鉴定大麦抗斑点斑点的50 k illumina-chip Snps

背景

斑斑，由Cochliobolus巨大成功是大麦中传播最广、危害最大的病害之一。与抗性相关的遗传位点鉴定c .巨大成功对未来的标记辅助选择具有重要意义。目前研究的目的是鉴定具有对两种不同病型的幼苗抗性的基因座c .巨大成功在西伯利亚春大麦核心收集。

结果

共有96个春季大麦品种和线在幼苗阶段表现出两种c .巨大成功分离株(Kr2和Ch3)。根据Fetch-Steffenson评分量表，Kr2/Ch3分离株的耐药基因型分别为16%/17%和26%/30%。利用50 K Illumina Infinium iSELECT分析了94个基因型。在44,040个snp中，有40,703个snp可以得分，其中39,140个snp具有多态性。27,319个snp通过了过滤阈值，用于关联映射。GLM数据分析显示Kr2和Ch3分离株分别有48和41个SNPs。经5% Bonferroni倍数试验校正后，仅鉴定出3个snp, 27个snp。共有3个基因组区与抗性相关。3H染色体上与ch3抗性相关的区域在SCRI_RS_97417和JHI-Hv50k-2016-158003之间扩增，共包含11个SNPs，其中JHI-Hv50k-2016-157070、JHI-Hv50k-2016-156842最低p- 值。在KR2分离物的情况下，这两个SNP也是显着的。染色体的区域2h包括16个基因座（其中7个，其中7个p-values紧密链接到BOPA2_12_11504)。与该区域相对应的三个位点具有暗示性p- 在KR2测试的情况下，染色体2h的基因座也可能有助于抵抗KR2分离物。第三个区域具有重要意义p-Value在KR2测试的情况下，在Locus Jhi-HV50K-2016-33568的染色体上鉴定出染色体1H。

结论

三个基因组区域与对一个或两个分离株的抗性有关c .巨大成功经西伯利亚春大麦核心种质筛选鉴定。将其与之前在双亲本定位群体研究中发现的qtl或与不同种质和其他分离株的GWAS进行比较，结果表明Kr2和Ch3的抗性位点是由已知的斑点抗性位点决定的。有关SNP相关的信息可以进一步用于开发DNA标记，方便诊断大麦育种计划中的抵抗相关等位基因的诊断。

斑斑，由Cochliobolus巨大成功是大麦中传播最广、危害最大的病害之一。与抗性相关的遗传位点鉴定c .巨大成功这对诊断性dna标记的进一步发展具有重要意义，可用于抗病品种的加速选育。与斑点病抗性相关的基因组位点检测主要采用两种方法:(1)双亲本作图群体的qtl分析;syn。-关联映射(AM))。

对12个双亲本作图群体的qtl分析揭示了大麦所有染色体抗斑点病的位点[1那2那3.那4.那5.那6.那7.］．关联定位法也已成功地应用于新位点的鉴定，利用不同的种质资源如野生大麦[8.]，美国大麦育种种质[9.，弗吉尼亚理工大学冬季大麦系[10.]，源自拉丁美洲的种质[11.，以及美国农业部大麦核心收集[12.］．这些研究积累的数据一方面提供了新的抗斑点病基因的信息，另一方面验证了AM方法，证实了双亲本群体的研究结果。例如，在这些出版物中最早的[8.， 13个位点代表c .巨大成功在1H、2H、3H、5H和7H染色体上发现抗性位点，其中7个位点为新位点，6个位点为双亲本定位群体分析确认的qtl。上述最新的AM研究[12.]报道了10条与斑斑相关的染色体区域，其中6条是新发现的，说明不同种质调查和检测效果不同c .巨大成功检测新的斑点病抗性位点的小种。AM方法尚未广泛应用于俄罗斯大麦种质资源的研究，尤其是西伯利亚大麦种质资源的研究。

目前研究的目的是鉴定具有对两种不同病型的幼苗抗性的基因座c .巨大成功利用50 K Illumina单核苷酸多态性芯片对西伯利亚春大麦核心种质(Kr2和Ch3)进行筛选。

表现型

大麦基因型展出的IRS（感染响应）通常在每个实验中的三次重复之间同意。在图2中给出了大麦基因型的平均IRS的频率分布。1．只有3个品种(G-19980、Biom、AC 0760258)表现杂合度，因此排除在进一步分析之外。大部分大麦基因型(43.0%)对两种病均敏感c .巨大成功隔离;53%与Ch3和58%与Kr2 (IRs - 6-9)。9个品种对两种菌株均有抗性:B-1、G-21219、Kolchan、Mutant 68、Omsky Golozyorny 2、Severny、Signal、Svetik和Tanay。16个品种在分离Ch3和15时表现出抗性反应(IRs - 1-3.9)。中等阻力(IRs - 4.0-5.9)至c .巨大成功29个品种分离出Ch3, 24个品种分离出Kr2。品种Emelya、impulse、Kedr、Merit 57和Reyd表现出分离(小种)特异性抗性，对一个分离物敏感，对另一个分离物抗性。11个中抗品种对分离出的Ch3易感，8个中抗品种对分离出的Kr2易感1）.

基因分型和GWAS分析

利用50 K SNP iSelect序列对94份春大麦材料进行基因分型，共包含44,040个SNP位点，其中有40,703个位点得分。共有39140个snp(89%)具有多态性。聚类分析的结果显示大麦品种之间的关系在附加文件中2．聚类分析结果显示，供试材料分为4大类，分别为38、7、19、30个基因型。

对基因分型数据集进行质量控制筛选后，共筛选出27,319个snp(62,0%)用于GWAS。通过GLM数据分析，分别检测到48和41个与Kr2和Ch3评分显著相关的SNPs(见表)1和2额外的文件3.）.应用Bonferroni多次试验修正后，修正量为5% (p< 1.8302E-6)， 48个SNPs中只有3个对分离Kr2评分有显著性(表1），而对于41的CH3 27有重要意义p值(表2）.

共有3个基因组区域与抗性相关。3H染色体上与ch3抗性相关的区域在SCRI_RS_97417和JHI-Hv50k-2016-158003之间扩增，共包含11个SNPs，其中JHI-Hv50k-2016-157070、JHI-Hv50k-2016-156842最低p值(表2）.这两个单核苷酸多态性也与对Kr2分离株的抗性显著相关(见表)1）.染色体的区域2h包括16个基因座（表2)，其中7个得分最低p-values紧密链接到BOPA2_12_11504。与该区域相对应的三个位点具有暗示性p在Kr2测试的情况下(表1))，因此2H染色体上的位点也可能对kr2分离株产生抗性。第三个区域具有重要意义p- 在染色体上鉴定染色体1H，在轨迹JHI-HV50K-2016-33568中鉴定出，它与KR2抵抗有关（表1）.所确定的基因组区域如图所示。2使用iSelect链接映射。

单核苷酸多态性分析最低p-值作为标记位点转化为方便的诊断标记，表明部分单核苷酸多态性在抗病品种鉴定中具有较高的准确性。例如，19个抗病品种中有14个(74%)在JHI-Hv50k-2016-157070位点具有c -等位变异特征。该等位基因还检测到另外4个品种对一个或两个分离株有中等抗性，但对两个分离株都没有敏感的基因型。

在94份材料中，47份(50%)是在西伯利亚育种中心培育的品种和品系。其余47份为西伯利亚春大麦种质，但来自其他地区和国家。聚类分析显示了4个主要的加入组(附加文件2）.由38个(组I)和30个(组IV)基因型组成的两个大群体中，西伯利亚品种和株系的比例差异显著(分别为73%和17%)。第二组和第三组为“半西伯利亚”(附加文件)2）.ⅰ组对两种菌株均有抗性的品种百分率最高c .巨大成功（其他三组18％vs，3和5％），敏感品种的最低百分比（32％vs 47,48和其他组中的50％）到两个分离株（附加文件2）.这表明西伯利亚品种在春大麦抗性种质研究中发挥了重要作用。事实上，我们注意到，在对两种菌株都有抗性的材料中，67%来自西伯利亚。

GWAS发现了三个基因组区域(在染色体1H, 2H和3H)与对一个或两个分离株的耐药性有关(表)1和2,无花果。2）.尽管本研究的样本量较小，但我们没有发现假阳性基因座。比较在我们的研究中确定的三个基因组区域的位置c .巨大成功前面揭示了电阻QTLS，表明三个区域中的每一个含有已知的斑点斑块电阻基因座。

染色体1 h

SNP与抗c .巨大成功Kr2分离株位于染色体1H遗传图谱的50 ~ 60 cM之间。在50和60 cM范围内，大麦染色体1H存在抗斑点病QTL。1996年，Steffenson等人[1报告了成人抵抗的QTLc .巨大成功染色体1H标记ABG500-ABG494 (53.6-61.2 cM，根据共识图[13.])。2005年，Bilgic等人[2]在同一地区用Steptoe / Morex (R)定位群体发现了主要抗性位点。2010年，Roy等人[8.通过关联作图，在59.7 cM处发现了苗期抗性位点。

随后，在40和50 cM范围内的大麦1H染色体上发现了抗斑点病位点。Gutierrez等人在2013年报道了与该区域的关联[11.他使用am方法利用dart标记。与此同时，周和斯蒂芬森[9.在1H染色体41-43 cM处发现了成苗抗性位点(与BOPA SNP标记11_10764、11_10275和12_30336相关)。2015年，Afanasenko等人[7.]发现了苗期抗性的QTL (snp位点BOPA11_10764，syn。bopa1_5381 - 1950;通过对Zernogradsky 85 (R) / Ranny 1双亲本作图群体的分析，确定其在iSelect map - 41.5 cM中的位置。2016年，Haas等人[6.]发现了苗期抗性的QTL (snp位点BOPA2_12_30404;PI 466423 (R) / Rasmusson双亲本居群分析最近，Wang等人[12.[报道了区域42-44cm（标记SCRI_RS_19392，SCRI_RS_153785，SCRI_RS_170878，SCRI_RS_170869，SCRI_RS_189483，BOPA1_5381_1950）的关联，具有幼苗抵抗力。

本研究在1H染色体上发现的抗性QTL可能与之前在40-60 cM区间内发现的QTL一致[1那2那6.那7.那8.那9.那11.那12.］．除了40-60厘米内的染色体区域之外，染色体1H的两个区域与抗点斑点的抗性相关：长臂的远端部分（1HL; QTL在SNP-LOCUS BOPA_11_10433中。syn。bopa1_3201-603;Iselect地图中的位置 - 87.0 cm [7.])和短臂(1HS;基因rcs6.在加利福尼亚州。15厘米[3.那14.]， QTL位于dart位点bbp - 9604;16.9厘米(5.])。

染色体2 h

我们在2H染色体上发现的Ch3分离株抗性区域(57-60 cM)有16个SNP位点(表)2）.与该区域相对应的三个SNP位点提示p在Kr2测试的情况下(表1)，因此2H染色体上的抗性位点也可能对kr2分离株产生抗性(图2)。2）.

本研究在2H染色体上发现的抗性QTL可能与之前鉴定的苗期抗性QTL一致[2那7.］．2005年，Bilgic等人[2]利用Steptoe / Morex (R)定位群体，在27.1 ~ 46.9 cM (Rbcs-ABG459)区间内检测到QTL。后来，Afanasenko等人[7.]发现snp位点BOPA_11_11015的QTL (syn。bopa1_946 - 2500;通过对Zernogradsky 85 (R) / Ranny 1双亲本作图群体的分析，确定其在iSelect map - 54.2 cM中的位置。

除了这种染色体区域之外，染色体2H的另一部分（长臂的远端部分）与抗点斑的抗性相关。Wang等人。[12.]与SCRI_RS_152664 (138.6 cM)显著相关。

染色体3 h

与ch3抗性相关的3H染色体区域在标记SCRI_RS_97417和JHI-Hv50k-2016-158003之间扩展，包含11个SNPs，其中JHI-Hv50k-2016-157070、JHI-Hv50k-2016-156842最低p值(表2）.这两个单核苷酸多态性对Kr2菌株的抗性也很显著(见表)1）.遗传标记位置为12.1 cM。

在我们的研究中，在染色体上发现的抗性QTL可能与一些先前识别的QTL相一致。Bovill等人。[4.在3H染色体2 ~ 28 cM范围内，利用不同的定位群体发现了植株抗斑点病的qtl。后来，周和斯蒂芬森[9.在3H染色体上9.6 cM(标记BOPA_12_30818)和19.2 cM(标记BOPA_11_20742、BOPA_11_10565)位点发现了苗期和成虫抗性位点，并利用关联作图法进行了分析。

还发现了染色体上的更多近端位置。Bilgic等人。（2005）揭示了使用STEPTOE / MOTERX（R）映射群体的间隔28.7-42.4（标记ABC171-MWG584）中幼苗抵抗的基因座。GREWAL等人。[5.利用CDC Bold / TR251杂交组合的DH重组品系(R)，发现苗期抗性QTL位于24.9-31.1 cM(标记bPb-3565)，成株抗性QTL位于23.0-24.9 cM(标记bPb-6127)和31.8-43.3 cM(标记E40M61.1)。12.]报道了3H染色体上的两个区域，分别与25.3 cM处的BOPA1_3906_558和66.2 cM处的BOPA1_5960_1302相关。

三个基因组区域与对一个或两个分离株的抗性有关c .巨大成功经西伯利亚春大麦核心种质筛选鉴定。将其与之前在双亲本定位群体研究中发现的qtl或与不同种质和其他分离株的GWAS进行比较，结果表明Kr2和Ch3的抗性位点是由已知的斑点抗性位点决定的。与Kr2和Ch3菌株抗性相关的SNPs信息和品种抗性评价结果可为进一步的分子标记辅助选择提供依据。snp可以转化为方便的诊断标记(如CAPs)。品种B-1、G-21219、Kolchan、Mutant 68、Omsky Golozyorny 2、Severny、Signal、Svetik和Tanay可作为抗斑点病稳定供体。

植物材料

选取西伯利亚春大麦核心种质96份材料进行表型分析。其中一半是在西伯利亚(阿勒泰、布里亚特、伊尔库茨克、克麦罗沃、新西伯利亚、鄂木斯克、托木斯克、秋明和雅库蒂亚)育种中心培育的品种和品系。另外一半的品种和品系保存在西伯利亚春大麦收集，但来自俄罗斯联邦的其他地区(阿尔汉格尔斯克、车里雅宾斯克、达吉斯坦、基洛夫、克拉斯诺达尔、列宁格勒、莫斯科、奥伦堡、Primorsky、罗斯托夫、萨马拉、斯塔夫罗波尔、斯维尔德洛夫斯克、或其他国家(埃塞俄比亚、德国、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、瑞典、瑞士、乌克兰、美国、也门)。植物生长在塑料托盘(12×17厘米,7厘米深度)装满土壤“Terra维塔”(标准受精(15-27-30,氮磷钾)泥炭和幼苗土壤)的混合物在气候室在20 - 22°C与交替16 h光明/ 8 h的黑暗时期(曝光5000 lx)。采用完全随机设计，3个重复，每盘2株各基因型和品种Harrington作为敏感对照进行抗性评价。

病原菌分离及培养条件

二c .巨大成功利用不同来源的分离株进行幼苗抗性评价:Ch3(俄罗斯西北部列宁格勒地区)和Kr2(俄罗斯欧洲南部克拉斯诺达尔地区)。在以前的研究中，分离物Ch3已被用于广泛的大麦基因型的抗性评价，并对敏感大麦基因型表现出很高的攻击性。选择Kr2菌株是由于其起源和产孢能力强。这些分离株来源于2015年的单个分生孢子，在4°C的CLM培养基(含乳糖和尿素的改良Czapek培养基)中，置于玻璃管中，培养基中(g / 1 l): 0.5 KH2PO4, 0.5 MgSO4, 0.5 KCl, 1.2尿素，20乳糖和20琼脂。

分离菌株在相同的培养基上继代培养，20-22℃，光周期12 h。10-12天后用蒸馏水浸泡培养物，用无菌抹刀去除分生孢子，并通过两层粗棉布过滤。用血球计测定分生孢子浓度，并调整至10000分生孢子/ml。

种植后12 ~ 14 d(2 ~ 3叶期)喷施分生孢子悬液接种植株。每盘(12份大麦)接种约10ml。接种后的植株用塑料袋覆盖，在相对湿度100%的黑暗条件下20-22℃培养24 h，然后在相同的温度下，在70% RH条件下培养16/8 h光暗周期。

感染反应评估

采用Fetch和Steffenson的1 - 9评分标准，记录接种后10天2- 3叶期的感染反应(IRs) [15.］．该规模基于病变大小和相关氯化度的程度。低IRS 1.0-3.9（分钟到没有或非常轻微漫射边缘氯仑的小坏死病变）对应于抗性（R），4.0-5.9（中等大小的坏死病变，具有明显但毫无抗体的杂物余量） - 至中等抗性（MR），高IRS - 6.0-9.0（具有不同杂种杂物的大坏死病变和不同程度的扩张扩散氯化） - 对易感性[15.］．仅当敏感品种哈林顿表现出高IRs时，才记录反应类型。

DNA基因分型及数据分析

使用DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, CA, USA)从单株幼苗中提取DNA。所有样本均使用tritgenetics GmbH (Gatersleben, Germany)的5万份Illumina iSelect SNP序列进行基因分型。

系统发育分析使用MEGA软件v6.0进行[16.］．遗传关系通过最大似然(ML)分析，Tamura-Nei模型计算。引导重复次数为500次。

使用Excel软件过滤SNP数据集。最小等位基因频率≥0.10的标记被考虑为GWAS。删除数据缺失的标记。GWAS是在TASSEL 5包的帮助下使用GLM(广义线性模型)进行的[17.，基于表型(抗性得分为2c .巨大成功对94份大麦材料进行基因型分析(27319个信息snp)。关联分析后使用Bonferroni多重检验进行校正。从资源BARLEYMAP (http://floresta.eead.csic.es/barleymap[18.])及我选择(http://bioinf.hutton.ac.uk/iselect/app/）.

我们感谢ICG collection“GenAgro”(新西伯利亚，俄罗斯)和Tatiana Kukoeva和Yuri Grigoryev，他们形成并提供了春大麦核心收藏。我们也感谢tritgenetics GmbH (Gatersleben, Germany)利用50 K Illumina snp芯片对大麦品种和品系进行基因分型。

资金

出版费用由俄罗斯科学基金会资助(第16-14-00086号)。ICG植物生长核心设施中大麦植株的生长由ICG项目0324-2016-0001提供支持。

数据和材料的可用性

不适用。

关于这个补充

本文已作为一部分发布BMC植物生物学2017年第17卷增刊2:2017年Belyaev会议植物生物学文章选集。该补充的全部内容可在网上找到//www.cinefiend.com/articles/supplements/volume-17-supplement-2．

从属关系

1. 俄罗斯科学院西伯利亚分院细胞学和遗传学研究所，novsibirsk, 630090俄罗斯

   伊琳娜·别科娃，瓦迪姆·艾菲莫夫，艾琳娜·克莱斯特基娜

2. 俄罗斯植物保护研究所，圣彼得堡，俄罗斯，196608

   Nina M. Lashina和Olga S. Afanasenko

3. 新西伯利亚国立大学，Pirogova str. 1，新西伯利亚，630090，俄罗斯

   埃琳娜·k·Khlestkina

贡献

IVB进行DNA提取、种群结构和GWAS分析。NML评估感染反应。VME参与了种群结构和GWAS分析。EKK和OSA进行了实验设计，帮助解释数据和准备手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Irina诉Bykova．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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