小麦秸秆是欧洲最丰富的植物原料

背景

木质纤维素是植物生物量的结构组分，是自然界最丰富的可再生资源。木质素是最难降解的天然芳香族聚合物，其降解是一个巨大的挑战。目前，生物脱木素被特别关注，白腐菌由于强大的木素分解酶系统而在生物脱木素过程中起着关键作用。然而，真菌的种类，甚至是菌株，在产生高活性木质素水解酶和因此去木质素植物生物量的潜力是不同的。因此,研究的目标是描述Mn-oxidizing氧化物酶和漆酶的大量蘑菇以及确定其潜在delignify小麦草,植物原料,根据年度产量,需要首先在欧洲和世界上第二个。

结果

在麦秆发酵过程中，香菇HAI 858产生最活跃的锰依赖和锰不依赖过氧化物酶(1443.2 U L)⁻¹和1045.5 U L⁻¹分别)侧耳属eryngiiHai 711是最好的漆座生产商（7804.3 U L.⁻¹)．Zymogx上的可视化弯曲证实了这些活性，并证明了漆酶是所研究的物种中的显性木质素酶。Ganoderma lucidumBEOFB 435对木质素(58.5%)和半纤维素(74.8%)的降解能力较好，而纤维素(0.7%)基本保持不变。对木质纤维素的降解也有显著的选择性侧耳属pulmonariusHAI 573中木质素、半纤维素和纤维素的降解量分别为50.4%:15.3%:3.8%。

结论

根据上述结果，可以得出结论，由于木质素降解酶的特性和降解潜力，白腐真菌可能是各种生物技术过程的重要参与者，包括食品、饲料、纸张和生物燃料中木质纤维素残留物/废物的生物转化。

木质纤维素是植物生物量的一种结构成分，被认为是陆地环境中最丰富的可再生有机资源。它由浸在木质素网中的纤维素-半纤维素基质组成，木质素是最难降解的天然芳香聚合物[1］．虽然生物质脱木质素的方法多种多样，但由于工艺成本高、能源消耗大、排放对环境不友好的副产品等原因，这些方法普遍不令人满意[2］．由于化学，物理和物理和物理化学生物量预处理，其特征在于所有提到的短缺，最近对生物奖项有很大的兴趣[3.］．生物学方法的优点是显着的脱节选择性，低能量消耗，缺乏有毒的副产品和经济理由[4］．白腐菌在生物生物质预处理中占有重要地位，其具有强大的木质素分解酶系统，包括木质素和锰氧化过氧化物酶、漆酶和一些辅助酶[5］．酶的高效率基于它们的强氧化活性和低底物特异性，并取决于真菌物种/应变能力，氧化机制，木质纤维素性质和培养条件[6］．白腐菌具有显著的降解木质素的潜力，使其成为各种生物技术过程中的主要角色，如食品、饲料、造纸、生物燃料、纺织以及土壤和水修复[7］．

据丰富，小麦秸秆占据了欧洲的第一名，年收益率为1.7亿吨，而世界第二吨[8，9］．因此，它提出了一个很有希望的是各种产品中最便宜和最有用的原料的一种，可以在各种产品中进行[6]. 由于生物转化能力因真菌种类和/或菌株而异，因此本研究的目的是对所选蘑菇的锰氧化过氧化物酶和漆酶进行分析，并测定其麦秸脱木素潜力。

微生物和培养条件

研究物种/菌株的培养物从塞尔维亚、以色列、俄罗斯、乌克兰和英国收集的子实体中分离出来（表1）1并在贝尔格莱德大学生物系（BEOFB）的文化收藏中保持麦芽琼脂培养基。

接种100 mL合成培养基(葡萄糖，10.0 g L⁻¹；NH.₄不_3.， 2.0 g L⁻¹；K.₂HPO₄，1.0 g l⁻¹；不₂宝₄×H₂O, 0.4 g L⁻¹；MgSO₄×7 h₂O, 0.5 g L⁻¹；酵母提取物，2.0 g L⁻¹；pH 6.5)，室温(22±2℃)在旋转摇床(100 rpm)上培养，无菌蒸馏水洗涤3次，实验室搅拌器均质是制备接种物的主要步骤[10］．固体培养21天，在25℃下，在100 mL瓶中进行，瓶中含有2.0 g麦秸为碳源的底物，10.0 mL的改性合成培养基(不含葡萄糖)与3.0 mL的均质接种物接种。

测定酶活性和总蛋白含量

根据Stajić等人的方法[10]，通过用50.0mL DH的样品搅拌萃取所产生的细胞外酶₂o在4℃下磁力搅拌器10分钟。将所得提取物离心（4℃，3000rpm，15分钟），得到的上清液用于测量Mn-氧化过氧化物酶的活性[Mn依赖性过氧化物酶（MNP; EC 1.11.13）和酰上无关的过氧化物酶（MNIP; eC 1.11.1.16）]和漆酶（EC 1.10.3.2），以及蛋白质含量，分光光度法[Cecil Ce2501（Bioquest）]。使用酚红色测定Mn-氧化过氧化物酶和漆酶的活性（ε₆₁₀= 22000⁻¹厘米⁻¹2,2^′-叠氮双-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐（ABTS）（ε_436. = 29,300 M⁻¹厘米⁻¹)，分别作为底物。以每分钟转化1.0 μmol底物的酶量为1u。

总蛋白(mg mL⁻¹）在由Bradford试剂和样品组成的反应混合物中，通过从已知浓度的牛血清白蛋白获得的标准曲线（λ= 595nm）。11］．

所有测定均在全份数中进行，结果表示为平均值±标准误差。

电泳

Mini IEF电池型111（BIO-RAD）用于等电聚焦（IEF）并定义酶同种型的等电点（PI）。IEF在7.5％的聚丙烯酰胺凝胶中在pH梯度上以5.0％两种，使用3.0至10.0使用IEF标记（PI范围为3.6至9.3;西格玛-Aldrich）[6］．在4- cl -1-萘酚/H凝胶培养下观察MnP和MnIP同工酶₂O₂/含或不含MnSO的磷酸钾缓冲溶液₄，分别在室温下，直至出现深褐色条带。通过在ABTS/磷酸盐缓冲溶液中染色定位漆酶条带。凝胶聚焦后，用12.0%三氯乙酸固定，用0.1%考马斯亮蓝R (CBB R)在固定液(甲醇、乙酸、H₂O的比例是45:10:45)。

半纤维素、纤维素和木质素含量的测定

采用柯克法和Obst法测定了未经处理和真菌处理的麦秸中半纤维素、纤维素和木质素的含量[12和Van Soest等[13］．干燥(50°C)和精细研磨的样品用中性洗涤剂溶液(NDS)处理，煮沸和回流，以去除可溶性糖、蛋白质、果胶、脂类和维生素。酸性洗涤剂溶液(ADS)和72% H₂所以₄用该方法测定了木质素和半纤维素的含量。用NDS和ADS处理的样品的重量差异代表半纤维素含量。用Klason法测定了72% H的ADS处理后的木质素含量(LC)₂所以₄在30℃并在120℃下水解，并且表达为现有的真菌未致残的样品中的百分比。纤维素量呈现出ADS处理的样品和LC的质量差异。测定在四次复制中进行，结果表示为平均值±标准误差。

在小麦秸秆固态发酵过程中，所选真菌均能分泌锰氧化过氧化物酶和漆酶。获得的结果表明，在所研究的真菌物种/菌株之间的酶生产具有显著的种间和种内多样性(图。1)．

MnP活性峰值(1443.2 U L .⁻¹)在香菇HAI 858和稍低的值在侧耳属pulmonarius海573 (1294.2 u l⁻¹),p . ostreatus海592 (1243.7 u l⁻¹） 和p . eryngii海193（1096.0 U L.⁻¹)．MnIP活性水平略低，最大值也出现在L.编辑海858 (1045.5 u l .⁻¹)．通常，漆酶活性的水平显着高于Mn氧化过氧化物酶活性的水平，获得最大值p . eryngii海711 (7804.3 u l⁻¹） （图。1)．

总蛋白含量影响特定酶活性的分布。测定了小麦秸秆发酵过程中MnP和MnIP的最大比活性Trametes Hirsuta.海300（110.4 u mg⁻¹） 和L.编辑HAI 858 (48.7 U mg .⁻¹)，而比漆酶活性最高的是在p . ostreatusHAI 592 (44.5 U mg .⁻¹)．

MnP、MnIP和漆酶亚型的IEF谱随物种/菌株的不同而不同(图)。2)．在MNP的情况下，一个非常强（PI约4.6）和几种弱同种型被视为L.编辑海858和P柠檬酸杆菌海435，在p . ostreatusHAI 592两弯pI 5.9。种内多样性表现在p . eryngii，即在starin HAI 193中只发现pI在5.9左右的一个弱弯曲，而在菌株HAI 711中分离出pI在4.6到5.9之间的三个亚型(图5)。2a). 在所有受试物种/菌株中观察到一个介于3.6和5.9之间的pI MnIP弯曲，除了p . eryngii在HAI 711中出现了一些pI的亚型(图5.9)。2b)．漆酶酶谱已经证实，该酶是研究物种中主要的木质素分解酶，即分离出的强亚型最多(图)。2c)．三个漆壳弯曲，PI 3.6和PI中的两个大约4.6的弯曲，可视化P柠檬酸杆菌在HAI 435上观察到两个弯(pI分别为3.6和4.6)Ganoderma lucidumBeofb 435和p . eryngiiHAI 193和HAI 711酶谱，而其他研究物种和菌株仅以一种亚型产生该酶。

木质纤维素降解

所选的真菌物种显示出小麦秸秆脱野的可变能力，以及聚合物降解中不同的选择性水平（表2)．g .清明的BEOFB 435,P柠檬酸杆菌海435和L.编辑HAI 858为最佳脱脂剂(分别为58.5%、56.0%和55.7%)Lenzites Betulinus.beofb500降解率最低，仅为33.5%。g .清明的Beofb 435也是最有效的半纤维素降解剂（74.8％）和最具选择性降解剂，因为它仅腐烂了0.7％的纤维素。在小麦秸秆发酵中也可以获得显着的降解选择性p . eryngii海711，p . ostreatus海592，P. Pulmonarius.海573及l . betulinusBeofb 500，虽然有最低选择性Xylaria polymorphabeofb1110降解木质素、半纤维素和纤维素的比例分别为42.9%:54.9%:44.0%2)．

本研究的主要贡献是分析了大量研究不足的真菌的木质素降解潜力，重点研究了酶活性与聚合物降解程度之间的关系。以往的研究结果表明，栽培类型、植物材料组成(特别是与半纤维素和纤维素有关的木质素含量)以及栽培条件等重要因素决定了木质素水解酶的表达[14，15，16，17，18］．然而，真菌物种/菌株的遗传基础具有Ligninolytic酶合成中的重要作用。在研究木质素酶和木质素矿化率的情况下，存在显着和有内际的可变性的存在性，符合先前的结果。因此，Camarero等人。[19Stajić等[20]和ćilerdžić等。[21显示出MnP和漆酶活性的种间多样性革盖菌属hirsutus和C短柔毛，g .清明的和g . carnosum，在众多的pleurotus.种，以及在固态发酵过程中脱木素程度的麦秸与4pleurotus.物种(P. Pulmonarius.，P弗洛里达努斯，p . ostreatus和p . sajor-caju)．Silva等人。[11]，camarero等。[19， Stajić等[20， Manavalan等人[22]和ćilerdžić等。[23]还报告了漆渣和MNP活动中的拆卸多样性卓越程度Cerrena maxima，G。灵芝，很多pleurotus.物种．因此，Silva等人[11结果表明，四种不同发酵条件下，小麦麸皮深层发酵产生的漆酶活性差异较大g .清明的菌株，即活动从0.58 u范围内⁻¹至49,519 U L⁻¹．用四个麦秸淹没发酵后14天后g .清明的Ćilerdžić等人研究的菌株[23] LACCASS活动在153.5 U L的范围内⁻¹菌株BEOFB 432至5921.5 U L⁻¹在菌株BEOFB 434中。同样，在21岁的甘蔗甘蔗渣中产生的MNP活性g .清明的Manavalan等人研究的菌株[22与报告的价值相比，显着降低g .清明的BEOFB 435 (70 U g .⁻¹底物对~ 900u2g⁻¹基底）。普通话浸没后的木质素溶解酶活性的内部变异性g . applanatum和栓菌属多色的，以及葡萄牙锯末的固态发酵，具有许多菌株pleurotus.麦秸的种类和特性L.编辑和T. Versicolor.Stajić等人也证实了[20和Songulashvili等人[24］．许多结果也表现出MnP和LaCase活动的显着差异p . ostreatus菌株源自不同地区，并在各种植物原料上在水下或固态条件下栽培[1，25，26］．因此，在甘蔗Bagasse的淹没发酵中，Dong等人。[25]注意到甚至150,000岁的MNP活动⁻¹在Sergentani等人研究的相同条件下，在小麦麸皮上培养菌株时，不产生漆酶[1]合成高活性漆酶（4730 U L⁻¹）但不是MNP。另一方面，固态培养在基材上独立地诱导酶的分泌。即，在马铃薯皮切中发酵ergun和urek [26]获得MNP和LACCASE的显着活动（约1000升⁻¹和2000 U L⁻¹分别为1243.7 U L和1085.9 U L⁻¹， 分别）。但是，就Xylaria polymorphaLiers等人研究的应变之间的漆谱系活动的多样性。[27[菌株BeoFB 1110显着，即浸没后果实发酵后获得的值比固态小麦秸秆发酵高于5倍。

种/菌株的遗传基础以及栽培条件也影响木质素水解酶的亚型谱。与此相反，在培养过程中只产生两种漆酶亚型g .清明的在麦芽介质[28[韩国菌株中的三个同工酶在液体葡萄糖/蛋白胨/酵母提取物中培养[29， Manavalan等人[22]在固体甘蔗蛋白底座上栽培的含量甚至五种同种型。但是，Stajić等人。[10]和ćilerdžić等。[23表明基因对同工酶谱有较高的影响。也就是说,两个g .清明的不同来源的菌株HAI 447和BEOFB 431，在相同条件下，在固态小麦秸秆/ nh3培养基中分别合成了4个和3个异构体₄不_3.媒介。在MnP的情况下，Manavalan等人研究的菌株[22]在甘蔗甘蔗渣上产生pI 4.19的一个亚型，菌株BEOFB 431在麦秸深层发酵后合成了pI 3.6和3.7的两个亚型[6]而在该原料经菌株BEOFB 435固态发酵21天后，可观察到任何亚型no。同功酶谱的种间和种内多样性也在属内得到证实pleurotus.．即，muñoz等。[30，31]报道了两个漆箱乐队p . eryngii在葡萄糖/酒石酸铵培养基中培养，用菌株HAI 616对柑橘皮进行深层发酵，分离出两种亚型[32而该研究的菌株(HAI 193和HAI 711)在固体小麦秸秆基培养基上生长时分别产生3和2个同工酶。在…的情况下p . ostreatus，与四个漆酶同种型（Poxa1b，poxa1w，poxa2和poxc）相反，由Guardina等人分开。[33]和palmieri等。[34]，分别用菌株HAI 493和HAI 494在葡萄藤木屑上培养后进行sinthase处理[32]，虽然在具有菌株Hai 592的固态小麦秸秆发酵后，任何同种型都会看到。

大量的报道也显示了物种和菌株在脱木质素能力和聚合物降解选择性方面的相当大的差异[6，25，35］．在本研究中研究的物种比以前先前测试的差异更好。因此，g .清明的beofb435比beogb432多降解约38%的木质素，比beogb432多降解约35%的木质素g . applanatum，虽然内部差异较高p . eryngii即菌株HAI 193和HAI 711的脱木素效果是菌株HAI 507的两倍以上[6，35］．在…的情况下p . ostreatus，在固态培养下，菌株Hai 592更具选择性降解小麦秸秆，而不是Dong等人研究的菌株。[25对蔗渣(木质素40.3%，半纤维素35.8%，纤维素0.8%，纤维素50%:35%:5%)进行了深度发酵。

在麦秆发酵过程中，香菇HAI 858产生最活跃的锰氧化过氧化物酶和过氧化物酶侧耳属eryngiiHai 711最活跃的漆酶，通过获得的ZyMograms确认。可视化酶的同种型也表明漆酶是研究中的占状木质素溶解的酶。Ganoderma lucidumBeofb 435和侧耳属pulmonariusHai 573是最具选择性的木质纤维素降解剂。所研究的白腐真菌物种具有高容量，可选择性地降解木质纤维素，而且由于这种能力可能是食品，饲料，纸和生物燃料中植物生物成像的生物转化过程中的重要参与者。

不适用。

资金

这项研究是在塞尔维亚共和国教育、科学和技术发展部资助的第173032号项目下进行的。出版费用由同一部供资。

数据和材料的可用性

不适用

关于这个补充

本文已作为BMC植物生物学第17卷补充2,2017：2017年Belyaev会议的选定文章：植物生物学。补充的完整内容可在线提供//www.cinefiend.com/articles/supplements/volume-17- supplement-2.．

隶属关系

1. 贝尔格莱德大学，生物学，Takovska 43，Belgrade，11000，塞尔维亚

   Jasmina Ćilerdžić， Milica Galić， Jelena Vukojević， Ilija Brčeski和Mirjana Stajić

贡献

概念化：MS，JĆ。正式分析和调查：MG，IB。项目管理，监督：JV。写作-原稿准备：写作-审核和编辑：MS，JĆ。所有作者都阅读并批准了最终手稿。

通讯作者

对应于米里亚Stajić．

伦理批准和同意参与

不适用

同意出版

不适用

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

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