MAX1型细胞质雄性无菌向日葵线粒体基因组的表征

背景

已鉴定出70多种细胞质雄性不育(CMS)类型直升机，但只有不到一半的人进行了线粒体组织研究。此外，只有两个CMS来源——PET1和PET2发表了完整的线粒体序列。研究表明，其他向日葵CMS来源，如MAX1，与PET1和PET2类型有显著差异。然而，对于MAX1诱导细胞质雄性不育可能的分子原因尚未提出。在本研究中，我们研究了HA89 (MAX1) CMS向日葵系线粒体基因组与可育线粒体基因组的结构变化。

结果

在HA89 (MAX1) mtDNA中发现了8个重大的重组事件:1个110 kb的倒置区，4个分别为439 bp、978 bp、3183 bp和14296 bp的缺失，3个分别为1999 bp、5272 bp和6583 bp的插入。这些重排导致HA89 (MAX1)线粒体基因组的功能改变，导致完全消除orf777以及新奥布的外观 -orf306、orf480 orf645和orf1287．将CMS源PET1和PET2的mtDNA与MAX1进行比对，发现它们的线粒体基因组序列具有一些共同的重组特征。

结论

新的开放阅读框架orf1287，代表着一种嵌合体ATP6.基因，可能在向日葵MAX1 CMS表型形成中起关键作用，而其他线粒体重组对CMS发育的贡献似乎微不足道。

杂交种子生产用于交叉授粉的作物植物使细胞质雄性不育（CMS）最受欢迎的农业特征之一[1］．已鉴定出70多种细胞质雄性不育型直升机［2]但几乎所有向日葵混合动力车目前都是基于CMS - PET1的单一来源，50年前由Leclercq发现[3.]在一个间之间的杂交中向日葵petiolaris坚果和栽培向日葵 -h . annuusL.这种遗传均匀性可导致产量和抗病性降低[4，5］．然而，在分子水平上没有充分研究潜在的CMS（CMS细胞型）的新来源，这提出了一种严重的障碍，以便他们引入商业杂交育种[6］．

CMS现象提供了一种方便的模型，用于研究核 - 细胞质相互作用及其在花粉发育中的作用[7，8，9］．核雄性不育仅由核基因控制，而细胞质不育则是雄性不育细胞质与核不育因子相互作用的结果[10.，11.］．CMS的核控制是通过的射频恢复生育能力的基因[12.］．

通过线粒体DNA的结构重排（MTDNA）的结构重排形成细胞质雄性不育的遗传基础[12.，13.，14.］．CMS系mtDNA中新的嵌合ORFs是由已知的功能性线粒体基因与非特征DNA序列融合而形成的[1，12.，15.］．例如，一个新的开放阅读框架(orfh522)出现在3 '侧翼区域ATP1.由于11-kb反转和5-kB插入，在向日葵的CMS PET1中编码线粒体F1 ATP酶的α亚基的基因。16.，17.］．这orfh522是和ATP1.基因作为多函数mRNA [18]并翻译成CMS特异性16-KDA-蛋白[19］．向日葵另一种CMS类型PET2的分子基础最近被研究[20.，21］．两个CMS类型（PET1，PET2）都是从间隙之间的缺点中获得的H. Petiolaris.和耕地向日葵h . annuus［2，22］．然而，PET2 mtDNA的结构重排导致新的开放阅读框架的出现，与CMS-PET1不同。在PET2线粒体序列中检测到多个重排:2次易位(27.5 kb和106.5 kb)， 2次缺失(711 bp和3780 bp)，以及5050 bp和15885 bp插入[20.］．其中一些线粒体基因组重组导致了新型orf的形成(ORF645.，orf2565 orf228,和orf285)，具有CMS PET2特异的转录活性。有人建议ORF228（orf231包括终止密码子）和orf285（orf288包括终止密码子)，被嵌合ATP9.ORFS，可以是PET2 CMS表型开发的主要驱动程序[20.，21］．减少两种ORF的副转录物可以在生育率恢复的杂交种子的波状物中进行特异性地检测，支持它们在CMS表型中的作用[21］．

除PET1和PET2外，其他CMS类型的向日葵也较差。据我们所知，只有一个对电池基因组织组织的一个比较研究，包括28种CMS类型的向日葵[23］．也有一些独立的尝试分析MAX1的mtDNA [24，25]和pef1 [26，27] CMS类型。调查表明，MAX1 CMS源与PET1和PET2 MITOTYPES显着不同[23，24，25］．因此，最初通过一年生向日葵(Helianthus Annuus.(L.)为多年生种Helianthus maximiliani施克拉德[28]，探索不足，特别感兴趣。

在本研究中，我们研究了HA89（MAX1）CMS向日葵线的线粒体基因组的结构变化，并确定了MAX1型型肌肉型中雄性不育的可能原因。

植物材料

CMS线HA 89（MAX1）以及具有正常细胞质的肥沃线HA 89从N.I.Vavilov植物遗传资源（Vir，Russia）的遗传收集中获得。在以下生长条件下，在生长室KBWF 720（德国粘合剂，德国）在经常灌溉的盆中种植了向日葵植物：26°C（78.8f）温度，70％湿度和10/14小时黑暗/光循环。对于DNA和RNA操纵，我们使用来自五种植物的叶组织，其在同一生长阶段并具有最大的表型相似性。

线粒体DNA提取，基因组文库构建，NGS测序

我们将细胞器分数与14天老向日葵幼苗的叶片减少的核DNA提取，如Makarenko等人所述。［29］．根据制造商的协议，使用PhytoSorb试剂盒(Syntol，俄罗斯)进行DNA分离。NGS文库使用Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina, USA)，按照Illumina的样品制备方案制备。用美国Invitrogen公司的Qubit荧光仪和qPCR检测文库的浓度。使用美国安捷伦生物分析仪2100测定片段长度分布。NGS测序库被稀释至10pm浓度，使用High Output v2试剂盒(Illumina, USA)在NextSeq 500测序仪上进行测序。共产生10174,497,150 bp的配对reads。

有丝分裂基因组组装和注释

读取的质量是用FASTQC进行的（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)．使用Trimmomatic软件对适配器派生的低质量(Q-score低于25)读取进行修剪[30.］．使用黑桃基因组汇编程序V 3.10.1 [31］．高覆盖(深度> 100)contigs然后根据支架和桥contigs的存在手工组装。使用领结2对组装的基因组序列进行初步测序，进行验证[32］．组装的基因组使用爆炸与参考向日葵线粒体基因组（NC_02337.1）对齐。通过PCR验证发现的重排。引物序列在附加文件中呈现1．线粒体基因组用glimmer 3.02b注释[33]和爆炸工具。使用Orffinder鉴定潜在的ORFS（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder.)．使用OGDRAW工具生成图形基因组图[34］．使用TMHMM Server v.2.0预测跨膜域（在线提供：http://www.cbs.dtu.dk/services/tmm-2.0/)．我们利用Match分析了转录因子结合位点(TFBS)的分布[35]和cisexpress [36，37］．CMS线HA89（MAX1）的完整线粒体序列已被沉积在加入号MH704580.1下的Genbank。

参考基因组

HA89 (MAX1)与HA89可育系基因组进行了比较https://doi.org/10.6084/m9.figshare.7265648.v1）;稍后将沉积该序列沉积在NCBIGegank。在我们的分析中，我们使用来自Ha89的肥沃线的公开的线粒体基因组的位置由两个核苷酸 - HA412（NC_023337.1）。

RNA提取和qRT-PCR

用硫氰酸胍-苯酚-氯仿试剂kit - ExtractRNA (Evrogen, Russia)提取叶片总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，美国)和Qubit荧光仪(Invitrogen，美国)测量RNA质量和浓度。按照制造商的说明，用DNAse I(赛莫Fisher Scientific，美国)处理0.5 μg总RNA。利用随机引物和MMLV RT试剂盒(Evrogen，俄罗斯)合成cDNA。qPCR采用EvaGreen dye (Syntol, Russia) PCR试剂盒在Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Australia)上进行。引物序列在附加文件中呈现1．

我们组装了MAX1细胞质不育型HA89向日葵细胞系的完整线粒体基因组。HA89 (MAX1)的主染色体长度为295,586 bp(图2)。1)．HA89 (MAX1)线粒体基因组比HA89育性类似物线粒体基因组短5361 bp。与HA89可育基因组相比，HA89 (MAX1)线粒体基因组出现了几次重排。我们已经鉴定了HA89 (MAX1) mtDNA的8个重要重组事件:一个大的倒置区域，4个缺失和3个插入。

通过对HA89 (MAX1)及其肥沃类似物的比较分析，确定了一个倒置的区域，长度约为110 kbp。这一重排包括被orf873和ATP8并且在图1中突出显示。1．我们要强调的是，这种重排覆盖了整个线粒体基因组的30%以上。这种巨大的重排也与大多数已确认的缺失和插入有关。与HA89可育系相比，HA89 (MAX1)有4个长缺失(超过100 bp): 439 bp、978 bp、3183 bp和14296 bp。除最小的缺失(439 bp)外，所有的缺失都与这个110 kb的区域相关。该978 bp缺失位于MAX1特异110 kb重排的3 '区侧翼。将这一缺失与向日葵可育系线粒体基因组图进行匹配，我们确定它位于基因之间NAD4L.和ATP8(HA89可育线粒体的35559 - 36537位)。这个区域的线粒体基因组通常编码orf777。因此978 bp的缺失导致缺失orf777在HA89 (MAX1)线粒体基因组中。另外两个缺失(3183和14296 bp)也发生在MAX1线粒体基因组的110 kb区域内。与HA89可育系相比，这两个缺失均位于基因间区域，不直接影响编码序列。3183 bp的缺失定位于atp6-coxII(HA89可育mtDNA的272,051-275,233个位置)。14296 bp的缺失主要影响向日葵mtDNA -的大重复区域coxII-nad2（286,492-300,787位肥沃的线粒体中的位置）。最小的删除（439bp）也属于MTDNA的大重复基因 -nad4-ccmB（56,166-56,604位HA9肥沃MTDNA中的位置）。

我们还检测到HA89（MAX1）CMS线中的几个插入。399,5272和6583 BP分别发现了三个长（> 100bp）插入。最小的一个（1999年BP）在非基因区域nad4-ccmB，与439 bp的缺失位点重合。因此，1999 bp的插入和14296 bp的mtDNA大重复区域的缺失可以连接起来。一方面，插入mtDNA重复序列的一个拷贝会破坏mtDNA分子的重组，最终导致线粒体基因组中另一个重复序列的消失。另一方面，一个重复区域的副本的初始删除会使剩余的副本更容易发生结构变化。1999 bp的插入与向日葵叶绿体DNA的反向重复区域具有100%的相似性。这种插入不会导致新的开放阅读框架的形成;然而，它包括一部分rrn23基因。5272 bp的插入与另一个缺失位点(3183 bp)共定位atp6-coxII并构成了包含110 kB倒置区域的重排部的一部分。5272 BP插入导致单个大（超过300 bp）新的开放阅读框架 -ORF645.．我们检测到转录活动ORF645.在MAX1 CMS系列通过RT-QPCR。在HA89（MAX1）基因组中鉴定的最大插入（6583bp）是在110kb重排部的5'侧翼区域中的定位orf873和NAD4L.(无花果。1)．6583BP插入包括1233bp 99％与线粒体基因组的另一部分相同（MAX1 mtdna的205,493-206,725个位置），产生该线粒体区域的重复。重复的区域包括局部序列ATP6.基因。6583 BP插入导致嵌合开放阅读框架orf1287．这orf1287530 bp(在5 '端)与760 bp(在3 '端)的未知序列的融合是相同的吗ATP6.．这orf1287将用局部同源性编码429个氨基酸的细长蛋白质与ATP6。嵌合ATP6.本抄本orf1287在QPCR中被检测到雄性不育HA9（MAX1）系列，但不在肥沃的线中。除了orf1287,我们预测在6583 BP插入中有两个潜在的ORF -orf306和ORF480。搜索这些ORF中的跨膜域显示没有跨膜螺旋orf306,但是一个可能的膜相关域ORF480（预测机会约为50％）和七个跨膜螺旋orf1287(无花果。2)．

通过对转录因子结合位点(transcription factor binding sites, TFBS)的分析，发现TBFS在启动子区域的分布存在显著差异ATP8．HA89（MAX1）CMS启动子是166 bp长，而HA 89肥沃的线启动子相当长，384 bp。早期的萝卜研究表明，在雄性无菌线粒体基因组中的启动子ATP8基因丢失[38］．同样的研究表明，在CMS萝卜中，ATP8与之共同转录orf138和TRNFM.，但在肥沃的品种中从其自身的启动子转录。在CMS MAX1线粒体基因组中的基因ATP1.，ATP8和Coxiii.彼此紧挨着放置(图。1），暗示使用启动子进行协同转录的可能性ATP1.．启动子序列ATP1.在HA 89（MAX1）和HA 89之间不保守。

向日葵的细胞质雄性不育已鉴定出70多种类型[2]但是对他们的线粒体组织进行了研究，只有不到一半的时间进行了[23，24，25，26，39，40］．植物线粒体基因组的组装一直是一项艰巨的任务[41］．组装一个线粒体DNA分子，即所谓的“主染色体”，尤其困难。大多数问题与植物线粒体基因组的动态重排率有关，导致多种亚基因组形式的形成[42，43］．向日葵中只有两种CMS来源的完整线粒体序列被调查[20.］．将目前的研究数据与我们之前的研究进行比较[20.分析了向日葵细胞质雄性不育类型PET1 (MG735191.1)和PET2 (MG770607.2)的mtDNA，建立了细胞质雄性不育的分子基础假说。

匹配PET1和MAX1 CMS源的MTDNA，我们发现常见的线粒体重新排列功能。这两条线都有一个类似的“重新排列热点”附近orf873基因。6583 BP插入（MAX1）的一部分是免费的（具有99％的Identity）到4732 BP插入（PET1）。这种序列同源性导致存在orf306在这两行和ORF480部分相似orfh522在max1。PET2和MAX1 MTDNA的比较还显示了其线粒体基因组重组的相似之处。两个CMS类型都有删除NAD4L-ATP8并以完全消灭为特征orf777．5272 bp插入序列(MAX1)与5050 bp插入序列(PET2)之间有80%的核苷酸序列是反向补体(同源性为99%)。此外,ORF645.在两个CMS行中找到。6583BP插入（MAX1）与PET2中的15,885bp插入相似。两种插入的常见区域计数约为500个核苷酸，并且1233bp重复部位（MAX1）在PET2线粒体基因组中也相同。目前研究中提供的数据确认了MAX1和PET2 MTDNAS组织的相似性，该组织在以前的杂交结果中观察到[23］．然而，三种CMS类型(MAX1、PET1、PET2)的育性恢复模式存在较大差异。对于CMS的MAX1，除HA 89外，所有研究的保持系和恢复系PET1都恢复了育性。但只有2个保持系和1个恢复系PET1能够恢复PET2不育系植株的育性[44］．它表明这三种CMS类型中的雄性不育的不同起源，这是通过当前研究中提出的CMS类型的分子比较来证实。

CMS表型形成主要涉及具有对线粒体基因部分互补的新开放阅读框的外观：ATP酶复合亚基，呼吸相关蛋白等[12.，45］．线粒体DNA缺失通常导致雄性不育，当它们导致创建新的ORF或vital线粒体蛋白的损害编码序列[12.］．消除整个orf777，编码一种功能未知的蛋白质，不太可能导致男性不育，尽管没有orf777在两种向日葵CMS类型(PET2和MAX1)中均表现出显著性差异。大多数CMS相关基因编码多肽与跨膜结构域[11.，46］．在发现的新orf中有orf306和orf645,编码缺乏跨膜区域的蛋白质;因此，它们不太可能通过破坏膜的完整性而引起CMS。的外观ORF645.在向日葵的两个CMS类型(PET2和MAX1)中可能不是偶然的ORF645.也可以是其他守护的ORF在其他的线粒体基因组中直升机属的物种。然而,ORF480具有更高的可能性导致CMS表型的外观。这ORF480翻译的蛋白质具有一个膜相关区域，并与ORFH522蛋白显示相似之处，在形成PET1型CMS中起主要作用[16.］．然而，在ORFH522蛋白的情况下，有一个确定的跨膜螺旋是由n端22氨基酸(20-42 aa)形成的。反过来,ORF480翻译的多肽在N-末端（5-27AA）中仅具有膜相关区域（主要内部的膜层），并且不太可能形成跨膜螺旋。这ORF480,也叫ORFM160在先前的MAX1研究中[24]，未转录，也存在于雄性肥沃H. Maximiliani人口MAX30。这就是为什么我们也不考虑ORF480成为向日葵MAX1 CMS类型的主要原因。

嵌合orf1287在HA89 (MAX1)线粒体基因组中鉴定，是CMS发展的一个潜在候选基因。HA89可育系和细胞质不育系HA89 (PET1)、HA89 (PET2)均不具有同源线粒体基因orf1287．这orf1287编码ATP6.它有250个与ATP合酶Fo亚基6 c端相同的氨基酸，但有一个额外的延伸和不同的n端部分(图。2)．存在于正常ATP6蛋白的C-末端中存在的七种跨膜螺旋也存在于编码的蛋白质中orf1287．我们在NCBI数据库中搜索了同源蛋白质，并发现了向日葵线的ATP合成酶亚基6的显着同一性（超过70％），与另一种CMS型 - Ant1（CAA57790.1）。与两种类型的CMS（MAX1，ANT1）中的正常ATP合酶亚单元6（351AA长）相比，细长蛋白分别将细长蛋白转化为429AA（MAX1）和437AA（ANT1）的蛋白质。应该指出的是，它们具有相同的C-Termini和高度相似的N-Termini。这ATP6.基因是植物中最常重新排列的线粒体基因之一[12.，47，48］．嵌合之间的相关性ATP6.在几种物种中发现基因和CMS表型，包括辣椒[48]，玉米[49]，萝卜[50]，monkeyflower [51]等等，有趣的是，在糖甜菜中呈现的嵌合兽人ATP6.5 '加长转录本已在体内翻译并导致CMS表型[47］．从这些观察中，我们建议预测的翻译产品orf1287可能在向日葵中的MAX1 CMS型式中发挥重要作用。

已经确定了八个重要重大重组事件（MAX1）MTDNA：包含倒置区域的110 kB，四次缺失 - 439 bp，978 bp，3183 bp和14,296 bp，以及三种插入 - 1999 bp，5272 bp和6583 bp。重排导致HA89（MAX1）的线粒体基因组的功能变化：完全消除orf777和新的orf -的出现orf306、orf480 orf645和orf1287．的预测翻译乘积orf1287可能在向日葵CMS MAX1雄性不育表型发育中起关键作用，而其他mtDNA重组对CMS表型发育的贡献不大。

我们感谢审稿人和编辑对论文提出的深刻建议和意见，这些建议和意见帮助我们完善了稿件。我们感谢美国北方作物科学实验室(Fargo, USA)的合作伙伴为瓦维洛夫植物遗传资源研究所提供向日葵HA89异质系的种子。

资金

本研究得到了俄罗斯教育和科学部项目(no。6.929.2017/4.6。对南方联邦大学“高技术”集体使用中心的设备进行了分析工作。出版费用由俄罗斯教育和科学部项目资助。6.929.2017/4.6。

可用性数据和材料

Ha89肥沃的线基因组可用https://doi.org/10.6084/m9.figshare.7265648.v1;稍后将沉积该序列沉积在NCBIGegank。CMS线HA89（MAX1）的完整线粒体序列已被沉积在加入号MH704580.1下的Genbank。

关于这个补充剂

本文已作为BMC Plant Biology Volume 19 Supplement 1, 2018: Selected articles from BGRS\SB-2018: Plant Biology。补充的完整内容可在线提供//www.cinefiend.com/articles/supplements/volume-19-supplement-1．

隶属关系

1. 南联邦大学，罗斯托夫 - 唐，俄罗斯

   Maksim S. Makarenko, Alexander V. Usatov和Kirill V. Azarin

2. La Vern大学，La Verne，加利福尼亚州，美国

   Tatiana V. Tatarinova

3. 信息传输问题研究所，莫斯科，俄罗斯

   Tatiana V. Tatarinova和Maria D. Logacheva

4. 普通遗传学研究所，莫斯科，俄罗斯

   Tatiana V. Tatarinova

5. 西伯利亚联邦大学，克拉斯诺亚尔斯克，俄罗斯

   Tatiana V. Tatarinova

6. 斯科尔科沃科技学院，莫斯科，俄罗斯

   玛丽亚·d·Logacheva

7. 瓦维洛夫俄罗斯植物遗传资源研究所，圣彼得堡，俄罗斯

   维拉·a . Gavrilova

8. 德国植物遗传学研究所罗斯托克大学，德国罗斯托克

   恢复角

贡献

MSM，KVA，MDL进行了分子实验。AVU，VAG设计并协调所有实验。AVU，VAG，MDL贡献试剂/材料/分析工具。MSM，TVT，RH执行了数据分析。MSM，TVT，RH准备的人物和/或表格，撰写或审查的论文草案。所有作者均为稿件贡献，然后读取并批准了最终版本。

通讯作者

对应于马克西姆s Makarenko．

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同意出版

不适用

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

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