vvmir160s /VVARF公司在GA诱导的葡萄舱疗法期间相互作用及其时空表达/切割产品

背景

葡萄（vitis Vinifera）对吉伯林素（GA）高度敏感，有效地诱导葡萄舱疗法。研究表明miR160及其目标生长素反应因子（东盟地区论坛）响应荷尔蒙对于植物生长和发展的各个方面是必不可少的，但它们在GA诱导的葡萄丘脑中的功能仍然难以捉摸。

结果

在这项研究中，花发育过程中的形态变化，以响应GA处理'蔷薇Bianco'品种进行了研究。精确的序列VVMIR160A / B / C / D / E.和他们的VVARF10 / 16/17克隆，测序和表征靶基因。研究了VVARF的系统发育关系和来自不同物种的其他ARF家族的内外结构。所有vvmir160s（vvmir160b除外）和VVARF10 / 16/17有共同点CIS.-元素响应GA，支持其在GA介导的葡萄单性结实中的功能。vvmir160介导的切割作用VVARF10 / 16/17在葡萄花中被证实。此外，时空表达分析表明VVMIR160家人，VvmiR160a/b/c型在花卉/浆果发展的后期高度表达，而且VVARF10 / 16/17表现出反向表达趋势。有趣的是，GA通过诱导表达的长期效果VvmiR160a / b / c /e治疗后5至9天增加它们的乳化产品累积，但GA增强了表达式VVARF10 / 16/17只是在短期内。基于表达数据的Pearson相关分析显示VvmiR160a/b/c与VVARF10 / 16/17在GA诱导的葡萄疗法期间，在鲜花中而不是浆果。

结论

这项工作表明，负调节VVARF10 / 16/17表达的VvmiR160a/b/c型作为关键监管因素对GA介导的葡萄幼大藻类至关重要，为高品质无籽浆果的分子育种提供了重大影响。

在被子植物中，开花时间是植物生命周期的重要组成部分，提供了从营养生长到生殖生长阶段的关键发育转变，以确保植物生存所需的种子生产[1］．花卉开发和开花时间由复杂的遗传和表观遗传重编程[光周期，自主，葡萄兰化/温度，胃肠杆菌蛋白（Ga）和蔗糖途径进行调节，以确保开花时间与合适的受精条件相吻合分散[2那3.那4.那5.那6.那7.］．这种遗传和表观遗传的重编程是通过在转录和转录后水平上明确控制关键开花基因的表达来应对发育和环境刺激[3.那4.］．在这种背景下，microRNAs (miRNAs)是一类长度从19到25个核苷酸(nt)的小的、单链的非编码rna，最近被确定为通过转录切割和转录抑制参与花过渡的靶基因表达的关键调控因子。花的形成和花器官的发育[8.那9.那10那11那12那13那14那15］．然而，这些miRNA的生物学功能主要是在模型植物中的表征[16那17]他们在小道消息中的角色(vitis Vinifera仍然不完全明白，占度高的成熟过程仍然没有完全理解。

众所周知，植物激素（如GA）对葡萄花的发育、果实膨大、成熟和无核果实的诱导具有重要的调控作用，外源应用GA可以引发不同葡萄品种的单性结实和早熟[15那18那19］．一些报道表明，不同的miRNA家族(miR061、miR156、miR159、miR160、miR164、miR167、miR172和miR319)及其靶基因与花的转变和座果发育的GA信号有关[8.那9.那20］．例如,拟南芥Atmir159充当GA信号的稳态调节剂，以指示编码亚霉素蛋白的基因的切割，导致花药发育的缺陷和随后的花卉生育率降低[21］．类似地，生长素(AUX)也被认为是果实发育和缩皱的必要因素，生长素响应因子(ARFs)通过与启动子中的生长素RESPONSEELEMENTs (AuxREs)结合来调节大量生长素响应基因的表达[19］．几项研究中拟南芥番茄植物展示了MiRNA通过控制记录丰度在AUX信号传导中发挥着重要作用ARF2/3/4/6/8/10/16和17[22那23那24］．例如，Arabidopsis MiR160a（Atmir160a）突变植物表现出显着的减少AtmiR160a型表达在carpel的花卉器官（船)花序和不规则花表型由于各种胚胎缺陷[17］．除此之外，AtmiR160a型突变体植株表现出高表达ARF16和ARF17在胚胎发育期间船与野生型植物的亲缘关系，表明AtmiR160a型胚胎发育的必要条件是什么拟南芥通过负调节东盟地区论坛基因(17］．同样，番茄（Solanum lycopersicum.）SlmiR160被击倒的植株表现出不稳定的子房模式和不正常的花器官脱落，以及基因表达的下调SlmiR160与基因表达上调有关Slarf10a.那Slarf10B.， 和SlARF17，表明aux介导的花和果实发育需要SlmiRNA160 [24］．虽然ARFS.在某些情况下，它们似乎具有独特的功能，但在不同的植物物种中，它们也表现出重叠的功能，例如，基因突变ARF8.导致了无籽果实的形成拟南芥和番茄植物[25那26]. 因此，表征东盟地区论坛成员及其在不同植物物种花发育中的作用至关重要。

在过去的几十年中，直接浆果消费和饮料生产的葡萄生产经济重要性有相当大的增加[27］．有几点报道表明，葡萄花的发育过程会影响浆果果实类型，产量和质量[28］．因此，研究葡萄花发育的分子调控机制是十分必要的。在我们最近的研究中，用GA处理葡萄藤浆果_3.表现出显著的上调microrna的花组织中的科，包括mir159s.和miR160s，暗示这些miRNA在GA信号中的潜在作用[29]. VvmiR159c通过GA-DELLA[细长稻1号（SLR1）]-VvmiR159c在GA信号转导中的潜在作用-VvGAMYB作为无籽葡萄开发的关键分子模块，最近被我们的团体报告了[15]. 然而，miR160及其特异性靶基因调控葡萄花和单性结实的分子机制尚不清楚。在此背景下，我们首先研究了‘Rosario Bianco’品种在花和浆果发育过程中对GA的响应_3.治疗。其次，我们孤立并克隆了精确的序列VVMIR160A / B / C / D / E.在葡萄CV的花组织中。'rosario bianco'。第三，他们东盟地区论坛通过使用预测靶基因VVMIR160A / B / C / D / E.序列，以及更新的葡萄mRNA数据库。对鉴定出的vvarf进行了进一步的系统发育和序列同源性分析。启动子基序对包括GA在内的荷尔蒙有反应VvMIR160s(VvmiR160前兆)和VVARF公司分析，在我们的实验期间确认。最后，裂解角色和不同的裂解位点VVMIR160成员和他们VVARF10 / 16/17通过RNA-Ligase介导的CDNA末端（RLM族）的快速扩增葡萄花中验证了靶基因，并多（a）聚合酶介导的3'CDNA末端的快速扩增（PPM血液）。此外，时间 - 时空表达和切割产品积累VVMIR160A / B / C / D / E.和VVARF10 / 16/17研究了葡萄生长发育过程中外源GA对目标基因的影响。我们的研究结果表明，VvmiR160通过其负性调控基因调控GA介导的花发育和葡萄单性结实VvARF公司活动。

外源GA治疗葡萄孢菌病原过程中花卉和浆果发育的形态变化

探讨遗传算法的作用_3.在葡萄花发育和单性结实过程中，比较了GA的花簇和浆果形态_3.不同时间点(分别为0HAT、2HAT、1DAT、5DAT、9DAT、10DAT、45DAT和95DAT)与对照(CK)相比，不同处理(0 h、2 h、1、5、9、10、45和95 d)的差异显著。1a和b）。其中，GA治疗在21岁时进行 结果表明，GA处理的植株在9日龄达到开花期，而对照植株没有。如图。1A和B，GA_3.与未处理对照相比，处理植株在5DAT和9DAT时开花时间明显提前，穗长显著增加(图1)。1b)。_3.处理后的花序在5DAT上开始张开，而对照的花序保持关闭状态(图1)。1a).脱芽后进一步观察，GA效果明显_3.在5DAT和9DAT上观察到对‘Rosario Bianco’葡萄花序的处理，与未处理的对照植株相比，具有明显的花形态，包括暗黄色和小花药、长花丝、短花柱和大子房（图。1a） 是的。此外，GA_3.-treated葡萄树浆果表现出与对照组相比的长浆果尖峰和谷物（图。1b）和高无籽比（96.2％）相对于对照植物（〜5％）（图。1a），暗示Ga_3.处理对诱导‘蔷薇’葡萄单性结实有显著效果。

葡萄花组织中VvmiR160s基因的精确序列测定。miR-RACE的“Rosario Bianco”

本研究利用miR-RACE技术对葡萄花组织中VvmiR160家族成员的精确序列进行了测定罗萨里奥·比安科（图。2A和B）。对于VVMIR160A / B / C / C / D / E成员的3'-和5'-miR族的PCR产物分别为88和62bp（图。2a） 是的。通过随后的克隆和测序验证所有MIR-RACE PCR产物。MiRBase 21.0中克隆序列和验证的miRNA之间的序列同一性用于确认3'-和5'-miR族技术的精度。VvmiR160a型和VvmiR160b型在长度（21nt）和核苷酸序列“tgcctgcctcctgaatgcca”中，相同，具有14.2;23.8;分别为23.8和38.0个百分比的A，T，G和C（图。2b)。然而,VvmiR160c型那VvmiR160d型和VvmiR160e型“TGCCTGGCTCCCTGTATGCCA”长度和序列相同，为9,5;28日,5;A、T、G、C的含量分别为23.8和38.0(图1)。2b). VvmiR160s中GC含量越多，对茎环发夹结构的稳定就越重要。VvmiR160a/b和VvmiR160c/d/e在5 '端第15个位点的一个碱基变异(A/T)上均表现出高序列相似性(图1)。2b） 是的。VvmiR160a/b/c/d/e的主要转录本(VvMIR160a-e）被克隆和测序，证明它们的长度为约501bp（图。2a），其进一步用于使用MFOLD在线工具的二次发夹结构形成（http://unafold.rna.albany.edu/)．这些结果证实了VVMIR160A / B / C / D / E的真实性，并且所有VVMIR160A / B / C / D / E成员位于其前体的环杆结构的5'-杆臂中（图。2c)，表明VvmiR160家族的不同成员在其前体中都有一个保守的位置。

玉米的鉴定、特性和染色体分布VvARF公司基因

基于我们鉴定的VvmiR160s序列和更新的grapemrna数据库（grapeiggp12x assembly-v2annotation），我们采用了psrnatarge软件(http://plantgrn.noble.org/psrnatarget/#）根据王报告的靶预测规则，重新预测VVMIR160的特定靶基因[30.］．VvARF10型/16/17被鉴定为VvmiR160s型（附加文件1:图S1)， VvmiR160s的所有靶区均发生在相应的编码序列(CDS)中VvARF公司靶基因及其相互作用模式被切割（表1）1)．接下来，互补程度VVMIR160：VvARF公司成对表现出一些分歧，例如，VvmiR160a/b型和他们的VvARF16型靶基因有三个不匹配的基础，而VvmiR160c / d / e仅显示一个不匹配基础VvARF16型（图。3.a），表明它们的裂解作用的分歧。此外，在VVMIR160和VVMIR160之间的不匹配基地的位置，高保性VVARF公司观察(图3.a） ，这可能是vvmir160靶模守恒的原因之一。所有的VVMIR160和他们的VvARF公司利用MapInspect软件在葡萄染色体（Chrs）上进一步定位了目的基因序列(http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-mapinspect.html.). 全部五个VvmiR160s型和三VVARF公司本研究中的鉴定分布在19个葡萄染色体中的四个（图。3.b）。CHR 10含有两个VVMIR160构件，而CHR 8,12和13仅包含一个VVMIR160构件（图。3.b）。映射结果证明了VVMIR160A，VVMIR160D和VVMIR160E分别位于CHR 12,8,13上，而VVMIR160B和VVMIR160C两者都被映射到CHR 10上相同的位置（图。3.b)。此外,VvARF10型那VvARF16型， 和VvARF17型分别在Chr 8,13和18上映射（图。3.b)。VvmiR160d:VvARF10型和VvmiR160e:VvARF16型成对分别位于CHR 8和13的相同位置，而MIR160没有与...的共定位VvARF17型在CHR 18（图。3.b).该染色体是否与VvmiR160s型和VVARF公司可能影响其卵裂活性，这需要进一步的研究。

识别VVARF公司不同植物物种的整体序列和系统发育和多样化分析

我们克隆了三个VVARF10 / 16/17“Rosario Bianco”葡萄花的基因序列，以及他们推断的氨基酸序列被鉴定(附加文件2:图S2)。的开放阅读框(ORF)VvARF10型是2106bp编码701氨基酸残基，VvARF16型展出2052 编码683个氨基酸残基的bpVvARF17型拥有1653 bp编码550个氨基酸残基(附加文件2:图S2)。为了研究ARF家族成员之间的系统发育关系，我们将VvARF10/16/17的蛋白序列与不同植物的同源蛋白序列进行比对，构建了一棵未根树(图1)。4.a） 是的。系统发育分析显示不同植物物种之间ARF的多样化和保护（图。4.a） 是的。所有ARF家族成员分为两大类，代表27份材料（图1）。4.a） 是的。第一组包含所有ARF10和ARF16类，而第二组包含所有ARF17类（图。4.a).我们的vvarf与来自NCBI的同源物的系统发育关系表明，VvARF16与拟南芥VvARF10和VvARF17与核桃的亲缘关系最为密切(juglans regia.(分别为JrARF10和JrARF17)，表明ARF家族成员在不同植物物种中具有保守性。另一方面，VvARF10/16/17与cherry (李属鸟结核， PaARFs)及桃(碧桃PpARFs），表明ARF蛋白家族不同成员进化的多样性（图。4.a） 是的。

分析了三个外显子的内含子结构VvARF公司具有相应基因组DNA序列的全长cDNA序列显示了几个成员VvARF公司-CD被一到三个内含子破坏（图。4.b）。检测到内含子的最大数量ARF10/16成员，虽然检测到最低ARF17（图。4.b） 是的。所有的东盟地区论坛成员表现出类似的内含子位置和长度的基因结构，类似于它们的系统发育树，其支持系统发育分析的可靠性（图。4.b).鉴定出3个保守结构域(B3、AUX_rsep和AUX_IAA)，并给出了它们在系统发育树中各自arf蛋白中的分布(图1)。4.c） 是的。所有的ARF蛋白在N末端都含有两个非常保守的DNA结合域B3和生长素u resp（图1）。4.c).而VvARF16、SlARF10、JrARF10和JrARF16在c端有额外的AUX_IAA结构域(图)。4.c） 表明arf对AUX信号具有功能保守性。

接下来，利用MEME 5.05工具对ARFs蛋白进行基序组成分析。系统发育树中亲缘关系较近的同源arf具有相似的基序组成，亲缘关系较远的同源arf具有明显的基序组成差异(图1)。4.D），暗示同源ARF的更类似的结构，尤其守恒。此外，分析了蛋白质物理化学性质的参数，包括氨基酸的数量，分子量，等电点，脂族指数和宏观平均性的含量（附加文件）3.:表S1)。与图中结果对比。4.a和d，我们发现虽然VvARF10和JrARF10;VvARF16 AtARF16;VvARF17和JrARF17的基因序列遗传距离较近，蛋白参数变异较大。这一变化范围表明不同的ARF蛋白可能在不同的微环境中工作[31.］．

启动子的顺式元素分析VvMIR160s和他们的VvARF公司目标基因

启动子区域是基因表达的关键因素，其序列包含一些必不可少的CIS.-能反映基因潜在功能的元素(功能成分)[32.］．认识…可能的功能VvMIR160s和他们的VVARF公司对葡萄的靶基因进行了分析CIS.- 在他们的推动者中（附加文件）4.：表S2）。全部CIS.-元素分为5种类型，包括光、激素、组织特异性、昼夜节律和应激响应元素(图1)。5.a).不同的VvmiR160和，在所有五种主题类型中，与轻相关的元素是最丰富的VvARF公司成员(无花果。5.a） 这可能是由于光在植物生长发育的光合作用过程中起着重要作用。鉴于CIS.- 还检测到响应性应激，激素和特定组织发育;然而，他们的丰富远低于光响应的大量CIS.-元件（图。5.a).此外，启动子的类型和数量也不同CIS.-要点VvMIR160s及其目标VVARF公司（图。5.a和附加文件4.：表S2），表示来自同一个家庭的各种成员的多样化。

进一步认识到可能的调控机制VvmiR160s型和他们的VvARF公司靶基因响应GA处理葡萄花开发，我们扫描了与激素有关的CIS.-元素在其启动器区域(附加文件5.：表S3）。有趣的是，我们发现几乎所有VVMIR160成员（VVMIR160B除外）及其VVARF10 / 16/17目标基因，有激素反应CIS.-元素，包括吲哚乙酸(IAA)、GA、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)响应CIS.-元件（图。5.b）。但是，构成和数量都是CIS.-与激素相关的元素在不同的VvmiR160成员之间及在不同的VvmiR160成员之间表现出一定的差异VvARF公司目标基因(无花果。5.B和c)，表明它们的潜在功能在葡萄中可能具有一些独特和重叠的功能。有趣的是，所有的vvmir160(除了VvmiR160b)和VVARF公司有共同点CIS.-元素响应于GA和SA，可能是调节葡萄花和果实发育的必需激素。如VvmiR160a/c/d/e有CIS.-元素对GA的响应，其中VvmiR160a的百分比最高(37%)，VvmiR160c的百分比最低(16%)。同样，VvmiR160d和VvmiR160e的百分比最高CIS.- 与VVMIR160A和VVMIR160℃相比，对SA（分别为50和33％）的-ELEMENTEMENT（图。5.b） 是的。我们的结果支持了预测VvmiR160潜在功能的重要信息：VvARF公司通过响应激素信号对葡萄生长发育的调节。

体外活性VvMIR160c和VvARF10型发起人响应GA

进一步分析VvMIR160c和VvARF10型启动子是为了确认其启动子对GA反应的活性。的VvMIR160c和VvARF10型启动子区域融合到β-葡糖醛酸酶（GUS）报告基因去除后35SCaMV型双载体pBI121的启动子，载体结构如图所示。6.a.将获得的结构体独立转化成烟草植株农杆菌属-中介法。A pBI121型-35 s-gus构建体35SCaMV型启动子为阳性对照，pBI101缺失构建35SCaMV型启动子为阴性对照(图。6.b） 是的。验证遗传相关基因的存在CIS.元素在VvMIR160c和VvARF10型促进剂区域，0,30和50μmGa被施加到转基因烟草中，并检查GUS活性。组织化学染色模式揭示了GA治疗对转化烟叶中GUS活性水平的影响（图。6.b）。正如预期的那样，格斯基因驱动35SCaMV型与阴性对照（pBI101）相比，在对照和GA处理条件下，启动子（阳性对照）在转化烟叶中组成性表达35SCaMV型促进剂）转基因素（图。6.b和c）。然而，低水平的GUS活动是由VvMIR160c和VvARF10型未处理组（0 μM GA）转化烟叶（图。6.b和c）。GUS活性显著升高VvMIR160c和VvARF10型含启动子1的结构（pBI121-p1VvmiR160c-GUS和pbi121-P1VVARF10-GUS.与未处理的转基因烟叶相比，30 μM赤霉素和50 μM赤霉素处理的转基因烟叶中，尤其在50 μM赤霉素剂量较高时(图5)。6.B和c）。但是，Gus活动几乎没有改变VvMIR160c和VvARF10型含启动子2的结构（pBI121-p2VvmiR160c古斯和pbi121-P2VVARF10-GUS.）在用30和50μmGa处理的转基因烟草叶中（图。6.b和c）。我们的数据清楚地证实了这一点VvMIR160c和VvARF10型启动子1具有1500bp的区域含有GA相关的顺式响应元件，这对于诱导GA响应至关重要。

VVMIR160介导的验证VVARF公司RLM-RACE和PPM-RACE的切割作用

家庭成员与家庭的互动VvARF公司通过我们改良的RLM血，并开发PPM族程序，研究了靶基因及其在葡萄花组织中的调节机制，并开发了PPM血30.]. 首先，从RLM RACE中，扩增的3’端产物的测序揭示VVMI160家族成员的互补区域中间只有一个解理位点。VVARF10 / 16/17（图。7.). 所有切割位点均定位于VvmiR160a/b/c/d/e基因5′端的第9个位点（图。7.），表明miRNA的切割位点的特异性，这与先前的研究一致[30.那33.那34.］．接下来，利用我们开发的PPM-RACE进一步确认vvmir160的靶基因及其切割位点。扩增出的5’端产物测序结果与RLM-RACE实验中3’端测序结果相同。此外，5’端产物的裂解频率低于3’端产物，这可能是由于3’端片段的稳定性高于5’端片段[30.那33.那34.］．RLM族和PPM比赛实验的一致结果证实了这一点VvARF10型那vvarf16，和VvARF17型为VvmiR160a/b/c/d/e的下游靶基因，并验证了其在葡萄花序中的剪切相互作用模式(图。7.)．尽管vvmir160的解理位点位于其5’端相同的第9个位置，但这些解理位点在各自的不同位置上VvARF公司目标基因(无花果。7.)．例如，VVMIR160的所有裂解位点位于VVMIR160S的5'-末端的第9位，但位于1337末，其中5'末端为14/14VvARF10型，1304th从5'-tem的16/16VvARF16型和5'-End的22/22的1364thVvARF17型（图。7.)．

VVMIR160S和vVmir160s的差异表达谱和相关分析VVARF公司葡萄生长期

相互作用的影响VvmiR160s型和VVARF公司通过测定葡萄花的时空表达谱来研究葡萄花的发育过程VvmiR160s型和VVARF公司在控制条件下（图。8.a).如图。8.a、 VvmiR160家族的表达水平可分为三组。第一组，VvmiR160a型/b/c公司在花卉发育晚期的表达水平上显示出最高的表达水平[从花序（22dai）到30dai后22天]，并且在花卉发育的早期表达中的低表达（图。8.a） 是的。此外，VvmiR160a型和VvmiR160c型在26DAI时表达量最高，表达趋势相似VvmiR160b型拥有30dai的最高水平（图。8.a） 是的。在第二组，VvmiR160d型表现出相反的表达趋势VvmiR160a/b型/c、 在花发育早期检测到高表达，随后逐渐降低，直至花发育后期（图。8.a).在第三组，VvmiR160e型显示所有阶段的表达水平低，表明这一点VvmiR160e型在葡萄花卉发育过程中可能会有轻微的作用（图。8.a） 是的。随后，表达概况VvmiR160a/b/c型展示了一个向上的趋势以及开发前的1天（1daa）至86daa的1天，并达到了成熟的高峰（86daa）;尽管VvmiR160d型表现出相反的表达趋势VvmiR160a/b型/c、 以及VvmiR160e型显示所有阶段的表达水平低，表明这一点VvmiR160e型在葡萄贝瑞开发期间也可能在略微作用（图。8.b）。

所有这三个VVARF10 / 16/17与...相比，靶基因表现出反向表达趋势VvmiR160a/b/c型它们的表达水平在花/浆果发育的早期增加，到后期逐渐降低（图。8.a和b）。然而，VVARF10 / 16/17表达谱与对照组相似VvmiR160d型葡萄花/浆果发育不同阶段的表达（图。8.Pearson相关系数表明VvARF10型/16/17表达呈高度负相关(R.花= - 0.83到- 0.94;R. = − 0.81 to − 1 for berries) withVvmiR160a/b/c型和正相关（R. = 花0.93～0.99；R. = 0.8842 to 1 for berries) withVvmiR160d型（图。8.总体而言，时空表达及相关分析表明，VvmiR160a/b/c是葡萄花果发育的关键调控因子，通过负调控VvARF公司表达式。

vvmir160和VVARF公司葡萄开发期间GA治疗

Ga是植物生长和发展的必要因素，并且Ga的外源应用诱导表达水平VvmiR160s型在植物中[19那29]. 然而，GA介导的葡萄花和浆果发育的相对效应是通过miR160s仍然难以捉摸。在本研究中，比较表达水平VvmiR160s型和VvARF公司研究了ga处理和未处理对照(CK)植株花发育过程中的靶基因(图1)。9.a） 是的。外源性应用GA显著上调了细胞凋亡VVMIR160A / B / C / E.与未处理的对照植物相比，在5dat和9dat的表达（图。9.a） 是的。然而，GA治疗没有显着影响VvmiR160d型表达（图。9.a） 是的。这些结果表明，Ga是葡萄花卉发育期间VVMIR160A / B / C / E的正长期调节器，MIR160家族的各种成员具有多样化的响应模式。另一方面，GA治疗诱导VvARF10型/16/17表达主要在2hat（图。9.a） 这意味着这些靶基因在花发育过程中对GA处理表现出短期反应。与花发育不同，GA处理几乎显著上调了VvmiR160s和3个基因的表达VVARF公司基因在45DAT（45 治疗后天数；浆果膨大）（图。9.b） 是的。此外，三个VVARF公司的表达量在成熟阶段被GA轻微上调(Fig。9.b）。

此外，我们还比较了VvmiR160s的表达水平和它们的表达水平VvARF公司在GA治疗下的靶基因，我们透露，在葡萄花，VVMIR160A / C和VVARF10 / 16/17表达表现出一些负相关(R. = − 0.44至− 与未经治疗的对照组相比，GA治疗的短期和长期效应（图。9.c） ；然而，在浆果中，它们的表达并不具有负相关（图。9.d） 是的。相关分析表明，GA可能增强了VvmiR160a/c对细胞凋亡的调控作用VVARF10 / 16/17在花发育期间。然而，VvmiR160b与其靶标仅在花发育的短期内呈负相关，而VvmiR160e与其靶标在长期内呈明显的负相关。GA对VvmiR160d的表达没有影响，与未处理的对照相比，VvmiR160d和VVMIR10 / 16/17表现出一些正相关（R. = 0.56 to 0.64) (Fig.9.c).在葡萄浆果中，VvmiR160a/b/c/d和VVARF10 / 16/17表达呈一定的正相关(R. = 0.69 to 0.99) in response to GA (Fig.9.d）。这些结果表明，在葡萄花卉和浆果发育期间，VVMIR160A / B / C / D响应GA响应于GA。

考虑到miRNA功能的冗余性和互补性，我们对VvmiR160家族所有成员的总表达水平和每个成员的总表达水平进行了相关分析VvARF公司研究了靶基因（图。10A和B）。结果表明，VVMIR160S的总表达与VVARF10 / 16/17目标基因主要在葡萄花发育的后期（22DAI、26DAI和30dai，用星号标记）受到控制（图。10a），VVMIR160的总表达与VVARF10 / 16/17目的基因在成熟(86DAA，标记为星号)的葡萄浆果发育控制(图。10a） 是的。而在GA处理下，GA几乎在葡萄花发育的所有阶段（0HAT到9DAT，用星号标记）都增强了VvmiR160s对其靶基因的负调控作用（图。10b);然而，在葡萄果实发育过程中，GA对vvmir160及其靶基因的相互作用没有明显的影响(图1)。10b）。这些结果表明，VVMIR160家族可能具有一些功能冗余，并表明GA是诱导VVMIR160S在短期内和长期目标对目标的调控作用的必要因素。

裂解产品的动态累积2017年10月16日在GA诱导的葡萄花开发期间

检测VVMIR160s和裂解产物的积累VVARF公司研究葡萄花发育过程中卵裂作用的时空变化规律。利用我们改进的RLM-RACE和开发的PPM-RACE方案以及qRT-PCR监测GA处理下的3’-和5’-裂解产物。结果表明，GA处理促进了3’-和5’-裂解产物的积累VvARF10型/16/17与未经处理的对照植物相比（图。11)．GA诱导3'-和5'裂解产品的最高积累VVARF10 / 16/175点。然而，GA在2HAT轻微诱导3′-和5′-裂解产物，表明GA对VvmiR160s的裂解作用表现出深远的长期影响，而不是短期影响（图。11). 虽然，5′-裂解产物的积累VVARF10 / 16/17在GA处理和未处理的对照植物中的各个相，几乎与3'-切割产物类似（图。11)， 3’-解理产物略高，这可能是由于3’-解理产物较之前报道的5’-解理产物具有较高的稳定性[30.那33.那34.］．

近年来，研究了外源GA对葡萄花发育、无核栽培、果实膨大和果实成熟的影响[18那20］．然而，Ga-Signaling介导花和水果套装在葡萄树中的分子机制仍然没有完全理解。近年来，MiRNA已被鉴定为通过间接或直接转录和转录后基因沉默的基因表达的临界调节因子，以调节基因网络的活动，潜在的各种发育和应力响应方案[3.那9.那14那21］．几个参与大麦的MiRNA家庭（普通大麦），拟南芥， 棉布 （棉花）在miRBase中鉴定并释放番茄花开发[10那11那24那35.那36.那37.]. 例如，最近的一项研究表明2017年10月16日在番茄植株中，由miR160介导的花器官脱落和子房模式的各个方面都是不可或缺的[24］．同样地，丧失损失拟南芥atmir160a植物改变了表达ARF16/17并显示不同的表型，包括不规则的花，减少的生育，异常的种子和单片机内的花器官[17］．我们以前的研究[15那29]表明外源性应用GA_3.诱导了几个miRNA家族的表达，包括miR160s和mir159s.在葡萄花卉开发期间，这表明这些miRNA可能在葡萄花卉发育和倒数过程中发挥重要作用。在本研究中，我们利用葡萄普罗纳科佩卡维系统来调查监管职能VvmiR160s型-VVARF公司响应GA介导的葡萄葡萄花开发。GA的外源性应用_3.在“罗萨里奥·博科”品种中诱导各种有趣的花卉和浆果形态，包括深黄色的花药，长丝，短触控笔，大卵巢和高无籽比，长浆液钉和谷物相对于未处理的对照植物（图。1A和B）。我们的结果符合Wang等人最近的研究。[15]这证明了GA_3.应用诱导葡萄CV中不同的花卉形态。'Zuijinxiang'，确认Ga-Simbering是葡萄占桔梗和果实开发的正规调控的关键因素。

基于我们先前对GA诱导葡萄单性结实的高通量测序[15那29]，精确的序列VVMIR160A / B / C / D / E.和他们的VVARF10 / 16/17分离靶基因，测序并映射到相应的染色体中（图。2和3.). 尽管miRNAs在进化上在不同的植物物种中是保守的[38.]，我们的VvmiR160a/b型与葡萄酒葡萄CV的同源序列相比，表现出两种核苷酸短缺。在mirbase 21.0中'pinot noir'，而那些VvmiR160c / d / e在葡萄种类中一致（图。2b）。我们以前的研究表明，已知的miRNA的约85.2％在其靶基因上有单一的切割位点，而剩余的14.8％的已知miRNA有两到三个裂解位点，这些切割位点主要映射在第9位，第10位或来自相应miRNA的5'末端的第11核苷酸位置[39.］．根据基对互补程度VvmiR160s型和VvARF公司使用5′-RLM-RACE和3′-PPM-RACE技术[30.，我们证明了这一切VVMIR160A / B / C / D / E.在5′端的第9个位置有相同的解理位点（图。7.)而它们相应的裂解位点VVARF10 / 16/17变量和位于1337和14/14,1304和16/16和1364和22/22从5 '端VvARF10型那VvARF16型和VvARF17型分别（图。7.)．这些结果表明，切割位点具有miRNA位点识别的特异性，类似于之前的报道，miRNA从其5 '端如9、10和11位点切割其靶点[30.那33.那34.］．PPM-Race结果进一步显示出3'-末端切割产品的累积水平高于RLM-ram 5'-End切割产品的累积水平。3'-末端裂解产物的积累可归因于miRNA定向切割后产生的5'-RNA片段的快速降解，而3'-RNA片段更稳定，类似于苹果，橙子和桃 [30.那38.］．

miR160在细胞凋亡中的保守调控作用东盟地区论坛目标基因跨越不同的植物物种

我们的VVARFS和矫形器的系统发育树证明了VVARF和ATARFS，SLARF和JRARF之间的正交关系（图。4.a），暗示这些ARF蛋白可能从共同的祖先中解除，并且可以具有保护的功能。三个VVARF10 / 16/17的氨基酸序列含有保守的N-末端B3和AUX_RESP DBD，以及C末端AUX / IAA结构域（CTD：Domain III / IV），而VVARF17和其他正轨ARF17成员则显示缺席C末端AUX / IAA结构域（图。4.C）。B3型和AUX_RESP DBD对于ARFS和TGTCTC辅助之间的相互作用是必不可少的，而AUX / IAA结构域通过ARF和AUX / IAA家族成员之间的同源和异质二聚体促进蛋白质 - 蛋白质相互作用[40那41.那42.］．Auxin_resp结构域是植物进化的一个步骤，陆地植物的淡水藻类祖先被报道含有具有III/IV和B3结构域的arf样蛋白前体，但缺乏Auxin_resp结构域[22］．此外，基因结构分析表明，所有的编码序列VvARF公司基因被内含子破坏;然而，不同的基因中内含子的总数是不同的VvARF公司成员(无花果。4.b).最同源的外显子-内含子结构东盟地区论坛基因具有类似的外显子系统结构的分布，提供了重要的证据，以支持系统发育分析的可靠性VVARF公司和他们的同源ARFS.在拟南芥番茄和其他物种（图。4.A和b)，提出一个势守恒函数。

此外，启动子基序与光、激素、组织特异性、昼夜节律和应激反应有关CIS.-Elements的VVMIR160s及其VvARF公司目标基因表现出较高的相似性，说明它们的功能具有一定的相似性(图5)。5.a） 是的。同样，米尔160s的启动子分析花芽龙眼表明CIS.-对光、激素和昼夜节律等刺激有反应的成分也被检测到[32.那43.］．在本作工作中，VVMIR160A / C / D / E的所有启动子区域（VVMIR160B除外）和VVARF公司含有CIS.-与各种激素反应（GA、IAA、SA、ABA、MeJA和ET）相关的元素，表明VvmiR160s与葡萄发育过程中的激素转导有关。在这些激素反应性基序中，GA反应性基序CIS.-土壤中元素含量丰富VvmiR160s型和VVARF公司，此外，还进行了瞬时表达实验和GUS活性测定VvmiR160c型和VvARF10型启动子表明他们可能是由GA积极调控，这增加了关于基本作用的进一步证据VVMIR160-VvARF公司通过GA-Signaling对葡萄开发。同样地，在启动子区域中也检测到GA响应元件的拷贝数甘氨酸最大（GmmiR160f/克/小时)以及Manihot Esculenta.（MemiR160a型)以及他们的GmARF6/8/17/18和MeARF10分别靶向基因[29那44.］．总的来说，这些结果清楚地证明了vvmir160通过调节ga信号的重要作用VVARF公司．

响应于各种VVMIR160S的GA的表达模式的表征：VvARF公司葡萄发育过程中的成对现象

miRNA家族的多个成员及其靶基因可以形成具有一定冗余和互补功能的miRNA介导的调控网络，不同的miRNA家族成员具有不同的时空表达模式[45.]. 基因表达谱的变化VVMIR160：VvARF公司葡萄开发期间的对呈现在图2中。8.．最近的研究表明，MIR160S负面调节2017年10月16日在拟南芥，番茄，龙眼和胡桃[46.那47.那48.那49.]. 然而，miR160在葡萄花和浆果发育中的调控作用尚不清楚。在本研究中，研究了不同基因成员的时空表达VVMIR160年代显示VvmiR160a/b/c型在GA介导的花卉发育期间表现出它们的表达水平显着增加（图。9.a） 是的。然而，VVARF10 / 16/17目的基因的表达趋势与miR160a / b / c．我们的结果符合林等人。[32.]展示了GA治疗诱导龙​​眼Dlo-miR160a/d型表达下调2017年10月16日在体细胞胚胎发生的中期和晚期。相似地，船突变体拟南芥幼苗与A.DS.转座子插入在3'监管区atmir160a型下调在展出atmir160a型在大肠杆菌中的表达及上调Atarf10 / 16/17对IAA治疗的反应，以及foc拟南芥突变体表现出不规则的花表型和降低的育性[17］．同样，番茄的敲毁SlmiR160用短串联靶模拟物表达(STTM160)表现为异常的花器官脱落，这与细胞凋亡的上调有关斯拉夫10A/B和SlARF17[24］．我们的结果和以上的报道清楚地表明，VvmiR160s在ga诱导的葡萄花发育中通过负调控VVARF10 / 16/17表达式。在葡萄果实中，VvmiR160a/b/c的表达谱随果实发育呈上升趋势，直到成熟时均达到高峰(图1)。8.b）同样，随着水果的发展和成熟，MiR160a的表达模式逐渐增加，蓝莓[50.］．此外，我们的时空表达的ga诱导葡萄藤显示VvmiR160d型在GA诱导葡萄花发育的早期表达上调，但在中后期表达下调，表明VvmiR160d是葡萄花发育的抑制因子（图。9.a） 是的。也，VvmiR160e型VvmiR160e在葡萄花期和浆果期的表达水平均较低，说明VvmiR160e在葡萄花期和浆果期的转换中起着次要的作用（图。9.a和b)。我们进一步进行了比较表达谱VvmiR160s型和VvARF公司利用VvmiR160-基因，研究GA处理对葡萄花/浆果发育的影响VvARF公司监管网络（图。9.a和b）。VvmiR160s的表达趋势及意义VVARF公司在GA治疗和未处理的葡萄植物下的不同阶段在葡萄葡萄开发期间非常相似，但是，GA治疗诱导这些相应基因的表达远高于未处理的对照植物中的表达水平（图。9.a） 是的。相比之下，GA处理几乎显著上调了VvmiR160s和3个基因的表达VVARF公司浆膨胀的基因（图。9.b）。值得注意的是，IAA刺激豌豆Pericarp中的GA生物合成[51.那52.]通过由一个或多个信令元素介导的过程，并且GA代谢与IAA信号相互作用，与反馈调节无关[53.]当AUX信号通路被阻断时。这些结果为进一步了解vvmir160的功能及其靶点提供了重要的信息VVARF公司在ga诱导的葡萄单性结实过程中。

研究了外源GA诱导葡萄单性结实过程中‘蔷薇’花和果实发育的形态学变化_3.应用程序。“Rosario Bianco”葡萄花和他们的vvmir160的精确序列VVARF10 / 16/17对目标基因进行了预测、克隆和验证。此外，还研究了VvARF与不同植物种的其他直系同源基因的保守性和多样性系统发育关系。所有VvmiR160s（VvmiR160b除外）和VVARF10 / 16/17结果表明，常见的顺式元件对GA有反应，这在我们的实验中得到了证实，这支持了它们在GA介导的葡萄单性结实中的作用。时空表达及相关分析表明VvmiR160a/b/c是负调控的关键因子VVARF10 / 16/17GA诱导葡萄花卉和浆果发育过程中的靶基因。负调节VVARF10 / 16/17表达的VvmiR160a/b/c型由于关键的调节因素对于GA介导的葡萄疗法至关重要，并且在理解VVMIR160s及其分子机制方面提供了重要的一步VVARF公司用于优质无籽浆果的分子育种。需要进一步的研究，以确定特定的下游基因是被相应的ARFS.在每一个过程。

植物材料和GA_3.治疗

根据前期研究和开展相关研究工作的必要性，6岁的“Rosario Bianco”葡萄(vitis Vinifera)以我国广泛栽培的优质葡萄为试材。这些植物材料是在江苏农林职业学院葡萄园，句容，中国（我们的合作伙伴，我们有一个长期的合作关系）的普通田间条件下种植的。参照生产经验和品种特点，对葡萄簇进行了50℃浸泡试验 毫克 L^− 1.遗传算法_3.（溶解在0.2％Tween-20）中，30秒，并在花序后21天在21天使用水处理的葡萄簇。GA处理的植物在治疗后9天达到开花。在不同时间点的不同治疗组的不同分支中随机收集花序和浆果样品[治疗后的不同治疗组的不同分支[0H，2小时，1,5,9,10,45和95天（0hat，2hat，1dat，5dat，9dat，10dat，45dat和95ddat）。样品用于表型特征，并将样品的另一部分立即在液氮中冷冻并储存在-80℃直至使用。

RNA提取，高分子量RNA，低分子量RNA分离和cDNA合成

使用经修饰的CTAB方法从上面提到的200mg葡萄组织中分离出总RNA [30]。用4M LiCl分离低分子量RNA（LMW RNA）和高分子量RNA（HMW RNA）。使用TAKARA公司的Poly(A) tailkit将不同阶段LMW RNA样品的混合物装载到Poly(A) tailkit中。Poly(A)-tailed LMW RNA使用T4 RNA连接酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)进一步连接到5 '适配器(5 ' - cgacugaggagacauggacugaaggaguagaaa -3 ')。然后，将这些LMW RNA与聚（a）和5'-αAdapter逆转录成miR-race克隆的CDNA。不同阶段HMW RNA样品的混合物直接转录成QRT-PCR的CDNA。在使用前，将所有CDNA储存在-80°C上。

葡萄花组织中VvmiR160s精确序列的克隆罗萨里奥·比安科

使用TAKARA公司的Poly(A) tailkit将不同阶段LMW RNA样品的混合物装载到Poly(A) tailkit中。Poly(A)-tailed LMW RNA使用T4 RNA连接酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)进一步连接到5 '适配器(5 ' - cgacugaggagacauggacugaaggaguagaaa -3 ')。然后，这些带有Poly (A)和5’-adapter的低分子量rna被miR-RACE反转录到VvmiR160序列克隆的cdna中[30.］．

vvmir160的目标预测，互补性的识别和相关参数的vvmir160:VvARF公司对

基于五个VvmiR160成员的精确序列，我们采用多重Align（BioXM软件）对这些序列进行比对，发现了两个独特的成熟序列（VvmiR160a/b和VvmiR160c/d/e）。以miRNA独特序列为基准，在葡萄转录本数据库V2中进行blast搜索(http://genomes.cribi.unipd.it/grape/）用于预测VVMIR160s的靶基因。此外，使用PSRNATarget软件识别互补性，动作模式和其他相关参数的程度（http://plantgrn.noble.org/psrnatarget/)．

利用RLM-RACE和PPM-RACE对mRNA裂解位点进行定位

为了映射miRNA介导的切割产品，我们早先改性的RLM竞赛和开发的PPM比赛用于确定其3'-和5'-末端的切割产品。根据我们之前的报告[30.]， HMW RNA已添加到Poly(A) (Ambion, Austin, TX)，并分别使用T4 RNA连接酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)连接到5 '适配器(5 ' - cgacugagcacgaggacacugacauggacugaaggaguagaaa -3 ')。然后用酚/氯仿提取和乙醇沉淀法提取Poly (A)-tailed HMW RNA和适配器连接的HMW RNA。Poly (A)-tailed HMW RNA和适配器连接的HMW RNA进一步被反向转录成PPM-RACE和RLM-RACE的cdna。扩增产物经凝胶纯化、克隆和测序，至少有8个独立克隆进行了测序。

VVMIR160S和目标的分布VvARF公司前体/染色体中的基因

VvmiR160s的前体从植物miRBase 21.0下载(http://www.mirbase.org/)．mfold在线工具（http://unafold.rna.albany.edu/)用来折叠它们的发夹结构。所有5个vvmir160和3个VvARF公司基于葡萄基因组CRIBI网站上可用的信息映射到葡萄染色体的基因（http://genomes.cribi.unipd.it/grape/)．地图使用MapInspect软件起草（http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software- mapinspect.html.)．

系统发育分析

采用MEGA version 7.0.21软件和ClustalX2软件进行系统发育分析。同源染色体的VvARF10、VvARF16、VvARF17通过NCBI数据库中的BLAST搜索标识（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi.)，使用VvARF10/16/17的氨基酸序列。采用ClustalX2进行多次比对，MEGA 7.0.21软件采用Neighbor-Joining法构建无根系统发育树，并进行1000次重复的bootstrap检验。

外显子/内含子结构的分析与分布ARFS.在9个物种

外显子/内含子组织VvARF公司利用GSDS软件(http://gsds.cbi.pku.edu.cn.)．

蛋白质结构域及其对靶的物理化学特性分析ARFS.在各种物种中

域名及结构网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/domains- 构筑物/）用于分析靶基因的蛋白质结构域及其同源物序列。然后，IBS（用于生物序列的Illustrator）软件版本1.0.3用于绘制ARF蛋白的正统结构域。此外，考虑所有靶标蛋白序列并用于进一步分析。氨基酸的数量，等电点，脂族指数，水下大平均性，通过在扩展网站上提供的工具计算推导的多肽的分子量（http://web.expasy.org/protparam/)．

9种ARF蛋白的基序组成分析

使用MEME 5.05在线计划进行ARF蛋白序列中的基序的鉴定（http://meme-suite.org/tools/meme)．MEME的优化参数采用如下：重复次数，任何;最大主题数，20;并且每个基序的最佳宽度，在6到50个残留之间。

启动子的顺式元素分析VvMIR160s和目标VVARF公司

从葡萄发生器数据库（http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/的启动子(基因上游约1500 bp)VvMIR160（VvmiR160的前体）和VVARF公司，并使用PlantCare软件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)来预测这些启动子的基序元件。

表达载体和的构造农杆菌属- 介导的烟草瞬态转换

基因启动子序列VvMIR160c和VvARF10型被孤立。使用的引物是在附加文件中描述的6.：表S4。开发pBI121-p1VvMIR160c-GUS和pbi121-P1VVARF10-GUS.构建，1.5 kB启动子区域VvMIR160c和VvARF10型是独立克隆和融合的吗格斯报告基因取代35SCaMV型pBI121双载体启动子。对pBI121-p2vvmir160c-gus.构建，1442bp启动子2片段区域VvMIR160c不包括GA响应元素（59-1500 BP）被克隆到PBI121中以取代35SCaMV型并被用来驱动格斯记者吉恩。同样，对于pBI121-P2VVARF10-GUS.构造，937 不含GA反应元件的VvmiR160c的bp启动子2片段区（564–1500 将bp）克隆到pBI121中，以取代35SCaMV型启动子和被用来驱动GUS报告基因。

一群农杆菌肿瘤术EHA105（含重组质粒）在YEB液体培养基中培养 微克 毫升^− 1.）和卡那霉素（50μgml^− 1.)．培养后，将细菌颗粒化，在悬液(10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5.6)中重悬。细菌。

然后将悬浮液调节至OD600 = 0.5，以及100μmolL^− 1.在将悬浮液用于渗透之前加入乙孢菌酮，并在室温下静置4小时。通过注射用细菌悬浮液渗透了6周龄烟草植物的叶子。使用注射针针在烟草叶中制造微小孔。然后将细菌悬浮液注入具有针刺注射器的那些微小的孔中。2 d后分别用30 μM赤霉素和50 μM赤霉素处理烟叶。均匀尺寸的叶子用于渗透实验，并重复实验三次。

格斯分析

对浸润叶片进行打孔，对浸润叶片进行组织化学GUS染色，如Jia等[54.］．然后将叶浸入乙醇中以除去CHL。使用荧光测定4-甲基蛋白酶-B-D-葡糖酸（Mug）方法测定GUS活性的定量。GUS活性的一个单位定义为每毫克可溶性蛋白质产生每分钟的4-甲基环蛋白（4-mu）。每个独立实验中的每个构建体浸润三片叶子，然后组合以检测GUS活性。

VvmiR160s基因的qRT-PCR表达分析

用于定量实时聚合酶链反应（QRT-PCR）的模板是用于多（a）的cDNA - 上面提及的小RNA。为了从逆转录的CDNA中扩增VVMIR160A / B / C / D / e，我们使用VVMIR160系列成员的精确序列作为正向引物和R16328（attCTAGAGGCCGAGGCGCGCGCGCGCGCACATG）作为反向引物[30.]. qRT-PCR采用SYBR预混料extap™ 套件（中国大连塔卡拉），使用Light Cycler®480 II（瑞士罗氏）。PCR循环条件包括95℃的初始变性步骤 °C持续30秒，然后是40秒 60周 °C 20秒和95秒 °C持续5分钟 S5.8版 srrna作为参考基因。用公式2计算相对表达水平^−ΔCT = normalized expression ratio. Each PCR assay was carried out by three biological replicates, and each replicate corresponded to three repeats of separate experiments. All primers were listed in Additional file6.：表S4。

实时聚合酶链反应VVARF公司表达

的表达VVARF10 / 16/17如前所述，通过QRT-PCR测定[30.］．逆转录产物用基因特异性引物扩增，重叠已知或预测的切割位点。使用Light Cycler®480 II进行三次反应。的施基因被用作MRNA的QRT-PCR检测中的参考基因。用公式2计算相对表达水平^−ΔCT = 归一化表达式比率。每个PCR检测分为三个生物重复。实验设置为三次重复。所有引物都列在附加文件中6.：表S4。

统计数据

ANOVA测试用于鉴定GA之间的花卉形态和基因表达的显着差异_3.-treated和未经处理的葡萄植物。星号表示GA处理的植物和各个未经处理的对照（CK）植物在每个时间点之间的显着差异，如学生的T.以及(*P. < 0.05; **P. < 0.01).

阿巴：

脱落酸

ARF：

生长素反应因子

辅助的：

生长素

AuxREs:

助线响应

颜色：

染色体

等：

乙烯

船：

在carpel的花卉器官

GA：

赤霉素

HMW RNA：

高分子量RNA

国际广告协会：

吲哚醋酸

LMW RNA：

低分子量RNA

Meja：

甲基jasmonate

开放阅读框：

开放阅读框

PPM比赛：

聚（a）聚合酶介导的3'CDNA的快速扩增

RLM-RACE：

rna连接酶介导的cDNA末端快速扩增

山:

水杨酸

SLR1码：

纤细的米饭1

STTM公司：

短串联目标模拟

作者感谢中国南京南京农业大学园艺学院提供的研究实验室设施。马云教授感谢鸟取大学、日本和埃及阿斯旺大学的合作研究工作。

基金

这项工作得到了中国科技部的财政支持（No.28YFD1000106）;江苏省自然科学基金（BK20180113和BK20160587）与中大学基础科学研究业务费独立创新重大项目（自然科学，KYTZ201602）。资金机构只提供了这项工作的实验成本和出版费用。然而，实验设计和数据收集和分析由贡献作者管理。

数据和材料的可用性

所有VvmiR160s和VvARF公司cDNA可根据要求提供。本研究中使用的所有引物和氨基酸序列在附加文件中列出3.那4.那5.和6.：表S1-S4。

从属关系

1. 南京农业大学园艺学院，中国南京210095

   张文英、关乐、韩剑、郑婷、贾海峰、宋长年、方景贵、王晨

2. 埃及81528，埃及科学学院植物学系，科学学院

   Mostafa Abdelrahman

3. 鸟取大学旱地研究中心，鸟取，680-1001，日本

   Mostafa Abdelrahman

4. 上海交通大学农业与生物学植物科学系，中国上海

   松桃酒

贡献

CW构思和设计研究，WZ收集了样品，进行了MIRNA及其靶标的表达分析，MA和SJ进行了分子机制分析。JH和TZ进行了启动子元素分析Mirnas.以及他们的目标。LG参与了补充实验和论文修改中促进剂的活性验证。CW证实了它们的卵裂作用。WZ、MA、HJ和CS进行了数据分析和图形准备。WZ写了手稿。CW、MA和JF修改了手稿。所有作者都阅读并批准了最后的手稿。

通讯作者

通信陈王．

伦理批准并同意参与

我们研究中使用的植物不是濒危物种。植物样本采集和转基因植物的研究是按照中国地方法规进行的。

同意出版

不适用。

利益争夺

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

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