OSTKPR1GydF4y2Ba在水稻花药角质层开发和花粉壁形成功能GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

在开花植物花粉壁形成过程中，孢粉素合成需要一个由酰基辅酶a合成酶(ACOS)、聚酮合成酶(PKS)和四羧基α-吡酮还原酶(TKPR)组成的保守代谢。尽管如此，这些成分在不同物种中的确切作用仍不清楚。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在这项研究中，我们对拟南芥TKPR1的同源基因OsTKPR1的功能进行了表征。功能丧失GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba延迟绒毡层降解，降低花药表皮脂质水平，和受损的乌氏体和花粉外壁形成，导致完整的雄性不育。另外，在突变体花药苯丙途径被显着地改变。本地化研究表明，OsTKPR1积累的内质网，而具体的积累GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba花药绒毡层和小孢子的mRNA表达与其在花药和花粉壁发育中的功能是一致的。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的研究结果表明：GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba是水稻花药角质层发育和花粉壁形成所必需的，为开花植物保守孢粉素代谢的生化机制提供了新的认识。GydF4y2Ba

陆生植物的花粉粒被复杂的多层细胞壁所包围，即花粉壁。花粉壁在生物和非生物环境胁迫下提供保护，并在雄性和雌性器官之间的相互作用中发挥重要作用[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．开花植物典型的花粉壁是由两个不同的层组成:外壁和内壁，花粉被沉积在外壁的表面[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．外来可以进一步分为史外（外部）和叶尾（内部），并且史外线本身也包含两层：外部构成层和构图和腰部之间的垂直常规捕获的杆状内层[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．花粉壁结构缺陷的突变体通常表现出不育性水平降低或完全丧失[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

高度雕刻的外部主要由孢子蛋白组成，其化学成分仍然是谜[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］．通常，孢子醇素是由脂肪酸和酚类化合物组成的复杂生物聚合物，通过酯或醚键共价连接[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．孢粉素前体由绒毡层细胞分泌到花粉粒表面[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba];然而，有些证据还证明了花粉谷物本身有助于孢子醇蛋白生物合成和外出形成[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．在绒毡层细胞中，孢粉素前体的新生生物合成发生在质体中，孢粉素前体的沉积在减数分裂完成后不久即开始，此时临时胼胝质壁被降解，原墨西哥素形成(第9阶段)。并在花粉有丝分裂时基本完成(第12阶段)[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．孢粉素的生物合成和沉积与绒毡层程序性细胞死亡(PCD)相一致，这种死亡发生在8a期至10期[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]，建议这两个事件之间的可能关系。未成熟或延迟的Tapetum PCD通常破坏花粉壁形成并导致男性生育的缺陷[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

最近植物的遗传和生化研究，主要来自两种模型植物GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba和GydF4y2Ba奥雅萨苜蓿GydF4y2Ba(水稻)的研究极大地增加了我们对花粉壁形成的了解[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba］．因为生物聚合物孢粉素被发现保存在开花植物、苔藓、蕨类植物甚至真菌中[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]，因此孢粉素单体的生物合成和沉积是开花植物中最古老的生化途径之一[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．与此符合的一致，参与花​​粉壁形成的相关局部基因在Dicots，单子叶，裸子植物，甚至是苔藓中，如GydF4y2BaMS2GydF4y2Ba（GydF4y2Ba雄性不育2GydF4y2Ba) /GydF4y2Ba法GydF4y2Ba（GydF4y2Ba有缺陷的花粉墙GydF4y2Ba) ［GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]，GydF4y2BaCYP703A2GydF4y2Ba/GydF4y2BaCYP703A3GydF4y2Ba[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]，GydF4y2BaCYP704B1.GydF4y2Ba/GydF4y2BaCYP704B2.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]，GydF4y2BaABCG26 / OsABCG15GydF4y2Ba（GydF4y2BaPDA1GydF4y2Ba) ［GydF4y2Ba24GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]，GydF4y2BaACOS5（酰基-COA合成酶5）/ OSACOS12 / NTACOS1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]，GydF4y2BaLAP6(少粘附花粉6)/PKSA(聚酮合酶A)/OsPKS1/NtPKS1GydF4y2Ba那GydF4y2BaLAP5 / PKSB / OsPKS2GydF4y2Ba[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]，GydF4y2BaTKPR1 (Tetraketide α Pyrone Reductase 1)/NtKPTR1/OsTKPR1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba]， 和GydF4y2Ba自动对盘及成交系统GydF4y2Ba（GydF4y2Ba夭折的小孢子GydF4y2Ba) /GydF4y2BaTDR.GydF4y2Ba（GydF4y2Ba毯变性迟钝GydF4y2Ba) ［GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．这些同源基因大多在绒毡层和/或小孢子中表达，表明有一个保守的雄性器官组织特异性调控网络控制着开花植物花粉壁的形成。GydF4y2Ba

在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，第一次活化De Novo合成的脂肪酸GydF4y2BaACOS5GydF4y2Ba生成脂酰辅酶a [GydF4y2Ba26GydF4y2Ba[然后将所得脂肪酰基COA与丙二酰-COA缩合GydF4y2BaPKSA / LAP6GydF4y2Ba和/或GydF4y2BaPKSB / LAP5.GydF4y2Ba产生α-吡酮产物[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]，这进一步减少了GydF4y2BaTKPR1GydF4y2Ba和GydF4y2BaTKPR2GydF4y2Ba生产羟化四肽化合物[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba］．该途径中的所有中间和最终代谢物，包括脂肪酰基COA，α-催化剂和羟基化四丙酮，作为孢子醇前体的重要资源。遗传和生化研究表明GydF4y2BaACOS5GydF4y2Ba那GydF4y2BaPKSA / BGydF4y2Ba（GydF4y2BaLAP6 / LAP5GydF4y2Ba）， 和GydF4y2BaTKPR1GydF4y2Ba形成孢粉素代谢GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba形成花粉壁的绒毡层[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．虽然此代谢物也被发现存在于烟草中[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]， 白饭 [GydF4y2Ba27GydF4y2Ba],苔藓[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba贯叶连翘GydF4y2Ba[GydF4y2Ba34GydF4y2BaCatoLA [GydF4y2Ba35GydF4y2Ba，需要详细的遗传和生化证据来阐明这些成分在不同植物花粉壁形成中的具体或共同作用。GydF4y2Ba

水稻基因组包含编码ACOS5 (OsACOS12)、PKSA/LAP6 (OsPKS1)、PKSB/LAP5 (OsPKS2)和TKPR1 (OsTKPR1)的基因单拷贝。这些基因中的任何一个突变都会显著影响水稻雄性的生育能力;例如,GydF4y2Baosacos12GydF4y2Ba[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba那GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]，GydF4y2BaOSPKS2.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2Baostkpr1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]是完全雄性不育的，而GydF4y2BaOSPKS1.GydF4y2Ba部分肥沃[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］．这表明ACOS5-PKSA/B-TKPR1孢粉素代谢可能在水稻和拟南芥之间保持保守。然而，也有报道指出，这种代谢物的每个成分在不同的物种中可能有不同的功能。例如,与GydF4y2BaACOS5GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba那GydF4y2BaOsACOS12GydF4y2Ba影响水稻绒毡层PCD和花药角质层的形成[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］．此外,GydF4y2BaPKSB / LAP5.GydF4y2Ba和GydF4y2BaOSPKS2.GydF4y2Ba对花药苯丙素代谢有不同的影响[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba];GydF4y2BaPKSB / LAP5.GydF4y2Ba在拟南芥中是部分雄性不育的GydF4y2BaOSPKS2.GydF4y2Ba在水稻是完全雄性不育的[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］．之前的一项研究报告称GydF4y2BaOSPTKPR1GydF4y2Ba突变体(携带T-DNA插入的第二外显子GydF4y2BaLOC_OS09G32020GydF4y2Ba）缺乏成熟花粉粒，并且不产生种子[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba，然而，这种机制GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba控制生育率仍未解决。GydF4y2Ba

在这项研究中，我们描述了一个新的突变体GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba在水稻,即GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba，这是完全无菌的，显示延迟绒毡层降解，损害乌氏体图案化，降低花药表皮型材，和有缺陷的外壁中止花粉粒。的苯丙轮廓GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba花药发生了明显的改变GydF4y2Baoslap5 / ospks2.GydF4y2Ba囊里。我们的研究表明GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba在花药角质层发育和花粉壁形成的功能，并揭示了一些有趣的假定的差异GydF4y2BaTKPR1GydF4y2Ba从拟南芥。GydF4y2Ba

分离和表征GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba突变体GydF4y2Ba

筛选A.GydF4y2Ba^60.GydF4y2BaCOγ射线辐射突变体文库在9522的背景下，一种栽培品种GydF4y2Ba粳稻GydF4y2Ba导致了雄性不育突变体的分离GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba，它是根据下面给出的结果命名的。突变体表现出正常的营养发育(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa）具有正常的花序和尖峰（图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaB，c），但是完全雄性不育，含有含碘碘化碘（I）的含量也不证明的成熟和可行的花粉颗粒的较小和苍白的花粉（IGydF4y2Ba_2GydF4y2Baki染色(图)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bad)。利用WT花粉与突变体杂交的F1植株均可育，F2植株可育性与不育性的分离率约为3:1(可育性与不育性的分离率为93:29，χGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba= 0.132,GydF4y2BaP.GydF4y2Ba > 0.05, χ^2GydF4y2Ba测试使用)，表示GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba是隐性，完全渗透的雄性无菌突变体。GydF4y2Ba

表型分析GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba

通过对不同发育阶段花药半薄切片的比较，分析了不同发育阶段花药可能存在的生殖发育缺陷GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba．可以观察到在特性发展中没有明显的缺陷GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba在四分体时期(8b阶段)，两个花药室都形成了典型的四个花药壁层和四分体(图2)。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa，f）。在第9阶段，WT微微孢子在形状（椭圆形）中是规则的，均匀地分布在花药区域中，并且Tapetal细胞变得浓缩（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab），而虽然GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba小孢子在花药室中致密性较差，形状不规则，排列紧密，绒毡层细胞未膨大(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba第10阶段，WT小孢子膨大并高度液泡化，绒毡层因降解而变得更薄(图2)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac),而GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba小孢子萎缩而没有液泡化，绒毡层似乎没有降解而继续存在(图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaH）。从第11阶段到第12阶段，在两轮有丝分裂分裂后在花药时形成的WT成熟花粉颗粒，并且Tapetum已完全降解到细胞碎片中（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bad, e)GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba已经降解，只在枯萎的花药室内留下碎片(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bai, j)。GydF4y2Ba

在第13阶段，扫描电子显微镜（SEM）在花药和花粉发育中显示出额外的缺陷。WT木头的外表面通常覆盖有厚的雕刻纳米筒（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa），虽然WT花叶酸的内表面被充满均匀分布的Ubisch体覆盖（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac).相比之下，…的外表面GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba花药被一层更薄的光滑纳米粒覆盖(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaB)，而内表面GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba花药上覆盖有少量不规则分布的乌氏体(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bad).而WT花粉粒表面出现了复杂的外壁图案(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bae，g），聚集的不规则分布式颗粒存在于缩小上GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba花粉表面（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baf，h）。SEM观察表明GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba是水稻花药角质层和花粉外壁形成所必需的。GydF4y2Ba

进一步观察早期发生的形态学改变GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba使用透射电子显微镜（TEM）的花药和微微孢子。在第9阶段，在WT花药表面存在暗染色的角质层（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa)， WT花药内表面形成了典型的乌氏体(Ubisch bodies)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab）。在这个阶段，具有常规花粉墙的WT微微孢子已从四面体释放（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bac)，在小孢子的质膜上出现了雄蕊和杆状花序(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad）。在相应阶段GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba突变体，角质层显示出弱染色（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bae)，而更少、更小的乌氏体(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baf）存在于外表面和内表面上GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba分别为小孢子。发布的GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba小孢子的花粉壁染色较弱(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bag）较少的杆状和害像结构（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaH）。在第10阶段，WT Tapetum已经退化，幼儿孢子高度真空（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bai），Ubisch体表现出具有高电子密度的特征形状（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baj）的。相比之下，GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba花药中绒毡层仍然存在，小孢子没有液泡化(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaM），ubisch体似乎是常规的，但具有较少的电子密度（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba在这个阶段，WT花粉的外壁较厚(图2)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bak)具有两个典型的、组织良好的电子密度层(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba升），而外壁的GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba花粉非常薄（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bao)具有两个薄的电子密度层(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bap). TEM结果支持半薄切片和SEM分析的结果，突出了其重要作用GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba形成水稻花药角质层，Ubisch体和花粉外来，以及及时绦虫降解。GydF4y2Ba

基于地图的克隆GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba

这GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba该基因首先被定位在第9染色体上的两个indel分子标记chr9-3485和chr9-6308之间，最后被定位在69.5和92.1厘米器官(CMs)之间。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。使用高通量重新测序技术和PCR，在第四个外显子中鉴定了15个核苷酸缺失GydF4y2BaLOC_OS09G32020GydF4y2Ba，这将导致5种氨基酸(丝氨酸、亮氨酸、丝氨酸、组氨酸和谷氨酸)的去除，其中一种氨基酸由脯氨酸转变为谷氨酰胺(图2)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab）。GydF4y2BaLOC_OS09G32020GydF4y2Ba之前注释为GydF4y2BaOsDFR2GydF4y2Ba(Dihydroflavonol-4-reductase-like protein)的翻译结果:GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］．用纯合子进行等位基因检验GydF4y2Baostkpr1GydF4y2BaT-DNA插入突变体PFG_2B-00257证实突变GydF4y2BaLOC_OS09G32020GydF4y2Ba几乎肯定会导致发育缺陷GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1）GydF4y2Ba．GydF4y2Ba这GydF4y2Baostkpr1GydF4y2Ba突变体显示出类似的生殖缺陷表型GydF4y2BaOstkpr1-2，GydF4y2Ba即完全雄性不育，有缺陷的花药角质层和异常的花粉外壁(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S1)。GydF4y2Ba

表达式模式GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba

在Silico分析中使用公开可用的微阵列数据库（GydF4y2Bahttp://ricexpro.dna.affrc.go.jp/data-set.html.GydF4y2Ba)透露,GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba在早期发育阶段的分子中专门表达（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：图S2）。这种数字表达式模式GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba通过对WT植株不同发育阶段花药及其他组织的定量RT-PCR验证，结果表明GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba只有在第9阶段9和10的黑色中只能检测到表达（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Baa).精确的时空表达模式GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba用WT花药切片进行原位杂交进一步证实，其中GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba信号主要在小孢子中观察到，在绒毡层中也有少量信号。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab, c)。这些表达结果证实了这一点GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba与水稻花药和花粉的早期发育密切相关。GydF4y2Ba

OSTKPR1蛋白的亚细胞位置GydF4y2Ba

拟南芥GydF4y2BaTKPR1，OSTKPR1的正交蛋白质先前被据报道是孢子醇蛋白质代谢物的重要组成部分，其在翅膀细胞的ER中，以影响孢子醇蛋白生物合成和花粉形成[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba］．鉴于这两种蛋白质（使用的Clustal X 63％同一性揭示的相似性;附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：图S3）和两者花粉外部形成的相当不足GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba和GydF4y2Batkpr1GydF4y2Ba突变体，我们考虑了OSTKPR1蛋白是否可能本地化到ER。为了测试这个假设，使用共聚焦显微镜观察GydF4y2Ba烟草benthamianaGydF4y2Ba在CaMV35S启动子的控制下，瞬时转化OsTKPR1-GFP的烟草叶片。结果证实了OsTKPR1-GFP的GFP信号主要在er样结构中观察到(图1)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Bad).进一步验证OsTKPR1蛋白的ER定位GydF4y2Ba农杆菌GydF4y2Ba介导的共转化，显示出与ER标记CD3-959的OSTKPR1-GFP信号重叠[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba标记为mcherry（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaF）。GydF4y2Ba

减少角质层脂质成分GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba花儿GydF4y2Ba

异常的花药角质层和花粉外壁GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba花药建议突变体可以是用于孢粉和角质脂质的前体的生物合成有缺陷的。为了评估这一点，蜡和角质单体在WT和GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)和气相色谱-火焰离子化检测(GC-FID)测定第12阶段的花药[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］．结果表明，蜡和角质单体水平均显著降低GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba与野生型的花药比较(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Baa).蜡的总量GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba0.061μg /毫米吗GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba，与WT相比，约30％的减少（0.093μg/ mmGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba)(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba一种）。这减少了总蜡含量GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba花药主要是由于一个显著减少重大水稻花蜡组分，例如脂肪酸和饱和的烷烃，例如，尽管链烯烃（C29：1，C31：1，C35：1）的量和固醇（菜油甾醇和豆甾醇）分别增加（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bac;附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba:表S2)。WT中检出的角质单体总量为0.372 μg/mmGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba，这也反映出检测到的浓度降低了30%GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba（0.265μg/ mmGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba)(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba一种）。Cutin单体的还原是由于脂肪酸和ω-羟基化脂肪酸水平显着降低，尽管其他2-羟基化脂肪酸的水平（2HFA，包括长度为C21：0，C22：0，C24：0增加，C25：0）和阿魏酸（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2BaB;附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba:表S3)。鉴于水稻绒毡层利用共同的生物合成途径提供花药角质层和孢粉素的前体[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba，我们的化学分析表明GydF4y2BaOsTKPR1-2GydF4y2Ba在水稻花药角质层和花粉外壁形成的脂质前体合成中起重要作用。GydF4y2Ba

在改变苯丙代谢GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba花儿GydF4y2Ba

以往的研究报道，孢粉素代谢的成分，如PKSB/LAP5和OsPKS2，也参与苯丙代谢，为花粉壁的形成提供酚前体[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］．为了研究OSTKPR1功能的丧失是否也具有对苯丙醇丙二醇代谢的影响，为来自野生型和野生类型的第11阶段的阶段的提取物产生酚类谱GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba使用未标准的UHPLC-MS / MS方法。该分析总共确定了238个代谢物;其中，67是黄酮类化合物，22个是羟基氨基铵衍生物。GydF4y2Ba

当着眼于苯丙素途径，苯丙氨酸的水平（该为苯丙前体），柚皮素查耳酮，柚皮素（在苯丙素途径重要中间代谢产物），山奈酚-3-Oglucoside和麦黄酮-O-hexoside-deoxyhexoside（糖缀合衍生物下游代谢物）在突变体花药降低。与此相反，木犀草素，二氢槲皮素的水平（芹菜素和槲皮素的下游代谢产物的糖缀合的衍生物，分别地）均显著增加在GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba突变体花药(无花果。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.的抑制作用GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba在花药上，苯丙素途径不同于在GydF4y2BaOSPKS2.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]，但类似于GydF4y2BaPKSB / LAP5.GydF4y2Ba或GydF4y2BaPKSA / LAP6GydF4y2Ba[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]，表明个体孢子蛋白代谢组分的破坏可能对开花植物中的苯丙二醇代谢产生不同的影响。GydF4y2Ba

在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，“孢粉素代谢子”由ACOS5-PKSA/B-TKPR1组成，在花粉壁形成中起重要作用[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．虽然发现这种古老的梅德隆存在于许多植物中，包括烟草和稻米[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]，越来越多的证据强调双子叶和单子叶之间各成分的功能既保守又多样化[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba37GydF4y2Ba］．在这项研究中，我们描述了GydF4y2BaOsTKPR1，GydF4y2Ba的orthologueGydF4y2Ba拟南芥TKPR1GydF4y2Ba，揭示了其在水稻雄性生殖中的重要作用。我们的结果证实了守恒函数GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba在花粉壁形成[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba并突出了绒毡层PCD、花药角质层图案形成和乌氏体形成的潜在附加功能。GydF4y2Ba

OsTKPR1-2GydF4y2Ba对于花药角质层发育和花粉外来形成是必不可少的GydF4y2Ba

花药特定的GydF4y2BaTKPR1GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba最初被认为与类黄酮通路有关，但后来发现作用于GydF4y2Ba繁荣正义党GydF4y2Ba，催化由PKS产生的四烷基酯的羰基碳基，从而在孢子蛋白形成中发挥作用[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba］．在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba那GydF4y2BaTKPR1GydF4y2Ba对男性生育能力很重要，而GydF4y2Batkpr1GydF4y2Ba突变体显示完全无组织的薄外壁，没有茎柄和顶盖，但正常的花药表面[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba］．在水稻中，OsTKPR1蛋白表现出与烟草TKPR1蛋白相同的酶活性，参与四羧酸的还原GydF4y2Baostkpr1GydF4y2Ba突变体不产生成熟花粉或种子（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba：图S1）[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］．在这项研究中，我们发现，除了有缺陷的外壁（图GydF4y2Ba4.GydF4y2Bag，h），GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba突变体还显示有缺陷的花药角质层和Ubisch体（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab、d;无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baf），表明GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba可能有助于形成花药表面和花粉壁。尽管由于组织收集困难而没有直接分析第9阶段和10阶段，但第11期的化学分析与细胞学观察一致，这揭示了花药的脂质水平（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）在突变体中显着改变花药酚醛型（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.这些结果与之前在水稻中发现的花药角质层和花粉外壁具有共同的脂质和酚类代谢途径的结果一致[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．的时空表达模式GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba在绒毡层和小孢子中(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab, c)，及其类似的ER定位(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)至TKPR1或NtTKPR1 [GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba为…提供进一步的支持GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba在花药和花粉发育中。GydF4y2Ba

OsTKPR1-2GydF4y2Ba可能参与了藏子曲线劣化GydF4y2Ba

花药角质层和花粉壁的形成成功很大程度上取决于绒毡层的降解及时和绒毡层降解通常导致雄性不育性的缺陷花药角质层和花粉壁[中断GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．虽然GydF4y2BaTKPR1GydF4y2Ba绒毡层降解未见报道GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba或烟草[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba，我们的数据表明GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba有助于水稻绒毡层的降解(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)，这与的时空表达模式是一致的GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba信使rna(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)，在绒毡层降解初期[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．额外的证据表明，孢子醇蛋白代谢物的其他组分可能会影响水稻中的Tapetum PCD。例如，最近的一项研究揭示了这一作用GydF4y2BaOsACOS12GydF4y2Ba通过细胞学和TUNEL分析的Tapetum PCD [GydF4y2Ba12GydF4y2Ba，这显然不同于它的同系物GydF4y2BaACOS5GydF4y2Ba在拟南芥GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]或GydF4y2BaNtACOS1GydF4y2Ba在烟草(GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］．相反，没有报告的效果GydF4y2BaOSPKS2.GydF4y2Ba或GydF4y2BaOSPKS1.GydF4y2Ba在米饭中的Tapetum pcd [GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

潜在的机制GydF4y2BaOsTKPR1’GydF4y2Ba在本研究中未调查绦虫降解的功能。它可能是GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba在拟南芥和烟草中发挥类似的作用，但在以前的研究中被忽视;绒毡层PCD中孢粉素代谢组分的作用可能在单子叶中更为突出。然而，如果没有额外的证据，也有可能是绒毡层的延迟降解GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba是一种间接效应。GydF4y2Ba

孢子蛋白代谢组分之间不同的相互作用影响水稻男性生育率GydF4y2Ba

在孢粉素代谢过程中，质体中重新合成的脂肪酸被修饰GydF4y2BaCYP703A2 / OsCYP703A3GydF4y2Ba[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba产生羟化脂肪酸，然后由GydF4y2Ba这些“可信赖医疗组织”GydF4y2Ba（GydF4y2BaACOS5 / OsACOS12 / NtACOS1GydF4y2Ba)生成脂酰辅酶a [GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］．脂肪酸酰辅酶a首先被缩聚GydF4y2Ba繁荣正义党GydF4y2Ba（GydF4y2BaPKSA / LAP6 / OsPKS1GydF4y2Ba和GydF4y2BaPKSB / LAP5 NtPKS1 / OsPKS2GydF4y2Ba) ［GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba[然后，将得到的三杯和四丙酮（也称为α-吡喃酮）GydF4y2BaTKPRGydF4y2Ba（GydF4y2BaTKPR1 / OsTKPR1 / NtTKPR1GydF4y2Ba)产生孢子花粉素前体，如羟基化四羧酸和仲醇[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba］．在GydF4y2Ba拟南芥,GydF4y2BaACOS5在Tapetum的ER中直接与PKSA，PKSB和TKPR1相互作用以形成多酶关联[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．ACOS5也与CYP703A2相互作用[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba，是一种保守的酶，参与花药角质层和花粉外壁形成前体细胞的生物合成[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．在GydF4y2Ba芸苔，GydF4y2Babnpksb直接与bnpka和bnacos5交互，但不会与bntkpr进行互动[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．值得注意的是，BNPKSA和BNPKSB之间的相互作用尚未向其正端申报GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba．类似地，在水稻和烟草中尚未报告这些个体代谢组分之间的相互作用[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba］．尽管需要进一步研究，但这些差异可能表明在不同植物系统中不同代谢组分之间的相互作用具有一定程度的灵活性。GydF4y2Ba

遗传证据还表明了代谢组分的作用的专业化程度。这GydF4y2Baacos5, osacos12GydF4y2Ba和GydF4y2Bantacos1.GydF4y2Ba突变体均产生花粉，显然缺乏外部[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba),但与GydF4y2BaACOS5GydF4y2Ba和GydF4y2Bantacos1.GydF4y2Ba那GydF4y2Baosacos12GydF4y2Ba显示其他缺陷，包括花药光滑，花药角质层减少[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]、异常乌氏体及绒毡层降解延迟[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba］．表达式GydF4y2BaOsACOS12GydF4y2Ba在…的控制之下GydF4y2BaACOS5GydF4y2Ba启动子部分恢复男性生育率GydF4y2BaACOS5GydF4y2Ba突变体(GydF4y2Ba36GydF4y2Ba，表明至少有一定程度的功能保护。此外,虽然GydF4y2Bapksa / lap6GydF4y2Ba和GydF4y2BaPKSB / LAP5.GydF4y2Ba单突变体产生具有不规则外壁图案的可育花粉，双突变体完全雄性不育，花粉缺乏外壁沉积[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba］．相比之下，烟草植株表达GydF4y2BaNtPKS1-RNA干扰GydF4y2Ba[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba的单一突变体GydF4y2BaOSPKS2.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]完全不育，产生败育的花粉，花粉外壁紊乱，花药表面异常。GydF4y2BaOSPKS2.GydF4y2Ba的推动下GydF4y2BaPKSB / LAP5.GydF4y2Ba启动子可以部分拯救异常外出图案GydF4y2BaPKSB / LAP5.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

支持功能多样性的其他证据来自代谢成分的体外活性。ACOS属于4-香豆酸辅酶a连接酶(4CL)家族，但体外酶学分析表明ACOS5、NtACOS1和OsACOS12不是4CL，而是脂肪酰基辅酶a合成酶。这些酶的首选底物分别是羟基化脂肪酸(C8 ~ C18)、脂肪酸(C10 ~ C16)和脂肪酸(C18:1) [GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba］．植物特异性III型PKS被认为具有查尔酮合成酶(CHS)活性，但体外CHS活性测试证实PKSA/B (LAP6/5)、NtPKS1和OsPKS1不是CHS酶，而是真正的聚酮合成酶。这些酶分别以不同碳长C6 ~ C12、C10 ~ C16、C16 ~ C18的脂酰辅酶as为优先底物，生成相应的α-吡喃脂[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］．虽然ACOS和PKS中GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，烟草和稻具有类似的功能，他们在底物偏好明显不同。不幸的是，在体内ACOS5的活动/ NtACOS1 / OsAOC12尚未上报和代谢分析未能确定开发花药[芘GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]， 意思是GydF4y2Ba在Planta.GydF4y2Ba仍然确定ACOS和PKS的底物。以前的研究表明，NTTKPR1和OSTKPR1都没有DFR活性，因为NTTKPR1或OSTKPR1不能代谢包括二氢羟戊醇和二氢核霉素的典型底物[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］．但是，Dihydroquercetin的显着积累GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba细胞质(无花果。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba)可能提示OsTKPR1在水稻体内具有DFR活性。另外，考虑到几种2-羟基化脂肪酸和阿魏酸在花药角质图谱中的显著积累(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba），既有2-羟基化脂肪酸和阿魏酸也可以是OSTKPR1的体内底物是合理的。我们前期的研究表明，阿魏酸在花药角质层和花粉孢粉素的聚合中起重要作用[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．由于OSTKPR1活性丧失，脂族2-羟基化脂肪酸与突变体的芳族脂肪酸之间的缀合物不能降低到相应的仲醇中，因此在去聚合之后，相应的个体单体显着积聚。在此时，我们无法提供额外的证据，以区分以上的假设，这使得在未来的研究中进一步调查。GydF4y2Ba

对于metabolon组件的不同功能的最终证据来自对苯丙烷类代谢这些蛋白质的不同影响。从这项研究和其他结果GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba建议苯丙醇丙醇代谢与植物男性生育率的脂质代谢同样重要。黄酮类化代谢的抑制作用GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba花药也被报道GydF4y2Bapksa / lap6GydF4y2Ba和GydF4y2BaPKSB / LAP5.GydF4y2Ba突变体(GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．相比之下，类黄酮代谢GydF4y2BaOSPKS2.GydF4y2Ba被激活显著[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］．因此，虽然GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba是男性无菌，类似于GydF4y2BaOSPKS2.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]，GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba花粉面和花药内表面均不同GydF4y2BaOSPKS2.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba），这可能是这两种蛋白质在类黄酮途径上的不同效果的结果（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba) ［GydF4y2Ba28GydF4y2Ba］．此外，不同的蛋白质差异地影响了阿基酸代谢。据报道，自由芳族脂质酸水平增加GydF4y2BaOSPKS2.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]，而聚合阿魏酸的水平被发现在GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Bab）。这种差异可能导致观察到的不同表型GydF4y2BaOSPKS2.GydF4y2Ba和GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）GydF4y2Ba．GydF4y2Ba我们前期的研究表明，阿魏酸在花药角质层和花粉孢粉素的聚合中起重要作用[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

总之，我们的研究表明，GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba是一个保守的孢子醇蛋白质蛋白质组分，但对于大米中的男性生育能力很重要。其中一些独特的功能可以构成单子叶和二十种之间的花粉发育的未来比较研究的基础。GydF4y2Ba

我们的功能表征结果表明GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba的同义词GydF4y2Ba拟南芥TKPR1GydF4y2Ba，对于大米的男性生育能力是必不可少的。GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba它不仅影响花粉的形成，而且影响花药角质层的形成，为研究开花植物保守的孢粉素代谢提供了新的思路。GydF4y2Ba

植物材料和分子克隆GydF4y2BaOsTKPR1-2GydF4y2Ba

wt和GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba（9522背景，GydF4y2Ba粳稻GydF4y2Ba)杂合水稻种子来源于本实验室种子库，T-DNA插入系PFG_2B-00257 (GydF4y2Baostkpr1GydF4y2Ba）杂合子种子是Clive Lo教授（香港大学）的礼物。所有水稻植物，包括野生型（wt），GydF4y2Baostkpr1GydF4y2Ba,GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba厂，上海交通大学（31.03°N，121.45°E），上海，中国的稻田中生长。如先前所述进行图位克隆[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba[F2群体来自之间的十字架GydF4y2BaOSTKPR1-2GydF4y2Ba及广路爱4 (GydF4y2BaindicGydF4y2Ba）.用于映射的所有引物都列在附加文件中GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba:表S4。GydF4y2Ba

表型观察GydF4y2Ba

使用尼康E995数码相机和Leica M205A显微镜，捕获整个植物和生殖器官的图像。如前所述进行I2-Ki染色，半薄横截面，SEM（扫描电子显微镜）和TEM（透射电子显微镜）的常规分析[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］．对水稻花药发育的各个阶段进行了分类[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

定量RT-PCR分析GydF4y2Ba

使用Trizol Reagent（天根，北京，中国）与各种水稻组织中分离出总RNA，并用纳米二维1000分光光度计（Thermo Scientific，UT）分析，用于评估质量和数量。对于RT-PCR，使用GDNA橡皮擦的Primescript TM RT试剂盒从总RNA转录的第一链cDNA（完全实时; Takara）。使用实时PCR系统（BIO-RAD C1000 CFX96）用IQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）进行实时RT-PCR。将米肌动蛋白基因用作内部对照。用于量化表达的引物GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba在附加文件中列出GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba:表S4。GydF4y2Ba

原位杂交GydF4y2Ba

所述杂交的探针的RNA杂交和免疫学检测是按照所述协议如先前执行[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba］．用于生成原位杂交探针的引物在附加文件中列出GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba:表S4。GydF4y2Ba

亚细胞定位GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba

在烟草中的瞬时表达(GydF4y2Ba烟草benthamianaGydF4y2Ba),全身GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2BaCDS是使用OsTKPR1CDS-F和OsTKPR1CDS-R PCR扩增（附加文件GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba：表S4），并引入了用BGL II消化的1301-GFP载体和SPE I，以产生1301-35sGydF4y2Ba_箴GydF4y2Ba：OSTKPR1CDS-GFP。将GFP构建体转化为菌株GV3101，并渗入4周龄烟草植物的叶子中。经过两天的黑暗培养，烟草叶片表皮，1301-35sGydF4y2Ba_箴GydF4y2Ba:将OsTKPR1CDS-GFP安装在水中，在共聚焦显微镜(徕卡TCS SP5)下观察。GydF4y2Ba

花药和Cutin分析GydF4y2Ba

花药蜡和角质分析如前所述[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．如前所述，通过将计算的制剂表面积与制剂干重（附加文件）（附加文件）（附加文件）来进行制剂表面的测量GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba:图S4) [GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

代谢物分析和数据分析GydF4y2Ba

收集了4个11期水稻花药的生物复制，立即在液氮中冷冻，并进行冻干，进行代谢组学分析。每个样品10mg花药粉末的甲醇提取物用UHPLC-MS/MS分析，如前所述[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba］．代谢物鉴定和数据分析如前所述[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

GC-FID:GydF4y2Ba

气相色谱-火焰电离检测GydF4y2Ba

气相:GydF4y2Ba

气相色谱分析-质谱法GydF4y2Ba

纤毛运动:GydF4y2Ba

程序性细胞死亡GydF4y2Ba

扫描电镜:GydF4y2Ba

扫描电子显微镜GydF4y2Ba

TEM：GydF4y2Ba

透射电子显微镜法GydF4y2Ba

作者感谢瞿国润博士和罗倩博士在花药角质层分析方面的帮助;感谢罗志金和陈明姣对突变体的筛选和F2群体的定位。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

中国博士后科学基金资助项目(2017m611545);国家自然科学基金项目(31430009,31322040,31271698);国家重点研发计划项目(no . 2016YFD0100804, no . 2016YFE0101000);科技部重点基础研究发展计划项目(no . 2013 CB126902);教育部创新研究团队和111项目(批准B14016)。资助机构在研究的设计、入组患者的选择、数据的审查和解释、手稿的准备和批准中没有发挥作用。GydF4y2Ba

数据和材料的可用性GydF4y2Ba

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发布的文章及其补充信息文件中。基因序列GydF4y2BaOSTKPR1.GydF4y2Ba沉积在植物血红素12中（GydF4y2Bahttps://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmlGydF4y2Ba），保藏号GydF4y2Baloc_os09g32020。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 上海交通大学 - 上海交通大学农业与卫生学院，上海交通大学生物技术学院，上海娇塘大学，上海，200240GydF4y2Ba

   徐大为，屈淑英，张大兵，梁万奇，史建新GydF4y2Ba

2. 上海交通大学生命科学与技术学院博士后科研流动站，上海200240GydF4y2Ba

   大北徐GydF4y2Ba

3. 阿德莱德大学农业、食品与葡萄酒学院，澳大利亚阿德莱德，SA, 5064GydF4y2Ba

   马修·塔克，张大兵GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

DWX，WQL，DBZ和JXS参与了实验的设计并分析了数据。DWX进行了实验。SYQ帮助了基于地图的突变体的锥体。DWX，MRT和JXS写了稿件。所有作者都已读，编辑和批准本文件的出版物。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba施建新GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。GydF4y2Ba

重印和权限GydF4y2Ba