重复的体细胞胚胎发生诱导胚胎源性线的细胞学和蛋白质组学变化gydF4y2Bapseudotsuga menziesii.gydF4y2Ba(Mirb。)gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

为了探索目前尚不清楚的植物体细胞胚发生系和后续体细胞胚发生系之间的差异，我们诱导了次生(2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba）和第三次（3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba)的子叶体细胞胚(SEs)系:SD4和TD17基因型。2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线呈现出明显较高的胚性潜力（SE产量）比1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba从Zygotic胚胎发起的线（SD4,2155 VS 477; TD17,240与29ggydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}f.w。)。此外，我们观察到2之间的产量差异相似gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaSD4 (2400 vs 3921 ggydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}f.w。)。为了阐明重复体细胞胚胎发生诱导的胚胎发生潜力差异的原因，我们比较了2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba在组织细胞学（使用LC-MS / MS）和蛋白质组学水平的线。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

重复性体细胞胚胎发生显着改善了增殖线的细胞组织（基因型SD4最强烈）。用细长悬浮丝器和明显可切割的胚胎头部的单一的单次，双极性和紧凑型聚氧化烯晶体的频率增加了2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和（甚至更多）3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行。在已鉴定的2300-2500个蛋白中，有162个和228个在2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba分别侧重于“蛋白质水解”和“分解代谢过程”的基因本体范畴。值得注意的是，2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba相对于1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行，但在3中上调gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba相对于2.gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线条，揭示了一种由下而上的表达模式。GO类别富集分析强调了全局蛋白质模式的相反调整，特别是涉及几丁质分解代谢、木质素和l -苯丙氨酸代谢、苯丙类生物合成、氧化还原和对karrikin反应的过程。亚网络富集分析强调了在第一次(特别是茉莉酸、类黄酮)和第二次(特别是水杨酸、脱落酸、木质素)胚胎发生周期后，显著蛋白与植物生长调节剂和次生代谢物之间的相互作用。每次诱导后建立的蛋白网络对“植物发育”和“防御反应”的生物学过程都有同样的影响，但在第三个周期后影响最为强烈，这可以解释3的胚胎发生性能最高的原因gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本文首次报道了针叶树重复体细胞胚发生后的细胞和分子变化，表明每个周期都通过调节生长调控途径增强EMs的结构和单倍体化，从而改善了系的胚胎发生状态。gydF4y2Ba

植物体细胞胚胎发生是植物细胞的胚胎，通常在体外产生胚胎。只要有可能，它是选择基因型的真正型营养传播的优选选择，因为在建立胚胎体计划期间，在胚胎体内早期划定了顶端和根胚胎分析。因此，与其他营养繁殖技术相反，不需要偶然的有机组织。近年来，在改善胚胎种类越来越多的树脂胚胎发生的技术方面，已经取得了重大进展，从胚胎发生培养物中的胚胎培养物到高质量的体细胞胚（SES）的成熟。据报道，对于硬木来说，据报道了大规模生产大规模生产的进展[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]软木（大多数针叶树）物种（在[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba])。杉木(Douglas-fir)繁殖体细胞胚发生技术gydF4y2Bapseudotsuga menziesii.gydF4y2Ba(米布)佛朗哥)，一种多产的针叶树种gydF4y2BaPINACEAEgydF4y2Ba家族拥有全球公认的木材质量，已经发展了30多年[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］.有一种丰富的专利方法，但刚刚公开可公开启动以高效生产体细胞幼苗的步骤的一些改进（[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]和其中的参考文献）。gydF4y2Ba

由于它可以提供的高乘法率，体细胞胚胎发生被认为是森林树的大规模克隆繁殖的有前途的生物技术。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］.此外，胚胎发生培养物适用于低温储存以进行遗传资源的长期保存[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]遗传工程（包括基因组编辑），用于胚胎发生期间表达的基因的功能表征[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］.体细胞胚胎发生也是研究胚胎发育的一种方便的实验模型系统[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］.该方法包括良好特征的发育阶段和途径，这些阶段主要在SES和参考Zygotic胚胎之间相似[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba)，最近在针叶树中显示，从分子水平(在杂交落叶松[gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba]）形态学（在海洋松树中[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba])。gydF4y2Ba

一旦体细胞胚胎发生已经开始，胚胎培养物被增殖以维持新胚胎的形成。在被子植物中，胚胎发生的潜力是在一个重复的，次级的连续过程中保持的(2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba）胚胎发生，直接来自初级（1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba)的胚胎或间接从各种细胞聚集，如原胚团或结节愈伤组织从1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaSEs [gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba］.该过程通常导致从先前的胚胎外植体可拆卸的新SES的簇。gydF4y2Ba

裸子植物的胚胎培养物以胚胎团(EMs)的形式增殖，即在胚胎发育后期的早期阶段，多簇附着的SEs与单个的SEs穿插在一起[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba］.EMS通常具有多透明的外观，并且由于在它们的表面突出的早期胚胎，可能具有颗粒于尖刺的Mor晶型。这些未成熟的SE通常是由双极结构组成的双极结构，其由紧密地连接到基底悬浮料组织（长，真空的细胞）的顶端胚胎头（由致密的，共源细胞组成）。EMS的增殖被认为主要是由于未成熟，早期的高裂解能力。该方法称为裸子植物中的裂解聚氧化胺，并且可以在一些属的种子中自然可以发生（例如gydF4y2Ba松果体gydF4y2Ba物种）。它尚不清楚，如果乳化聚氧化甘豆是早期SES增殖中唯一涉及的过程。gydF4y2Ba

一些针叶树种(如Douglas-fir)的SE簇可能是通过增殖早期的SE，通过连续但不完全的卵裂多胚(体细胞多胚发生)和/或从头体细胞胚胎发生发展成不同大小的多胚发生中心[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］.此外，一些增殖EMs的Douglas-fir系同时包含未成熟的SEs和非胚胎发生细胞簇(NECs) [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba］.在其他针叶树种中尚未明确记录到的道格拉斯冷杉EMs的一个明显特征是存活的NECs与早期的SEs ([gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，Eliášová和Lelu-Walter，个人沟通）。当EMS暴露于特定成熟条件时，刺激从早期SES到子叶仔病的后续转变。通常要求这一转型，gydF4y2Ba在其他事物之外gydF4y2Ba对于道格拉斯 - 冷杉培养[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]，在培养基中补充脱落酸(ABA)，同时增加渗透压(使用高碳水化合物浓度的溶液，如0.2 M蔗糖)，和/或使用高分子量聚合物(如4000da聚乙二醇，PEG 4000)或通过增加培养基的凝胶强度来物理减少培养细胞的水分可利用性。gydF4y2Ba

高血管植物树种的体细胞胚胎发生不仅可以从少年材料开始，而且可以从成熟树上获得的组织开始，例如，高达100岁的人gydF4y2Ba栎gydF4y2BaSPP。树木[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba]甚至700岁的人gydF4y2BaKalopanax septemlobusgydF4y2Ba树木[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］.尽管直接从老树外植体开始是困难的，需要经过初步的调理gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba和/或复壮技术(腋芽培养、嫁接等)，通常可以通过重复体细胞胚胎发生维持数年的起始系的胚胎发生能力。此外，由于有许多被子植物的材料，2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba胚胎发生比1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba胚胎发生[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba](以及其中的参考文献)。相比之下，从比合子胚更老的针叶树或非常年轻的植物的合子外植体开始体细胞胚胎发生仍然存在问题[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba](以及其中的参考文献)。然而，25年前人们就已经知道外植体是从植物的体细胞物质中提取的gydF4y2Ba挪威云杉gydF4y2Ba与来自合子胚胎(一个月大的植株[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba])。因此，创业能力gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba在不同的针叶类植物的子叶SEs和体细胞幼苗中观察到体细胞胚胎发生，包括gydF4y2Ba云杉glaucagydF4y2Ba(最多10岁的树，[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba]),gydF4y2Ba挪威云杉gydF4y2Ba（最多3岁的植物，[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba]),gydF4y2Ba云杉马里亚纳gydF4y2Ba(子叶的SEs, (gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba]),gydF4y2Ba落叶gydF4y2Ba十gydF4y2BaleptoeuropaeagydF4y2Ba（直到发芽的SEs[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba]),gydF4y2Ba冷杉属numidicagydF4y2Ba(子叶的SEs, (gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]),gydF4y2BaPinus Pinaster.gydF4y2Ba(直至发芽的SEs， [gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]）最近的Douglas-Fir（子宫束，[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba])。在大多数物种中，2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba体细胞胚胎发生可以以相当高的频率从子叶斑氏SES引发。gydF4y2Ba

在针叶树,2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba体细胞胚胎发生有许多潜在的应用，因为它提供了一种获得“不朽的”胚胎发生系的潜在方法[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］.稳定株系对于植物胚胎发育的长期基础研究极具吸引力，因为它的使用减少了严格的实验限制，如培养老化[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］.次生体细胞胚胎发生器也可用于恢复衰老/失效的胚胎胚胎胚胎能力，其具有递减成熟能力和/或产生异常或质量差的胚胎。另一个特别有趣的实际特征是2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba体细胞胚胎发生可提高某些物种胚胎发生系的胚胎发生潜力。例如,2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba据报道，EMs的效率比1高gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba杂交落叶松胚胎系的培养[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba]和海洋松[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］.同样的,2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba从低胚胎发生潜力(< 500 se ggydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}EMS F.W.）已被发现明显高于1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

2的胚胎潜力差异的原因gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba针叶树的线条在很大程度上是未知的，并且只在以前的一项研究中进行过研究gydF4y2BaPinus Pinaster.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］.显然，详细的细胞学知识和分子事件发生在增殖胚胎系在重复体细胞胚胎发生周期是必要的。在本研究中，我们试图获取这样的知识，并检验在2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba体细胞胚胎发生的选择性过程可能促进胚胎发生细胞和EMs的发育，这些细胞具有增殖和再生子叶SEs的能力。gydF4y2Ba

与大分子理观察结果相比，增殖过程中EMS的细胞学特征是胚胎源性系列生产子叶中SES的可靠指标。在挪威云杉中，只有与致密的胚胎头部明显地与明确限定的悬浮椎弓区域明显分离的EMS，可以据报道进一步进入子叶肌肉SES [gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba)，至少在引用的研究中适用的条件下是这样。在松树物种中，由于老化效应，过度繁殖的EMs中胚胎发生潜能降低(综述见[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba])。在成熟步骤中的这种差的性能显示出与细胞组织在增殖期间的显着变化相关gydF4y2BaPinus Pinaster.gydF4y2Ba，导致能够完成后期胚胎发生最后阶段的未成熟SEs的频率降低[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］.在海洋松树和道格拉斯 - 冷杉中，在麦芽糖存在时，EMS的激增可以大大改善未成熟的关键细胞学特征[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

最近，新颖的高分辨率蛋白质组学方法的发展已经为植物发育中有没有明确的定性蛋白质组覆盖和定量测量的机会提供了机会。这些蛋白质组学分析已经提高了对植物体细胞胚胎发生中涉及的代谢和信号通路的理解[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］.在针叶树中，在早期和晚期或晚期胚胎发生期间的蛋白质表达的显着变化已被报告如[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba]，在包括成员的各种物种中gydF4y2BaPINACEAEgydF4y2Ba家庭,如gydF4y2Ba云杉glaucagydF4y2Ba［gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba),gydF4y2Ba挪威云杉gydF4y2Ba［gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba),gydF4y2Ba落叶gydF4y2BaSPP。［gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba),gydF4y2Ba马尾松gydF4y2Ba［gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba),gydF4y2BaPinus Pinaster.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

这里提出的工作的主要目标是研究Douglas-FiR中重复体细胞胚胎发生诱导的细胞和蛋白质组学变化。为此目的，诱导子叶植物SES中的细胞胚胎发生，得到2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaEMs与1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba在增殖过程中胚性潜力，细胞学和蛋白质模式方面的EMS。加深对重复性体细胞胚胎发生，第三大学的理解（3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba）由2个曲调的SES产生的线gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba细胞系通过第三个体细胞胚发生周期gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaEMs与2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaEMS。这是针叶树在针叶树中连续两次重复循环的第一个报告。我们首先比较2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaEMS到1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaEMs,那么2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba到3.gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaEMS。但是，3的细胞gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaEMS不会直接源于1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaEMs和许多涉及组织生理老化的继代培养步骤可能发生在它们之间。因此，我们没有比较1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaEMS为避免可能的复杂性与本研究的目的无关紧要。gydF4y2Ba

我们在重复性体细胞胚胎发生后增加了Douglas-FiR的增殖EMS的细胞学和蛋白质组变化的第一种细胞学和蛋白质组变化的证据。有趣的是，蛋白质组学分析进一步揭示了不同蛋白质的蛋白质在2之间显着差异表达gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaEMS，2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaEMs(以下简称“显著”蛋白)，表明每个重复体细胞胚胎发生周期促进基因表达模式的全基因组重排。此外，通过亚网络富集分析(SNEA)对鉴定蛋白的功能和相互作用进行了分析，结果表明，该方法可以为研究针叶树体细胞胚胎发生提供有价值的信息。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

pseudotsuga menziesii.gydF4y2Ba参与这项工作的树木是树木的后代，北弯（基因型4455和4456）或enumclaw（4466和4477），华盛顿（美国）。它们被用作父母树，以在内·（奥尔齐恩，法国）执行以下对照交叉：4455×4466和4456×4477.在发布后的种子外植体（在子宫前发育阶段的分离的未成熟子发育阶段分离的未成熟子胚胎）诱导了体细胞胚胎发生方法 [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］.SD4 (4456 × 4477)和TD17 (4455 × 4466)分别于2011年和2012年启动[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

胚胎块的增殖gydF4y2Ba

EMS在谷胱甘油增殖培养基上每2周培养EM培养，由改良的Litvay培养基组成[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba添加4.5 μM 2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)、2.2 μM BA(6-苄基腺嘌呤)和0.087 M麦芽糖，4 g LgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}Gellan Gum。必要时，将EMS培养为分散在滤纸上（每个过滤器300mg F.W. /滤器）上的薄层以促进增殖，如前所述[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］.在高压灭菌前，将每个培养基的pH调整到5.8。gydF4y2Ba

重复性体细胞胚胎发生（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba

按照已发表的方案，进行了两个重复体细胞胚胎发生周期[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］.简而言之，对于第一个诱导循环，6至11周龄的子叶（见成熟部分）从1再生gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba将胚胎系SD4和TD17转移到含有4.5 μM 2,4- d、4.4 μM BA和0.087 M蔗糖的Glitz起始培养基中，4 g固化。lgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}Gellan Gum。每2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba从单个SE开始的EM，然后按照上述方法进行传代培养以进行增殖。我们获得了2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba从1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线SD4和A 2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线路指定TD17-1起1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaTD17线。对于第二次诱导循环，从2个获得的子叶SESgydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaSD4-8系列类似地用作引发3的外植体gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线路，指定为SD4–8-1、SD4–8-2和SD4–8-3。gydF4y2Ba

增殖过程中的形态学和组织细胞学观察gydF4y2Ba

在10天乘以形态学和组织细胞学表征后收集样品。使用SMZ 1500立体显微镜（尼康，东京，日本）记录了EMS的形态，并在染色新鲜材料染色后使用Jenaval传输光学显微镜（Zeiss，Jena，Germany）来检查它们的结构。gydF4y2BaWgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)台盼蓝(Sigma-Aldrich)，如前所述[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba］.用Lugol(碘-碘化钾)溶液对淀粉颗粒进行染色定位。EMs标本固定、脱水、石蜡浸润后Alcian Blue和Nuclear Fast Red染色的石蜡切片(厚12 μm) [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，在Jenaval光学显微镜下进行组织学观察。除细胞壁外，阿利新蓝还能染色一些细胞的空泡，EMs的颜色表明一些细胞可能积累酚类化合物。因此，Azur II和藏红花染料(已知染色酚类化合物)也被使用，并证实了一些阿利新蓝染色是由于其与酚类化合物的络合。所有图像均使用ds - 5m相机(尼康，东京，日本)拍摄，并使用NIS-Elements AR 3.2图像分析系统(布拉格，捷克共和国，Laboratory Imaging)进行处理。gydF4y2Ba

成熟的条件gydF4y2Ba

增殖EMs从滤纸称重,分散在液体浮华中没有植物生长调节剂和分布在滤纸片放置在浮华的表面成熟介质(在培养皿中)补充0.2蔗糖,60μM ABA(顺反±脱落酸),和10 g LgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}Gellan Gum在细胞密度为50mg f.W.每个过滤器。然后将EMS在暗度下在近似23℃下成熟。计算8周后，每个培养皿中产生的子叶菌SE的数量估计了EMS胚胎源性潜力（EMS的SES数量）。在第一组实验中，胚胎潜力为1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线条（SD4，TD17）和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba采用96个培养皿(每组5-6个培养皿，每组5-6个培养皿，每组3个生物重复)对不同品系(SD4-2、SD4-6、SD4-8、TD17-1)进行比较。在第二组实验中，我们比较了2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba(SD4-8)和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba（SD4-8-1，SD4-8-2，SD-4-8-3）线，用于每条线条和条件的每个排列的培养皿，并重复三次实验，所以总共使用72型培养皿．gydF4y2Ba

可溶性蛋白质提取gydF4y2Ba

对所有类型的线路进行分析(1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba， 2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba)，将EMs培养成薄薄的一层分散在滤纸上。每个样品(150 mg冷冻EMs)从4个生物重复中提取可溶性蛋白，加入1 ml尿素提取缓冲液(4 M尿素、0.1% v/v SDS 10%、0.1 M DTT、80 mM Tris HCl pH 6.8、10% v/v甘油)。以牛血清白蛋白为标准，采用Bradford法测定总蛋白含量。结果以可溶性蛋白含量(μg mggydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}干重）。gydF4y2Ba

蛋白质组学和无标记定量MS / MS数据分析gydF4y2Ba

蛋白质组学和nLC-MS/MS分析是按照先前发表的协议进行的[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba］.简单地说，蛋白质样品用SDS-PAGE和胶体蓝染色，然后从凝胶上剪下染色条带，染色后用胰蛋白酶消化。所得到的肽混合物使用Ultimate 3000纳米olc系统(C18 PepMapTM陷阱柱，Dionex，阿姆斯特丹，荷兰)与电喷雾q -萃取四极轨轨道台式质谱仪(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)结合进行分析。质谱仪工作在1.8 kV针电压下的正离子模式下。数据采集采用Xcalibur 2.2软件，数据依赖模式。MS扫描(m/z 350-1600)记录分辨率为gydF4y2BaRgydF4y2Ba = 70,000 (at m/z 200) with an AGC target of 3E6 ions collected within 100 ms. Dynamic exclusion was set to 30 s and the top 15 ions were selected from fragmentation in HCD mode. MS/MS scans with a target value of 1E5 ions were collected with a maximum fill time of 100 ms and resolution ofRgydF4y2Ba= 17500。另外，只有+ 2和+ 3带电离子被选择破碎。获得的肽通过Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Fisher Scientific Inc.)中SEQUEST对agydF4y2Bapseudotsuga menziesii.gydF4y2Bav1转录组-蛋白质组数据库来自PineRefSeq(54,595个条目，2016年8月，gydF4y2Bahttps://treegenesdb.org/ftp/genomes/psme/v1.0/annotation/gydF4y2Ba）.单同位素肽前体和肽片段的质量准确度分别设定为10ppm和0.02 Da。只有b离子和y离子被考虑用于质量计算。甲硫氨酸(+ 16da)的氧化被认为是可变修饰，半胱氨酸(+ 57da)的氨基甲基化被认为是固定修饰。允许两个错过的胰蛋白酶裂解。肽使用了Percolator算法[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba[对应于肽水平的“高置信”肽，对应于肽水平的<1％的假发现率（FDR）。原始的LC-MS / MS数据被导入蛋白质组学2.0（非线性动力学有限公司，纽卡斯尔，U.K）的Qi。数据处理包括以下步骤：（i）特征检测，（ii）跨所有样本的特征对齐，（iii）基于所有强度的比率的中位数的2-6个电荷 - 状态离子的体积集成，（iv）原始数据标准化相关碎片对参考（从LC-MS特征计算），（v）进口序列信息，以及蛋白质丰度的计算（相应肽的量）。仅考虑了蛋白质水平计算的非相互矛盾的特征和独特的肽。考虑定量数据，以至少两种肽量化的蛋白质。普遍存在的ProteomexChange联盟数据库中的质谱蛋白质组学数据已寄存在骄傲中[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba带有数据集标识符PXD008347的合作伙伴存储库。gydF4y2Ba

功能表征与基因本体分析gydF4y2Ba

相对于适当对照的表达变化是基于每种肽的累积强度计算（分类蛋白质，≥1.5倍的变化比例为上调的蛋白质）。将所有序列映射到TAIR中的基因本体（GO）术语gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba数据库（gydF4y2Bahttps://www.arabidopsis.orggydF4y2Ba/)用于函数注释。然后使用Web Gene Ontology Annotation Plot软件对蛋白质进行二级生物过程分类(Panther、gydF4y2Bahttp://pantherdb.orggydF4y2Ba/) (gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］.用Panther软件应用二项式测试和Bonferroni的校正，以识别每种材料中的上调和下调蛋白质在预期的频率明显更频繁的类。由于基因本体对道格拉斯 - 冷杉目前极差，我们还应用另一种方法来评估蛋白质集中的富集术语，使用Biocumon R包Topo 2.26.0 [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]，基于“权重”法和Fisher的精确检验。我们将这组重要的蛋白质与4813 Douglas蛋白质总数据集进行比较，并通过BlastP搜索将每个蛋白质映射到最佳拟南芥同源物中。然后，每个GO项从gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba与相应的Douglas蛋白有关的Topo分析。gydF4y2Ba

网络浓缩分析gydF4y2Ba

subnetwork Enrichment Analysis (SNEA)使用Pathway Studio®version 11.4 (Elsevier B.V.)进行。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

R软件(版本3.3.2;R Development Core team 2011)用于所有统计分析。1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba， 2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey对比的多重比较(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。蛋白质组学分析:1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba系，采用双向方差分析与交互作用和FDR，基于归一化丰度(调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

杉木胚性系重复体细胞胚发生后的胚性潜能。gydF4y2Ba

次级与TD17和SD4基因型的初级胚状线gydF4y2Ba

在最初的胚胎发生潜力比较1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba（TD17和SD4）和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba（TD17-1，SD4-2，SD4-6和SD4-8）线路，主要线路显示出胞嘧啶SES的平均产生的显着变化（gydF4y2BaPgydF4y2Ba = 3.01e^{- 7gydF4y2Ba}）.SD4是适度胚胎源性的（478 SES G.gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}F.W.）而TD17表现出非常弱的胚胎潜力（30次SERgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}F.W.，表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.然而，在两种情况下gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba生产线的生产效率明显高于1条gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行(SD4gydF4y2BaPgydF4y2Ba = 9.47e^{- 7gydF4y2Ba}和td17gydF4y2BaPgydF4y2Ba = 2.88e^{−10gydF4y2Ba}）.TD17-1的生产率高8倍（产生241次SES GgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}F.W.，表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）比原来的TD17线，而2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaSD4系列产生3-4（SD4-6，SD4-8）至6次（SD4-2）更多的子叶（1515-3131 SES G.gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}F.W.桌子gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

第三型vs次级胚胚线SD4基因型gydF4y2Ba

在随后的胚胎发生潜力比较中，2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba(SD4-8)和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba（SD4-8-1，SD4-8-2和SD4-8-3）线路，SE产量三3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba(3344-4258 SEs ggydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}F.W.，表格gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.然而，只有SD4-8-2和SD4-8-3显著高于(gydF4y2BaPgydF4y2Ba = 0.00337) yields (4160 and 4258 SEs g^{- 1gydF4y2Ba}F.W.）分别比SD4-8（2401 SES GgydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}f.w。)。gydF4y2Ba

道格拉斯 - 冷杉EMS的组织细胞学描述gydF4y2Ba

初级(SD4, TD17)、次级(SD4 - 2, 6,8;TD17-1)和SD4-8-1, 2, 3)的胚胎发生系的概述见附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：表S1。gydF4y2Ba

初级，二级和三级EMS的形态gydF4y2Ba

两种基因型的EMS和所有类型的线条（1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba， 2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba， 3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba)有多种颜色;通常阴影的黄色和棕色，但一些线(特别是SD4)是相当粉红色(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：图S1）表示其细胞中酚类化合物的局部积聚，如通过组织学级组织化学染色（见下文）的确认，并在1中激活酚类途径gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线(见下文)。EMs中增殖的未成熟早期SEs的结构在1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行。然而，EMs的表面有明显的粒度，特别是那些行SD4(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：图S1），其可能指示大型聚氧化植物的发生。详细观察还揭示了附着于从EMS表面逸出的这些结构中的丝状悬浮电池。相比之下，在大多数EMS中，明显，紧凑且颗粒状的大聚烯发生中心和/或发白的初始SES在2个EMS中显而易见gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线，特别是TD17-1、SD4-2、SD4-8-1和SD4-8-3线，有时可区分出早期胚胎突出的双极结构(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1，箭头)。EMs从2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaSD4-6线与1线相似gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线路，而SD4-8的EMS没有表现出典型的粒状Mor晶型并且具有更平滑的外观，表明该线的聚氧化性中心或单一的胚胎不太频繁和/或更小（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：图S1）。来自3的EMSgydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线SD4-8-2最长的EMS来自2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线SD4-2，但具有较少的不同结构具有颗粒状外观。gydF4y2Ba

次级（TD17-1，SD4-2，SD4-6，SD4-8）和初级（SD4，TD17）胚状线的组织学比较gydF4y2Ba

TD17和SD4基因型的原生系产生了大的多胚发生中心，具有广泛的分生组织部分和通常细长的胚柄细胞，共同形成了紧密的细胞“包”，这些细胞由黏性基质连接在一起(图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),附加的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2)。除了这些多胚发生中心外，还形成了具有大而有序的胚头与紧密而长胚柄相连的环状早期胚胎(图。gydF4y2Ba3dgydF4y2Ba）.由几层使用几层和少量细长的悬浮细胞组成的较小胚胎通常也常见，或靠近由悬浮池细胞的残余物或崩解早期胚胎形成的死亡材料（图。gydF4y2Ba2 c, dgydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 a, hgydF4y2Ba，gydF4y2Ba5b、egydF4y2Ba）.这些小胚胎的共同细胞通常是显着的活性物质（图。gydF4y2Ba3CgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

两种基因型也产生了NEC的簇，作为松散排列的真空细胞的一组（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3A)或有组织的，紧凑的单元聚合(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：图S3B），位于早期胚胎的接近。在连续的部分中非常小心地检查所有观察到的细胞簇，以避免使用NECS与胚胎细胞的混淆，特别是悬浮细胞，它们也被真空。如果在任何部分中没有任何细胞表现出专业化细胞的特征，则认为细胞簇被认为是非胚胎发生的，即致密细胞质，突出的细胞核和没有可检测的酚醛含量的小核和小液泡。大的NEC簇通常由无明显活性的菌株的不规则形状的真空细胞的混合物组成（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：图S3）或累积的淀粉颗粒和/或酚类化合物（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3B, C, E, F)。显然酚醛化合物以颗粒或液滴中的真空沉积，导致褐细胞易于识别与细胞壁染色的蓝色，核和细胞质（略微）染色粉红色/红色（见图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba）.令人惊讶的是，作为无定形沉积物的酚醛粘附在真空沉积物中含有差异的苯酚，与阿尔西亚蓝，从灰蓝色到姜形成各种颜色的复合物，表明它们具有可变的化学成分（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：图S3B，E，F）。酚醛化合物的Alcian蓝染色通过其他染料（Azur II和Safranin;数据未显示）确认酚类化合物的蓝色染色。发现EMS中遍历的NEC聚集体的发生在如下所述的线之间变化。然而，全球重复的体细胞胚胎发生导致NEC簇的频率降低，并同时在EMS中的酚类含量降低。gydF4y2Ba

TD17 vs TD17-1gydF4y2Ba

两个1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaTD17基因型株系产生上述所有类型的胚性结构（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S2、图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）但最常大的聚氧化酯中心（图。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba），而小胚胎（图。gydF4y2Ba3CgydF4y2Ba)在这两方面都很少见。在2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行TD17-1(无花果。gydF4y2Ba3dgydF4y2Ba）.在TD17中观察到NECs为松散排列的细胞(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3A)或紧凑的单元集群(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：图S3B）在胚胎附近，甚至在死亡材料附近。TD17-1 2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线产生了更少的NEC集群。在死亡材料中只观察到早期胚胎或（更常见）的少量碎片。gydF4y2Ba

SD4 vs SD4 - 2, SD4 - 6, SD4 - 8gydF4y2Ba

初级线SD4的特征在于制造类似聚氧化酯中心的大结构（图。gydF4y2Ba2AgydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 a、bgydF4y2Ba）.这些结构的分生组织样部分通常是由密集的细胞质分生组织细胞和经常积累淀粉粒和/或酚类化合物的空泡细胞混合形成的(图)。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba）.分生组织细胞通常发生在结构的一部分，形成紧凑的分生组织或胚胎头状结构。这可能只是多胚发生中心的一小部分或几层细胞，因为内部区域主要是由空泡细胞形成的。原真皮细胞通常在这个类似分生组织的区域形成光滑的表面。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba）.然而，最外层的细胞层在某些部位可能会恶化，导致原皮层缺失和与NEC集群非常相似的局部细胞组织(图1)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba）.细长的悬浮电池仅存在于电池“封装”的最外部区域中或简单地缺失。位于与单一类似的物质区域远侧的内部区域组成，由松散地布置，不规则形状的细胞组成。具有典型双极布置的典型双极布置的小胚胎很少发生在结构的最远端区域的悬浮电池的死余残余中（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

与1相反gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线，2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线产生布置良好的各种尺寸的聚氧化聚合物，通过紧凑的共聚物部分与细长的悬浮池连接在一起形成。在SD4-2中观察到具有不同胚胎头的最典型的聚氧化酯型中心（图。gydF4y2Ba2B.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba）与位于悬浮体的小单个胚胎一起（图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba）.在这条线中，还观察到一些类似于多胚发生中心的大结构，但一些部分是由具有类似于NECs的淀粉粒的空泡细胞组成。在这些结构的边缘，细胞积累酚类化合物，在紧密的分生组织样部分和胚柄细胞之间创造一个边界(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3E)。SD4-6材料由许多小胚或小的多胚发生中心组成，有明显的胚胎头(图。gydF4y2Ba4F，G.gydF4y2Ba）以及少数巨大尺寸的多元聚合中心。位于胚胎附近，有许多大型紧凑的NEC。类似型号的大，非常紧凑，高度有组织的细胞结构是由线SD4-6生产的最典型的非胚胎发生结构（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：图S3F）。将这些“塞体素”与具有高酚含量的细胞组从丛中的其他部分中分离出来。线SD4-8仅生产的小胚胎和较小的聚氧化性中心，这些中心没有很好地组织（图。gydF4y2Ba4h，我gydF4y2Ba). 像其他2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaSD4-8也产生NECS，其排列在累积淀粉颗粒和/或酚类的簇的簇中，类似于在TD17中观察到的那些（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3B)。gydF4y2Ba

第三级(SD4-8-1;SD4-8-2;SD4-8 -3)和次生(SD4-8)胚原系gydF4y2Ba

大三线生产更多，更大，多元化的中心，但没有比2的NEC集群更少gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线SD4-8。线SD4-8-1生产大型聚胚形成中心和具有不同胚胎头的大型胚胎簇（图。gydF4y2Ba2DgydF4y2Ba，gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba）悬浮体内的小胚胎（图。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba）.品系SD4-8-2通常产生大量较小的多胚发生中心和较小的胚(图1)。gydF4y2Ba2egydF4y2Ba，gydF4y2Ba5 c, dgydF4y2Ba）发现大型聚氧化性中心的较少组织，含有一些分解的分解和悬浮体的迹象。线SD4-8-3的特征在于大型聚氧化纤维中心，其中多个不同的胚胎头连接到由细长电池形成的非常致密的悬浮料。这些聚氧化烯中心中的每一个通过死悬浮细胞的“锚”附着于另一个。在悬浮料附近出现小胚胎（图。gydF4y2Ba2CgydF4y2Ba，gydF4y2Ba5e、fgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

总蛋白质含量和蛋白质组学分析gydF4y2Ba

总蛋白质含量gydF4y2Ba

基因型SD4和TD17的总蛋白含量相近(平均值分别为113.4和98.3 μg mggydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}D.w .，分别)和在两者gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线(平均值:107.2和108.9 μg mggydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}D.W.分别，附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba：表S2）。在3中检测到更高的蛋白质内容物gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba比在2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线(平均值:137.5和110.8 μg mggydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}D.W.分别，附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S3)，但观察差异不显著。gydF4y2Ba

次级（TD17-1; SD4-2; SD4-6; SD4-8）与初级（SD4，TD17）和第三（SD4-8-1; SD4-8-2; SD4-8-3）VS的蛋白质组学比较二次（SD4-8）胚胎源性线gydF4y2Ba

在总蛋白提取物和蛋白表达变化的LC-MS/MS分析中(详细见方法部分)，我们在2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线条和2554在比较3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba染色体，一组4813种独特的蛋白质。主成分分析(PCA)是一种多元技术，它分析一个数据集与相互相关的数量因变量表示为一组新的正交变量称为主成分显示相似的模式。第一个主成分(PC1轴)是从1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)主要与基因型有关，可解释总方差的35%。PC2轴主要与基因型与株型的相互作用有关(1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba， 2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba），并解释了总方差的16％。从2中鉴定的所有2554蛋白的PCA获得的PC1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba基因型SD4的线解释了65％的观察到的差异的65％，并且线类型是主要的决定因素（图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

在第一次和第二次体细胞胚胎发生后的蛋白质表达变化的双向方差分析中，在2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行，分别(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.大多数显着的蛋白质在2中被下调gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba相对于1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行，但在3中上调gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba相对于2.gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行（分别占集合的76%和70%）。令人惊讶的是，只有33个蛋白是这两组的成员，而且这33个蛋白中有9个在两个体细胞胚胎发生周期后上调，3个在两个周期后下调，另外21个蛋白的表达变化相反。因此，特定的差异表达蛋白组和表达谱的变化与体细胞胚胎发生的每个周期有关。在附加文件中gydF4y2Ba8gydF4y2Ba：表S4呈现了162的功能GO分类（2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba)及228 (3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba)重要蛋白质。最具代表性的类别是“代谢过程”、“细胞过程”和“对刺激的反应”（分别占第一组的52.9%、27.3%和6.6%，第二组的46.0%、30.7%和7.4%）。gydF4y2Ba

使用Panther和biocotor R对循环后富集的功能类别的总体趋势进行的GO类别富集分析(Term enrichment)结果如表所示gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,分别。参与“蛋白质水解”和“分解代谢过程”类别的蛋白质在两组重要蛋白质中都有过多的代表(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.许多GO术语富含与两个体细胞胚胎发生周期相关的重要蛋白质(表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)包括几丁质和多糖分解代谢、木质素和L-苯丙氨酸代谢、苯丙酸生物合成、氧化还原和对核苷的反应。引人注目的是，这些GO术语类别的蛋白质表达在第一个周期后下降，但在第二个周期后增加，这证实了在体细胞胚胎发生的每个周期后建立不同蛋白质谱的发现。重要蛋白质的SNEA基于gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba书目数据库，其中隐含着网络表示法gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba蛋白质的名字。SNEA进一步说明了它们的功能、相互作用和可能的靶点，以及在重复体细胞胚胎发生过程中可能受到影响的代谢途径的调节因子(图)。gydF4y2Ba8a，bgydF4y2Ba）.总体而言，27例显着的蛋白质在2后上调或下调gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba(33种蛋白质)或3种gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba体细胞胚胎发生（51个蛋白质）集成在构造的网络中。它们包括许多与植物生长信号传导化合物的代谢相关的蛋白质，包括植物生长调节剂，如茉莉酸，ABA和水杨酸，以及与木质素相关的蛋白质（特别是3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba体胚发生)和类黄酮次生代谢产物(尤指2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba体细胞胚胎发生)。吲哚-3-乙酸(IAA)被发现是一个重要的调节与这两个网络。每个网络中的重要蛋白和靶蛋白/调控蛋白亚群对体细胞胚胎发生的每个周期都具有特异性，但影响着相同的主要生物过程(“植物发育”和“防御反应”)。在后者的情况下，植物生长信号化合物，如茉莉酸、水杨酸和ABA和许多其他在这些网络中识别的分子(包括次级代谢产物)不仅参与应激适应(防御反应、解毒和干旱胁迫/高渗盐反应)，而且在植物发育过程中也具有非防御功能。gydF4y2Ba

11个参与网络的重要蛋白(PAL2、CCR1、LOX1、DOX1、ERD9、P5CS1、DFR、C17L7.80、OMT1、PKT3、ALDH2B7、gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba注释)在第一个重复体细胞胚发生周期后表达下调，在第二个重复体细胞胚发生周期后表达上调。有趣的是，另外两种酶在两个周期后均上调，被鉴定为内几丁质酶EP3和E3泛素-蛋白连接酶ARI1，这两种酶都参与了针叶树胚胎发育和控制蛋白水解等途径。gydF4y2Ba

在这些重要的蛋白质中，有一种与核糖核蛋白rna诱导沉默复合体(RISC)有关。已知RISC结合microRNAs (miRNAs) MIR165A和MIR166A来切割相应的靶向mRNA。这种基因沉默过程参与mRNA剪接的生物学过程，并且只在重复体细胞胚胎发生的第三个周期中明显受到调节。gydF4y2Ba

重复体细胞胚发生增强了两种Douglas-fir基因型的胚性系的胚性潜能。gydF4y2Ba

两种不相关的基因型(TD17, SD4)在不同的胚胎发生潜力(试验条件下)的实验提供了关于这种普遍的“基因型效应”的丰富信息，这种效应在不同的针叶树中已经观察到[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］.这些包括gydF4y2BaPINACEAEgydF4y2Ba松树等物种[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba“道格拉斯 - 冷杉[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，可能是由于基因型与培养条件的特异性相互作用。gydF4y2Ba

与1相比gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线，2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaSD4和TD17基因型均表现出较高的平均胚胎发生潜能(2155 vs 477, 240 vs 29 se g)gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}F.W .;4.5和8.2倍分别增加）。在体细胞胚胎发生（次生体细胞胚胎发生）的第二个循环后，胚胎发生潜力的增加已经在杂交落叶松（1基因型，3倍[gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba)、海松(2个基因型，增加1.4 ~ 2.3倍[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]）和Douglas-FIR（3种基因型，1.2至4.9倍增加[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba])。这对于具有弱胚胎发生潜力(例如TD17)的“顽强”基因型尤其有趣，因为在育种计划中通过SEs再生选定基因型的能力较差是多品种针叶林的主要障碍[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

本研究通过对基因型(SD4)进行第三次体细胞胚发生(第三次体细胞胚发生)，进一步研究重复体细胞胚发生累积对其胚胎发生潜力的影响。据我们所知，这是3号启动的第一份报告gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba针叶树胚性品系。有趣的是，三人中有两人测试了3人gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线（SD4-8-2和SD4-8-3）表现出显着较高的胚源性潜力（平均值，4209 SES G.gydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}F.W.）和第三个3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba非显著性较高的胚胎发生潜能(3344 SEs ggydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}2 .选cgydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaSD4-8线(平均2400 SEs ggydF4y2Ba^{- 1gydF4y2Ba}f.w。)。我们认为，重复体细胞胚胎发生增强了SD4基因型的胚胎发生潜力。然而，第三个体细胞胚发生周期后的成熟性能的增长比第2个周期后的增长要弱(平均增长1.6倍vs 4.5倍)。长期稳定的胚胎发生潜能已在一些动物中得到证实gydF4y2BaPINACEAEgydF4y2Ba物种,如gydF4y2Ba落叶gydF4y2BaSPP。［gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]，而老化的影响在其他物种(例如。gydF4y2Ba松果体gydF4y2BaSPP。，[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba])。自发起以来，各种生理年龄增殖道格拉斯 - 杉木线的稳定胚性潜力（从较旧的1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线路到年轻2岁gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba本研究中观察到的Lines)支持了这样的假设，即重复体细胞胚胎发生后胚胎发生潜能的增加主要是由于起始效应，而不是衰老。在针叶树中，体细胞胚胎发生一到两个连续周期后增殖系的细胞和分子变化的研究较少。据我们所知，关于1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba具有对比胚潜力的线，gydF4y2BaPinus Pinaster.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］.在这项工作中，我们获得了新的见解，在接下来的章节中讨论，EMs的细胞组织(细胞学，组织学)和分子生理学经过1和2个循环的重复体细胞胚胎发生在Douglas-fir(通过比较1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线,分别)。gydF4y2Ba

杉木体细胞胚的重复发生改善了未成熟SEs的细胞组织gydF4y2Ba

重复细胞胚胎发生明显改善SES的结构，特别是在基因型SD4中。两个1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba基因型TD17的系列产生了我们最近描述的所有类型的EMS [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]，即聚氧化锰中心，大单身菌和小SES。相比之下，EMS的安排在1中gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba基因型SD4的线显着不同。在1中占主导地位的大型聚氧化性中心gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba细胞系SD4略类似被子植物在器官发生或体细胞胚胎发生过程中发育的分生组织[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba或者在对白色云杉的芽芽开始后，在针原胚胎发生后形成的结节[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba］.然而，这些结构的细胞布置更接近典型的道格拉斯 - 冷聚氧化聚合物的布置，具有宽的纯商体状部件，其连接到形成紧凑型电池“封装”的悬浮件部分[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］.然而，位于该“封装”中的细胞完全松散地布置，并且不是在2的聚氧化铝中心中伸长gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行。分生组织样部分由非常薄的一层密集的细胞质细胞组成，其他细胞空泡化，积累次生代谢物。可被视为可分裂胚胎头的部分是罕见的。这些结构在2中都没有观察到gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba也没有3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba尽管除了在SD4-2和SD4-6中的良好组织的双极SES之外，除了在SD4材料中观察到的一些类似的结构。总之，重复体细胞胚胎发生明显改善了EMS组织。在成熟后的子叶内SES的产量增加可能是由于小SES频率的增加，以及减少多元化中心的尺寸（如我们观察到3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaSD4-8-2行)。或者，这可能与多胚发生中心的组织有关，它们形成了大小非常相似的不同的胚胎头簇，正如在SD4-8-1中观察到的那样，在SD4-8-3中更明显。gydF4y2Ba

重复体细胞胚发生降低了Douglas-fir EMs中非胚胎发生细胞簇的丰度gydF4y2Ba

当EMS在团块中培养时，在丛的表面上发生高度明显的活性和生长的聚酰杂化中心或单一的早期SE，而内部部件通常由染色悬浮池或整个SES组成。这些组织导致了Douglas-FiR EMS的大部分调查线条，尤其是3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线，具有粒度外观（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。其他增殖胚胎发生系的相似形态gydF4y2BaPINACEAEgydF4y2Ba物种,如gydF4y2BaPinus Pinaster.gydF4y2Ba已经观察到，与胚胎头部和悬浮镜的一些形态特征相关[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba](以及其中的参考文献)。在gydF4y2BaPinus Pinaster.gydF4y2Ba研究表明，EM簇的外部部分比内部部分具有更高的胚胎发生潜力。我们过去研究各种针叶树的经验表明，EMs的白色部分通常具有最高的胚胎发生潜力，因此我们收集了详细的组织学研究。尽管我们仔细选择了样本，但组织学研究令人惊讶地发现，在EMs附近存在NECs细胞，特别是在1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba基因型TD17和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaSD4行(附加表S1)。这种NEC簇，由不仅积累淀粉粒而且积累酚类化合物的细胞组成，被认为是木本植物离体繁殖的主要障碍之一[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］.组织培养的褐变(在我们的道格拉斯冷杉株系中观察到，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1和附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：图S1）通常由累积酚类化合物的氧化产生。据报道，褐变是一种高氧化应激的结果，最终可能导致细胞死亡[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba[从而降低培养物再生能力。我们观察到具有酚类内容物的细胞，也可以作为NEC簇的部分或作为个体松散排列的组。在1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba在SD4系中，多胚发生中心的大分生组织样部分也存在酚类含量的细胞。组织中酚类物质的氧化过程可能会对1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行,特别是TD17。因此，减少含有酚类化合物的NECs数量是重复体细胞胚发生的另一个理想效果。我们发现在2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行TD17-1和SD4-2，在3中接近于零gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba从SD4-8引起的线。gydF4y2Ba

蛋白质组学分析表明，在体细胞胚胎发生的“植物发育”过程中，蛋白质与植物生长信号的相互作用十分重要gydF4y2Ba

我们比较了两者的蛋白质谱gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba对2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba鉴定额外一轮体细胞胚胎发生可能的蛋白质组效应的系。在两种蛋白质组学分析中(总体2293-2554,4813)检测到的蛋白质比以前基于二维凝胶电泳的分析更多[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]证实了鸟枪iTRAQ技术在鉴定和定量蛋白质方面具有更大的潜力。这通常对所有植物物种都有效，但道格拉斯冷杉转录组的可用性使蛋白质鉴定的成功率比普通方法高出30%gydF4y2Ba云杉glaucagydF4y2Ba数据库。主成分分析显示，线路类型(1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba， 2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba， 3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba)在这两种基因型的这一大组已鉴定蛋白的表达模式中占观察到的总变异的大部分。gydF4y2Ba

检测到比较的胚胎源性系中的总蛋白质含量没有显着差异。然而，大量蛋白质的表达受细粒胚胎发生循环的影响（162和228分别在第二和第三循环后显着上调或下调）。功能分析表明，大多数这些显着的蛋白质主要参与代谢和细胞过程。众所周知，胚胎培养能力伴有植物，包括针叶树（在[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)通过积极的代谢变化和发育过程[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba以及细胞重组[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］.有趣的是，我们观察到，在第二个周期后，一组特定的重要蛋白质的大多数普遍“下调”，而在第三个周期后，另一组的大多数普遍“上调”(包括这两组中只有33种常见蛋白质)。因此，至少在我们的测试条件下，在Douglas-fir的每个体细胞胚胎发生周期后，明显建立了重要蛋白质的特定表达模式。这表明，体细胞胚胎发生的诱导可能通过激活染色质修饰因子或其他表观遗传调控因子，促进基因表达模式的大的全基因组变化。这种基因共表达的全球性变化已在各种针叶树中报道过，如gydF4y2Ba挪威云杉gydF4y2Ba在胚胎发生的初期[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]，和gydF4y2BaPinus Pinaster.gydF4y2Ba由调控信号诱导的胚胎发育阶段之间的过渡。后一项研究强调了几个表观遗传调控机制涉及阶段到阶段的转变。gydF4y2Ba

两种GO分析均鉴定了与重要蛋白质相关的生物过程(表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，附加表S4和图2。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）和筛查书目数据。所得到的网络，显示在其参与生物过程和/或与调节因子或感应信号的相互作用之间的显着蛋白质之间的连接，如图4所示。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba．基于蛋白质网络的蛋白质组学结果解释是一种强大的方法，但有一些局限性。首先，它只突出了网络中连接的蛋白质。其次，所用的书目数据库是专用的gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba，所以由此产生的网络不可避免地错过了木质，多年生植物的网络的重要元素。第三，胚胎图案仍然是一个较差和复杂的过程，涉及至少300-450个基因的受调节网络[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

根据指定的生物过程和功能类别讨论重要的蛋白质可能会因蛋白质可能参与几个途径而变得复杂。因此，我们将在四个章节中讨论与体细胞胚胎发生周期相关的蛋白质组学变化，这些变化影响“植物发育”、“蛋白质水解”、“生长调节剂和多酚信号传导”以及“应激和氧化还原反应”。gydF4y2Ba

次级和初级胚胎发生系之间的蛋白质组差异gydF4y2Ba

工厂的发展gydF4y2Ba

胚胎发生的蛋白质组学研究经典报道了成熟期间或在具有可变胚性潜力的线之间的主要代谢增加[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]. 因此，我们的结果表明，超过50%的重要蛋白质参与初级代谢，这与以往的研究是一致的。我们的GO分析和组织学结果也证实了程序性细胞死亡（PCD）在体细胞胚胎发生的各个阶段中的重要性，包括EMs中增殖早期胚胎向子叶的分化[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］.此外，在GOS的浓缩分析期间，该过程与我们的组织学结果一致。少量蛋白质与PCD直接相关，或者通过与黄酮类化合物，茉莉酸，氧化应激和蛋白水解的相互作用间接相关（表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3B, C, E, F)。因此，文献中引用了这些主角之间的强相互作用，如下面的章节所讨论。ERD9，谷胱甘肽s -转移酶(GST)，在2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba系，与“植物发育”的生物过程直接相关，并在植物氧化应激调节中发挥着众所周知的作用[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]，以及体细胞胚胎发生[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］.在2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba系中，假定的甲基转移酶DDB可能通过参与已知的促进胚胎发育的表观遗传机制而成为胚胎发生潜能增加的关键中介[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］.更具体地说，胚胎发生期间的高水平甲基化与染色质重塑有关，允许参与胚胎发生的基因表达[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］.因此，在2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行。已知泛素蛋白连接酶与称为泛素−/小泛素相关修饰(SUMO)的染色质修饰基因的激活有关，从而导致基因表达的全局修饰(见[gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba在其中引用）。EP3 Chitinase也在第二和第三细胞胚胎发生产生的线上上调。这是一致的，表明几丁酶在SES发育中发挥重要的非防御作用，以及胚胎源性线中的碳和氮代谢[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]，以及体细胞和Zygotic胚胎的发展[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］.几章酶也与植物中的PCD相关[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

蛋白水解gydF4y2Ba

观察到的胚胎潜力的增加显然伴有蛋白质的显着降解和再循环，而总蛋白质含量仍然大致恒定（附加表S2和S3）。这些结论得到了转入富集的支持（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)和组织蛋白酶b样蛋白的存在，可能的E3泛素蛋白连接酶ARI1和丝氨酸羧肽酶在第二和第三体细胞胚胎发生周期中显著上调的蛋白组(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.调查结果还强调蛋白水解在增加胚性潜力时的重要性[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］.组织蛋白酶b样蛋白是一种半胱氨酸蛋白酶，在靶蛋白降解中起关键作用，参与胚胎发生、植物防御和PCD [gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］.它在胚性愈伤组织中的存在与这些组织的多能性和细胞重编程的维持有关[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］.可能的E3泛素 - 蛋白质连接酶ARI1也参与蛋白质回收，作为遍在蛋白/ 26s蛋白酶体复合物的一部分。对于泛素蛋白连接酶作为正确的胚胎发育的鲁棒标记，已经获得了实质性支持gydF4y2BaPinus Pinaster.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba］.在这一蛋白质更新途径中确定的最后一个蛋白是aba诱导的丝氨酸羧肽酶，参与次级代谢和应激反应[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］.这两个生物过程在诱导过程中根据蛋白质网络进行了修改，并将在下一节进行讨论。最近的一项研究表明，丝氨酸羧肽酶在胚胎发生中具有积极作用，更具体地说，是多胚胎发生的诱导[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]. 最后，该蛋白的表达受病原体反应途径和茉莉酸的调控[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]植物生长调节剂，其在重要蛋白质网络中连接几种蛋白质（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

由植物生长调节剂和多酚的信号传导gydF4y2Ba

植物信号通信网络对于控制每​​种胚胎发生阶段的控制至关重要，从EMS的增殖通过成熟到萌发。因此，蛋白质组学比较证明了几种信号化合物在2中的参与gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba通过突出与各种显着激素响应蛋白的相互作用来突出细胞胚胎发生。茉莉酸是最多的连接。除了一个（L-半乳酰-1,4-内酯脱氢酶）外的所有相关蛋白质在1中表达更强烈gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba比2行多gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行。一些研究已经检测到茉莉酸对SEs成熟的积极影响[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］.这种调节因子，如ABA和水杨酸，主要与生物和非生物胁迫有关[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]，如蛋白质网络的连接所示。与茉莉酸相关的蛋白质也与氧化石墨烯相关的类黄酮、花青素和/或花青素的合成，这些都是次级代谢产物，在细胞发育功能中充当信号[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］.这类代谢物的过量已被证明会阻碍胚胎的发生，因为它们似乎会诱导无极化或不规则结构的NECs细胞的形成[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba］.类化合物相关的蛋白质在2中下调gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba系，这可能解释了它们较高的胚胎发生潜力。这些类黄酮在细胞中扮演重要角色，因为它们与氧化应激反应有几个联系[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba］.黄酮类化合物是多酚（衍生自苯丙烷的化合物），和苯丙氨酸氨 - 裂解酶（PAL）是其涉及其来自氨基酸苯丙氨酸的致密合成的第一种酶。黄酮类化合物是多酚（衍生自苯丙烷的化合物），和苯丙氨酸氨 - 裂解酶（PAL）是其涉及其来自氨基酸苯丙氨酸的致密合成的第一种酶。在1中强烈表达了两个pal样蛋白质gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线，表明苯丙醇合成途径的活化和苯丙氨酸代谢，其可以解释它们的相对高的多酚含量（图。gydF4y2Ba4 c, hgydF4y2Ba）和棕色。gydF4y2Ba

压力和氧化还原反应gydF4y2Ba

氧化应激，影响细胞培养物的各种应力之一，似乎是体细胞胚胎发生的关键因素[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]，似乎遵循ROS的大量生产（反应性氧气）。根据其浓度，这些分子可能在细胞显影中发挥拮抗作用。例如，过量生产ROS损害胚胎源性分化[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]，但防止它们的产生也会抑制SEs的发展[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］.这是因为它们对细胞有毒，但在对生物和非生物胁迫的反应中充当信号分子。由于ROS可能致命细胞，它们的存在诱导了调节细胞氧化还原体系的许多蛋白质的合成。ROS参与PCD激活[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]，从而参与胚胎的正常发育[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］.参与氧化应激反应的蛋白质可能不同，这取决于胚胎发生的阶段。例如，据报道，过氧化氢酶在增殖和器官发生阶段比其他阶段更丰富[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]，在非胚性愈伤组织中表达强于在胚块中表达[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba］.因此，我们发现PCD效应蛋白CAT3 (catalase同工酶1-like)蛋白在1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线比在较胚胎源性2中gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行。相反，一些过氧化物酶(已经在防御机制中确立，如氧化应激反应[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba81gydF4y2Ba，以及增殖和成熟)在2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线。参与氧化还原反应的NAD（P）结合Rossmann折叠蛋白在2例中也上调gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线，相对于1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线。相反，其他可能参与ROS反应的蛋白在2个细胞中表达下调gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba例如GST ERD9和pal样蛋白。如前所述，后一种酶与黄酮和多酚之间的关系已经建立。GSTs是一个多基因家族，可能参与生长素反应，次级代谢产物(花青素)的产生，并赋予黄酮抗氧化活性[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

总之，通过重复的体细胞胚胎发生循环在扩散过程中，胚胎发生的特征生物学过程，例如“植物开发”，“防御”和“胁迫”（特别是氧化）和“蛋白水解”受到影响。此外，主要结果是鉴定与黄酮相互作用的许多蛋白质，并且在第二个体细胞胚胎发生循环之后下调相关的次级代谢物。gydF4y2Ba

三级和二级胚胎发生系之间的蛋白质组差异gydF4y2Ba

3.gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba各品系的胚胎发生潜力大于1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba行，并比较2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba细胞系的蛋白质组显示，在第二和第三个体细胞胚胎发生周期之后，同样的生物过程被激活。因此，“植物发育”、“蛋白质水解”、“胁迫/水分胁迫”、“防御反应”和“生长调节剂”等生物学过程也出现在与第三个周期相关的重要蛋白质衍生的网络中。gydF4y2Ba8B.gydF4y2Ba）.然而，这些蛋白质通常与与第二周期相关的蛋白质不同，只有33个蛋白质存在于两组“显著”蛋白质中(即在2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2BaEMS，2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba和3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba在390中，EMS）总共确定了显着的蛋白质。此外，在两个循环后，只有12个被上调或下调。这些发现表明，胚胎诱导是改变细胞的蛋白质组物组成的复杂过程。通过将子叶细胞的SES转移到含有唾液的适当培养基中触发诱导。在三个体细胞胚胎发生循环期间的反复摄入植物蛋白可能会影响EMS，因为养羊酸相互作用（gydF4y2Ba在其他事物之外gydF4y2Ba）具有类黄酮，ABA，茉莉酸和水杨酸[gydF4y2Ba84.gydF4y2Ba］.水杨酸参与植物生长的调节，以及生物和非生物胁迫的反应[gydF4y2Ba85.gydF4y2Ba，也与类黄酮有强烈的相互作用[gydF4y2Ba86.gydF4y2Ba和茉莉酸。因此，这些变化不可避免地影响了3的蛋白质组组成gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线条，然后表达对关键信号化合物的代谢敏感的基因（图。gydF4y2Ba8B.gydF4y2Ba）调节细胞生长和分化[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba88.gydF4y2Ba］.在3gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线和组织学结果表明，相应的EMS在更高级的胚胎发生阶段。3.gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba线条似乎是由具有更有组织的胚胎头的EMs组成，可能有更多的分裂。gydF4y2Ba

总之，通过激活与应力和防御反应的机制，与生长调节剂相互作用的机制来获取胚性特征，并在与间接相关的“代谢过程”和“植物发育”的生物过程相关的蛋白质表达中。gydF4y2Ba

重复的体细胞胚胎发生通过增加小的胚胎干细胞的频率和减少多胚中心的大小来改善胚胎干细胞的结构。胚胎发生的每一个周期都会引起与体细胞胚胎发生相关的生物过程相关的蛋白质表达的改变，但缺乏先前已知的与EMs（防御和应激反应，以及各种植物发育代谢和蛋白水解过程）的关联。蛋白质网络在蛋白质组学分析中的创新应用已经非常确凿。它提供了有价值的信息，揭示了在第一和第二个体细胞胚胎发生周期后重要蛋白质的普遍下调和上调。在这两种情况下，与各种植物生长信号因子（类黄酮和相关化合物、茉莉酸、ABA、生长素、水杨酸）的相互作用是变化的主要因素，表明细胞利用不同的蛋白质调节途径来增加胚性潜能的能力，并产生更适合成熟的SEs。总的来说，首次报道了针叶树（尤其是花旗松）连续两个体细胞胚胎发生周期后EMs的细胞和分子变化，这将有助于加深对2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba胚胎源性线。gydF4y2Ba

这些发现还可以帮助实际应用。由于广泛的亚栽培，许多实验室现在具有精英细胞胚胎源性系的质量恶化的问题。本文中描述的方法可能具有很大的益处，可以重新加入这些有价值的经过验证的生产克隆。gydF4y2Ba

1gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

基本的gydF4y2Ba

2gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

中学gydF4y2Ba

3.gydF4y2Ba^ry.gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

三级gydF4y2Ba

阿巴：gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

D.W.:gydF4y2Ba

干重gydF4y2Ba

EMs:gydF4y2Ba

胚胎质量gydF4y2Ba

F.W.:gydF4y2Ba

鲜重gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

质/女士:gydF4y2Ba

液相色谱耦合到串联质谱法gydF4y2Ba

nec公司:gydF4y2Ba

Non-embryogenic细胞gydF4y2Ba

纤毛运动:gydF4y2Ba

程序性细胞死亡gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

SES：gydF4y2Ba

体细胞胚胎gydF4y2Ba

SNEA:gydF4y2Ba

子网富集分析gydF4y2Ba

我们希望在蛋白质组学数据的统计分析中感谢VincentSégura博士。Cathy Hargreaves博士为她乐于助人的评论而感谢地承认。gydF4y2Ba

我们也感谢seees -editing(英国)在英语编辑方面的出色工作。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

我们感谢卓越森林资源和木材利用主席对向弗洛里安·戈蒂埃(批准号:na15 - 298)。gydF4y2Ba

部长级资助项目奎萨雷（第NO.C-2014-09）部分支持生物化学分析。该组织学分析及其解释部分得到了捷克共和国的教育部，青年和体育部的支持（授予NO.TC17030）。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

在目前的研究中生成和/或分析的数据集可通过ProteomeXchange Consortium数据库的PRIDE存储库获得，该存储库的数据集标识符为PXD008347。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Caroline Teyssier和Marie-Anne Lelu-Walter同样为这项工作进行了贡献。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. Biofora，InRA，Onf，F-45075，奥尔良，法国gydF4y2Ba

   Florian Gautier，Jean-CharlesLeplé，Claire LeMetté，Caroline Teysier＆Marie-Anne Lelu-WaltergydF4y2Ba

2. SylvaLIM，利摩日大学F-78060，法国利摩日gydF4y2Ba

   弗洛里安·戈蒂埃和盖伊·科斯塔gydF4y2Ba

3. 捷克科学院实验植物学研究所，Rozvojová263，165 02，Praha，6-Lysolaje，捷克共和国gydF4y2Ba

   KatežinaEliášová＆ZuzanaVondrákovágydF4y2Ba

4. Biogeco，Inra，大学波尔多，F-33610，Cestas，法国gydF4y2Ba

   Jean-CharlesLeplégydF4y2Ba

5. platforme Protéome, Génomique Fonctionnelle中心，波尔多大学，F-33000，波尔多，法国gydF4y2Ba

   Anne-Marie LomenechgydF4y2Ba

6. University Clermont Auvergne，Inra，Piaf，F-63000，Clermont-Ferrand，法国gydF4y2Ba

   菲利普标签gydF4y2Ba

7. PôleBiotechnologieet SylvultuctureAvancée，FCBA，校区Forêt-BoisdePierroton，F-33610，Cestas，法国gydF4y2Ba

   Jean-FrançoisTrontingydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

FG参与收购数据，进行了体细胞胚胎发生和蛋白质分析，并帮助起草了手稿。Ke进行了组织学和显微镜分析并起草了手稿。JCL进行了子网富集分析，并帮助起草了手稿。ZV进行了组织学和显微镜分析，并帮助起草了手稿。AML进行了质谱分析并帮助起草了手稿。CLM进行了体细胞胚胎发生并收集了材料。PL有助于设计研究并帮助起草稿件。GC帮助设计了这项研究，并帮助起草了稿件。JFT帮助设计了研究并起草了稿件。CT协调研究，进行蛋白质和蛋白质组学研究，亚网络浓缩分析和起草稿件。 MALW conceived and coordinated the study, carried out somatic embryogenesis and drafted the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

通讯作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaCaroline TeyssiergydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

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