥重要作用，如CCOMAT、TT4、C4H、TT12、CYP86B1、LACS3等。这些异常的转录调控与上述花粉壁形成、脂质代谢、质体结构、组织自噬等功能异常一致。gydF4y2Ba

表达式的分析gydF4y2BaALS.gydF4y2Ba和实时PCR检测的其他重要基因gydF4y2Ba

表达水平gydF4y2BaALS1gydF4y2Ba和gydF4y2BaALS3gydF4y2Ba在qPCR中，处理与对照之间发生了倍数变化，而tbm处理的植株没有受到严重影响(图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba),除了gydF4y2BaALS1gydF4y2Ba只是在小芽中稍微升高。这一结果表明，亚致死TBM暴露并没有极大地干扰gydF4y2BaALS.gydF4y2Ba表达，但酶活性明显受到抑制。其他16个有趣的DETs(图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba）gydF4y2Ba也被选择用于QPCR分析。结果表明，在小芽和中芽中，所选DED的上/下调符合其RNA-SEQ数据中的TPM值（图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba）.编码葡聚糖酶A6和QRT3的两个基因被下调，这两个基因在四分体释放小孢子中发挥重要作用。处理后植物的小花蕾中含有非特异性脂质转移蛋白LTP12和LtpY。4/anther protein ATA7, which were predominantly expressed at the early stage of anther development [23.gydF4y2Ba]，Gdsl样脂肪酶AT1G20130，Sepermidine Coumaroyl-CoA酰基转移酶（SCT）和叶片PSBB也被下调。在TBM处理中抑制了组蛋白 - 赖氨酸N-甲基转移酶ATXR6，其可作为细胞周期中G1-S转变的正调节剂。所有八个测试基因与化学刺激，应激反应，乙烯信号和自噬，包括gydF4y2BaSot12、dtx1、gstu24、aox1a、aox3、pap2-3、acs8、erf071、gydF4y2Ba和gydF4y2BaATG8AgydF4y2Ba，均被TBM处理极大地激活。不幸的是，我们没有单独分析花药和雌蕊，所以我们不知道哪些基因是花药特异性表达的。gydF4y2Ba

抑制ALS活性是必要的，但对于TBM来说是不够的，以诱导MSgydF4y2Ba

众所周知，CIMS涉及多个代谢途径，但其中哪个代谢途径起关键作用却难以确定。TBM可能成为第一个揭示植物靶酶和关键生物途径的杀配子剂，因为以往的研究已经对als抑制除草剂有了广泛的了解。ALS是各种SU和咪唑啉酮类除草剂的直接靶点，包括TBM [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]．在本研究中，即使微量的TBM也能明显抑制油菜籽植物ALS的活性。抗tbm基因型TBM-R不影响ALS活性和叶绿素和光合作用等其他症状。在另一项研究中，研究了抗su突变体的转基因表达gydF4y2Bacsr1-1DgydF4y2Ba能够逆转TBM诱导的油菜和拟南芥雄性不育表型[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．因此，抑制Als活性似乎是TBM和其他苏巴丁诱导植物MS的前提。gydF4y2Ba

然而，ALS似乎不是唯一影响SU杀配子能力的位点，因为我们发现，三唑嘧啶和嘧啶基硫代苯酸除草剂虽然也抑制ALS酶活性和植物生长，但并没有导致油菜雄性不育[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．因此，抑制Als活性不是植物MS的保密。对Als抑制剂的抗性似乎复杂，并且涉及来自不同化学家族的一组未知的非靶位抗性基因座[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba]．除ALS酶外，细胞色素p450 -单加氧酶介导的代谢解毒[gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba和GST词形变化[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]，通过调节蛋白激酶一般控制非抑制蛋白-2 (GCN2)来补充代谢[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba]和氨基酸通过蛋白质转过来再循环[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba还可以有助于Su除草剂的生物耐受性。通过TBM诱导的BCAA饥饿激活GCN2赋予由自噬引起的氨基酸平衡和BCAA回收，并独立导致植物中的TBM耐受性[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．拟南芥gydF4y2BaGCN2.gydF4y2Ba突变体还通过草甘膦抑制光合作用较低[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］gydF4y2Ba．gydF4y2Ba乌侯克等，[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba]发现了四个基因，包括两个细胞色素P450，一个糖基转移酶和一个gydF4y2BaGST.gydF4y2Ba，为非靶点抗性标记，联合表达量可可靠地鉴定黑麦草抗性植株。在本研究中，TBM处理还导致绒毡层细胞和小孢子的自噬，使它们在发育早期迅速降解，正如氨基磺隆所做的那样[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．还提出了在编码排毒1，细胞色素P450和GST家族的数十种基因的升高的表达升高的解毒。因此，我们本研究的结果表明，除了ALS酶和BCAA生物合成，需要研究一些新的代谢途径，以解决植物毒性的原因，包括MS表型。gydF4y2Ba

对TBM暴露的代谢解毒反应gydF4y2Ba

发现我治疗了gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba编码类固醇SOT、1-氨基环丙基-1-羧酸氧化酶、糖基转移酶、GST、细胞色素P450、atp结合盒(ABC)转运体、多药和毒素挤出(MATE)和替代氧化酶(AOX)蛋白家族的早期表达解毒基因[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．一些与解毒有关的新基因，包括gydF4y2BaSOT12gydF4y2Ba，gydF4y2BaAT2G41730gydF4y2Ba和替代呼吸道途径的几种组分，配偶运输司gydF4y2BaDTX4.gydF4y2Ba，gydF4y2BaDTX3.gydF4y2Ba和gydF4y2BaDTX1.gydF4y2Ba，揭示了[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

同样，我们发现TBM也能诱导一些解毒和防御相关基因的表达，如细胞色素P450家族的药物代谢、SOT12、替代氧化酶AOX1A和AOX3。线粒体泛素氧化酶AOX1A和AOX3在线粒体中表达，已知可对各种压力作出反应[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]．als抑制除草剂也能诱导豌豆植株的发酵代谢，但氧化应激似乎与除草剂的作用方式无关[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．SOT12是油菜素内酯SOT，在NaCl胁迫、ABA和水杨酸的作用下产生[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]．关于糖基转移酶，GST，细胞色素P450，ABC转运蛋白，伴侣，AX和SOT的上述数据表明对TBM治疗的一个主要反应是诱导毒品相关基因的诱导。gydF4y2Ba

塑体破坏和脂质异常与Als抑制剂诱导的MS相关gydF4y2Ba

Su除草剂可能会损坏光合仪器[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]因为植物Als蛋白位于塑体和叶绿体中所以[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]．我们发现，在TBM亚致死剂量处理后的几天内，光合速率和叶绿素含量明显受到影响，这与另一种杀菌剂酰胺磺隆的影响相似[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．我们先前报道了由Su Gametocides引起的叶绿体和翅膀elaioplast的异常[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．Zabalza等。［gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba研究发现，KARI抑制剂和ALS抑制剂均能诱导生长阻滞和光合作用抑制。的接触gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba除草剂的植物IM强烈影响叶绿素合成和增加的反应性氧（ROS）[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．水稻暴露于IM受损的脂质膜并影响参与光合作用和糖代谢的基因的转录[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．在TBM的任一治作中，碳水化合物代谢可能被阻断，amidosulfuron [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]或MES曝光[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]因为它们导致叶子和花蕾的可溶性糖含量下降。Sun等人的结果，[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]表明，im处理的植株PSII系统受到严重破坏，许多光合相关基因的表达量下降。gydF4y2Ba

叶绿体的破坏以及光合作用的无法突出似乎是TBM治疗和其他抑制的配子的主要效果[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]．发育小孢子需要大量的光同化物[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba]，如淀粉和其他碳水化合物。花药含量的剥夺似乎是应激诱导的MS中的一个重要因素（在[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba])。因此，光合作用的剥夺和塑性体的破坏也有助于Als-抑制剂诱导的MS。gydF4y2Ba

异常花粉涂层诱导的MSgydF4y2Ba

覆盖MMC的胼胝质壁和四分体小孢子的形成和溶解是植物减数分裂过程和减数分裂后的重要过程[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba]．本研究中的微观和超微视察既表明围绕四方孢子的异常核糖层。壁的组分主要是β-1，3-葡聚糖和果胶。Tapetum标志物基因的下调gydF4y2Ba葡聚糖酶A6gydF4y2Ba和gydF4y2BaQRT3gydF4y2Ba结果表明:TBM处理影响了覆盖MMC和四分体小孢子的胼胝质层。与细胞壁构建相关的其他基因的下调(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）也暗示了花粉墙建设中的异常。gydF4y2Ba

大量利用突变体的研究表明，脂质不仅在类囊体膜的形成中起着重要作用，而且在光合复合体中蛋白质亚基的折叠和组装中也起着重要作用。此外，对类囊体膜的研究也提供了脂类与光合复合体及其活性的关联的关键信息[gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]．TBM和氨基磺隆治疗[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba导致肌肉塑料缺陷和花粉外来。缺陷的体层将损害这种材料的胶质胶质分泌，作为黄酮和脂质化合物，最终影响花粉涂层的形成[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]．AT1G20130是一种GDSL样脂肪酶，其在微孔有丝分裂期间高度表达，花粉成熟期间具有显着下降（根据UNIPROT注释）。LTP11和LTP12是非特异性脂质转移蛋白，其在膜上转移磷脂以及吡咯烷化物。它们可能在扩张表皮细胞和某些分泌组织的细胞壁中发挥蜡或切割沉积的作用（根据Uniprot注释）。gydF4y2Ba

此外，一些植物次生代谢产物，如苯丙素和黄酮类化合物，也会影响花粉皮的构建。SHT催化三羟基肉桂酰亚精胺衍生物的生物合成，积累在花粉壳上[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．植物III型聚酮合成酶催化丙二酰辅酶a单位与各种辅酶a酯起始分子的缩合，生成多种天然产物，包括长链烷基α -吡酮。该蛋白属于查尔酮合成酶超家族，是多种植物次生代谢产物的骨架，包括查尔酮、二苯乙烯、联苯等[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]．细胞色素P450成员如gydF4y2BaCYP71B23.gydF4y2Ba，gydF4y2BaCYP 81这里gydF4y2Ba和gydF4y2BaCYP72A219.gydF4y2Ba和下调gydF4y2BaCYP 98A8gydF4y2Ba和gydF4y2BaCYP 86B1.gydF4y2Ba，提示对苯丙素和类黄酮代谢途径有影响。gydF4y2Ba

Gametocide TBM的作用方式gydF4y2Ba

就像另一种杀菌剂氨基甲磺隆所做的那样[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]， TBM对油菜生长发育也具有多效性。虽然TBM和氨基磺隆处理在油菜中诱导的转录调控有所不同，但我们可以发现两种转录组之间存在相似的DET类别，如脂质代谢、叶绿体成分、细胞周期和细胞壁构建。我们的研究和以前的研究中可用的数据[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba]的研究表明，抑制光合作用、细胞周期阻滞、花粉被材料消耗和乙烯含量升高是TBM的主要植物毒性作用。这些异常可直接/间接诱导绒毡层细胞和小孢子的自噬和细胞死亡。因此，TBM的作用方式与氨基磺隆相似[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，如图所示。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba．暴露于TBM导致ALS酶的抑制，代谢性解毒和代谢性补充。ALS活性的抑制会干扰氨基酸代谢，进而破坏质体和叶绿体。绒毡层优先基因的表达以及脂质、类黄酮和花粉被材料的合成受到影响。gydF4y2Ba

结果表明，TBM治疗导致一些重要途径的异常转录调节，尤其是与塑体，光合作用，脂质代谢和乙烯刺激有关的转录。这些异常，通过几种重要的生理性状的变化证明，将扰乱塔皮特细胞和幼儿孢子的发展，因此，MS表型发生。除了ALS之外，发现与TBM诱导的MS相关的重要途径也是研究其他ALS抑制剂的植物毒性效果的有用参考。gydF4y2Ba

肌萎缩性侧索硬化症:gydF4y2Ba

乙酰乳酸合成酶gydF4y2Ba

BCAA:gydF4y2Ba

分枝链氨基酸gydF4y2Ba

CIMS：gydF4y2Ba

化学诱导的雄性不育gydF4y2Ba

DAT:gydF4y2Ba

天治疗后gydF4y2Ba

DET：gydF4y2Ba

差异表达转录gydF4y2Ba

DGE:gydF4y2Ba

数字基因表达gydF4y2Ba

市场经济地位:gydF4y2Ba

Monosulfuron酯钠gydF4y2Ba

mmc：gydF4y2Ba

微孔母细胞gydF4y2Ba

透射电镜:gydF4y2Ba

透射电子显微镜法gydF4y2Ba

作者感谢中国杭州LC-Bio的黄志远先生在数据分析方面的帮助。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

国家重点研发计划项目(no . 2016YFD0101300)、国家转基因研究计划项目(no . 2018zx0802001 -011)和陕西省重点研发计划项目(no . 2018NY-055)资助。资助机构在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写中没有扮演任何角色。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发布的文章及其补充信息文件中。支持本文结果的RNA-SEQ数据可在加入号GSE113681下的NCBI基因表达式综合征中获得。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 静龙莲和李苏仁同样为这项工作贡献。gydF4y2Ba

隶属关系gydF4y2Ba

1. 西北A＆F大学农学院，杨凌，陕西712100gydF4y2Ba

   连景龙，任丽锁，张聪，于成玉，黄震，徐爱霞，董俊刚gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

CYY构思、设计实验并撰写稿件;JLL、LSR、CZ、AXX、ZH、JGD协调研究并提供实验材料。所有作者起草并批准最终稿件。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba程毓余gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

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