分类的评估葱属植物基于ITS和matK标记

背景

作为推断哈萨克斯坦本土植物区系遗传变异的全国性项目的一部分，一项研究试图评估特有和稀有植物的系统发育关系葱属植物物种。总的来说,20葱属植物2015-2016年，在哈萨克斯坦5个不同地区的实地考察中收集到。大部分种类(9种)在该国南部沿卡拉托山脉采集，其次是哈萨克斯坦东部的阿尔泰山脉(5种)。它和垫利用K DNA序列分析了不同物种间的分类关系。研究的主要目的是评估5种特有种和稀有种的分类地位葱属植物亚属Reticulatobulbosa收集于哈萨克斯坦南部的卡拉托山脉。

结果

收集到的20葱属植物利用形态学特征和DNA条形码方法对物种进行了评估。亚属四个不同种的形态分析Reticulatobulbosa推断的相似性答:inconspicuum和答:barszchewskii(从部分Companulata)答:oreoscordum和答:oreoprasoides(部分Nigrimontana)由几个性状决定，包括鳞茎和叶的形态、苞片的存在、花被裂片和花柱的形状。采用Neighbor-Joining方法生成ITS和垫K两组种群的系统发育树：1）20葱属植物项目内收集的物种，以及2）50葱属植物在世界范围内的物种。

结论

ITS和ITS的核苷酸序列分析垫K有力地证实了其单系起源葱属植物物种。变异性在20个局部葱属植物ITS的物种数量比其高6.6个垫K，因此ITS树的拓扑得到更好的解析。的分类葱属植物该种在很大程度上与该属最近的分类一致。ITS和ITS的分析垫K建议答:oreoscordum在基因上很接近答:oreoprasoides节Nigrimontana亚属的Reticulatobulbosa．通过对4种亚属植物个体的形态描述也证实了这一结果Reticulatobulbosa．该研究是对我国生物分类学澄清的又一贡献葱属植物．

葱属植物是北半球分布最广的属之一，有超过850种[1］．的分类葱属植物在许多经典的植物学评论中都有很好的描述[2，3.]分子遗传学研究[1，4］．基于DNA标记的几篇最初的出版物表明，研究的亚属有多系起源[5，6，7］．然而，Friesen和他的合著者[8]对这一结论提出了批评，并指出在分析的亚属中遗漏了物种，并对这些出版物的研究材料质量提出了质疑。在同一份报告中，Friesen等人[8提出了一种新的分类葱属植物基于使用rDNA ITS(内部转录间隔)序列。研究表明葱属植物属单系起源，由3个进化系组成，15个亚属，72个节。这种分类在后来的几项研究中得到了支持[9，10，11，12，并受到了人们的欢迎葱属植物分类学家。尽管这些实质性的努力，以理解的进化过程和分类的属仍然有许多贫乏的描述葱属植物在世界各地均可找到的分类系统，而对野生洋葱种类的积极描述是一个持续的过程[1，13，14］．

包括哈萨克斯坦在内的中亚地区是研究海洋生物演化和分布的重要地区之一葱属植物物种。哈萨克斯坦是中亚最大的共和国，总面积为270万公里²美国是世界上面积第九大的国家。这个国家被陆地包围，有相当独特的植物群，由大约6000种物种组成，其中大约10%是该地区特有的。尽管当地植物区系丰富而独特，植物学研究数量巨大，但利用现代DNA研究对植物群落的特征仍然很差。在文献中只有少数例子建议对我国野生植物物种进行分类评价，包括在年度[15]和多年生植物[16，17］．由于一项新的全国性研究计划的启动，这一趋势正在慢慢改变[18]它结合了来自生物技术研究机构、植物园、国家自然公园和保护区的当地植物学家和遗传学家的努力。这一趋势的一个例子是关于重新评估植物分类的合作研究葱属植物生长在这个地区的物种。据Abdulina说[19]有120个葱属植物生长在该国不同地区的物种。该地区的热点之一葱属植物在哈萨克斯坦的多样性是卡拉托国家自然保护区位于哈萨克斯坦的南部。因此，特有种、珍稀、经济上重要的种葱属植物卡拉托地区是本研究的一个特殊目标，主要关注subg的物种。Reticulatobulbosa．

目前的DNA条形码工具[20.已被认为是植物系统发育评价中信息量最大、效率最高的方法之一，并成功地应用于植物的分子分类学中葱属植物［5］．该方法基于核和质体基因组通用DNA标记短序列的比对[21，22，23]，并应用于本研究。研究的范围是评估地方性和稀有植物的生长分布区域葱属植物利用DNA条形码技术对哈萨克斯坦本土物种的系统发育关系进行了研究。特别介绍了亚群种的植物学和分子系统发育分析结果。Reticulatobulbosa原产于哈萨克斯坦南部的卡拉托自然保护区。

收集葱属植物哈萨克斯坦不同地区的物种

2015-2016年期间，在该国五个地区开展了几次收集工作，目的是收集流行和罕见病例葱属植物物种。收集行程总结见表1收集区域如图所示。1. 采样区域从该国东部的阿尔泰山脉延伸至西部的乌斯泰尔高原。最高数量的葱属植物在哈萨克斯坦南部(9)，包括卡拉托国家自然保护区山区。取样地区的地理分布从平坦地区到山区不等，范围从哈萨克斯坦西部海平面以上96米(答:caspium)至哈萨克斯坦南部2669米(答:caricoides额外的文件1)，尽管在该项目中只收集了该国部分可用的野生洋葱品种。

发表评价葱属植物相关文献表明，该物种已分节Nigrimontana和Campanulata在subgen。Reticulatobulbosa原产于哈萨克斯坦南部的卡拉托山脉，此前人们对它的研究很少。特别是,答:oreoscordum以前没有被分类到任何现有的部分ReticulatobulbosaFriesen等人没有提到[8］．表中三个物种的描述1表明它们有相似之处答:oreoscordum在许多性状中，包括花序梗长度和萨米纳细丝。同时，佛焰苞的大小和花被裂片的颜色也发生了分化答:oreoscordum来自其他三个物种。鳞茎和叶的形态、苞片的存在、花被裂片的形状和花柱的形状等性状也相似答:oreoscordum和A.oreoprasoides(教派。Nigrimontana)，并将其与组中的两个种进行了区分。Companulata，答:inconspicuum和答:barszcewskii(表1)．

系统发育的研究葱属植物物种

本研究生成了四组不同的数据集。前两个数据集分别与NCBI数据库收集的本地物种ITS序列和全球物种序列相关。接下来两个数据集是相关的垫对NCBI数据库的K序列进行了分析。ITS长度从616 bp (答:eriocoleum)至638 bp (答:fistulosum，答:altaicum额外的文件2)，采用MEGA 5.0引入间隙调整对齐。这导致总比对长度为671 bp。多态核苷酸数为415个，占总核苷酸数的61.8%(附加文件)2)．的长度垫K值较保守，在779 bp左右答:铯和答:sabulosum至788 bp的所有剩余物种(附加档案3.). 中多态性位点的数量垫K值为73，占总核苷酸数的9.3%(附加文件3.)．因此，在本研究中ITS的变异性比垫K。

局部遗传分析葱属植物物种使用ITS(数据集1)

在附加文件中列出了从哈萨克斯坦采集的20个物种1使用ITS序列分析。用四个外类群物种构建的邻接系统发育树将20个物种分为两个不同的分支。图形2提供这些关系葱属植物物种。

第一个分支包括亚属的种Anguinum、Porphyroprason Vvedenskaya,Melanocronium,它们是第二进化线的一部分。第二支进化枝包括属于第三支进化线的物种。亚属的物种Cepa形成一个姐妹子类，其他子类由答:caricoides的亚属的种Reticulatobulbosa。亚属的种Reticulatobulbosa在第二支中形成了一个单独的群体，而答:oreoprasoides最接近的分类单元是答:oreoscordum．

全球范围内发生的s组遗传分析葱属植物物种使用ITS数据集(数据集2)

数据集2包含50个ITS序列葱属植物物种，包括20个本地物种和30个全球分布物种，可在NCBI数据库中找到。(无花果。3.)．

所生成的系统发育树与第一个数据集的结果一致，支持单系理论葱属植物来源。在这项研究中，系统发育树中唯一错位的物种是答:chrysocephalum(subg。息肉病,教派。Daghestanica)，与subg中的种归为一类。鳗鲡属．该树的拓扑结构表明，物种在亚群中。Reticulatobulbosa源自亚属的种息肉病(无花果。3.)，形成亚枝，亚枝是subg中种的姐妹亚枝。Cepa．在Reticulatobulbosa，与数据集1的分析结果类似，答:inconspicuum和答:barszchewskii组成了一个姐妹团，然后答:oreoprasoides和答:oreoscordum形成了第二个。引导支持率为91%。

局部遗传分析葱属植物物种的使用垫K数据集（数据集3）

数据集3的研究是基于对20个本地数据集序列的分析葱属植物质体基因组标记种matK(无花果。4)．

Neighbor-Joining树状图生成了三个不同的分支，其中第一个分支包含亚属的物种Melanocronium Vvedenskaya,和Porphyroprason; 亚属中种的第二分支葱属植物和息肉病；第三支系包括亚属的种Cepa和Reticulatobulbosa．在树的拓扑结构中答:microdictyon和答:高寒草场显示出第一和第二进化线群之间的中间位置，尽管前一种更接近第一进化线，后一种更接近第二进化线。在ITS树中，结果在内部Reticulatobulbosa表明两者之间有密切的遗传关系答:oreoprasoides和答:oreoscordum。

遗传分析在世界范围内发生葱属植物物种的使用垫K数据集（数据集4）

在ITS研究中，生成的垫系统发育树支持单系理论葱属植物来源。然而，不同于数据集2的研究，50份资料的分析使用matK还没有确定的拓扑葱属植物基于三个生成的分支的组（图。5)，包括属于三个进化系的物种。

第一个区别是种在亚属上Melanocronium Vvedenskaya,和Porphyroprason(第二种进化线)被归为亚属阿米拉林和微芯(第一次进化线)。系统发生树的第二个差异是种在亚属上的分组。Butomissa(第三条进化路线)与物种在一起鳗鲡属(第二条进化线)在同一进化枝中的。然而,答:oreoprasoides和答:oreoscordum在亚属Reticulatobulbosa再次与88%的引导支持一起定位（图。5)．

虽然垫K葱属植物两种不同基因组的系统发育树证实了早期发现的单系起源葱属植物属(8，14］．我们的数据表明，收集的20个地方葱属植物物种属于Friesen等人假设的第二和第三进化系的亚属[8]. 数据集1和数据集3的结果之间的显著差异在于，与ITS不同的是垫K分析表明，该种属于亚属。Cepa比亚种进化得早。Reticulatobulbosa，这两个亚属有一个共同的祖先节(图。4)．从数据集2和数据集4的系统发育树中也可以看到类似的结果，其中包括从NCBI数据库中添加的更多的类群。数据集4的分析基于垫K序列(图。5)表明物种在Reticulatobulbosa从亚属的物种进化而来。Cepa. 这一结果与最近的分类不一致[8的葱属植物，而最可能的原因是垫K.因此，可以从全球物种研究的系统发育树ITS拓扑中观察到最重要的输出(数据集2)。8), subclades息肉病，Reticulatobulbosa和Cepa形成了三个姐妹亚枝，本研究只检测到两个亚枝。第一个亚枝是亚属的种Cepa而第二种则是由息肉病和Reticulatobulbosa．在世界范围的ITS系统发育树中，物种的另一个错位是一组答:chrysocephalum(亚属息肉病，第Daghestanica)以及亚属的种Anguinum,由于数据库中的序列不准确，可能会发生这种情况。

本研究中有5种亚属特有种和稀有种Reticulatobulbosa代表部分网状布尔博萨，和Nigrimontana进行了分析。所有5个物种均采自哈萨克斯坦南部卡拉托山脉(哈萨克斯坦语翻译为黑山)。部分的名称Nigrimontana与这些山脉的名字相吻合，而且很可能与这个地方有关，反映了当地植物的丰富和独特性，包括拥有许多疯狂生长的洋葱物种[24］．ITS和matK表明在亚属内可以分离出三个亚群。第一组的代表是答:eriocoleum(部分Reticulatobulbosa)的位置大多远离其余四种(Figs。2，3.，5)．在所有四个数据集中答:oreoprasoides(部分Nigrimontana)及答:oreoscordum形成第二亚组，而答:inconspicuum和答:barszchewskii(两个物种从剖面Companulata)形成了第三个亚群。基于这些发现答:oreoscordum用高概率可以定位在剖面上Nigrimontana. 切片中物种的形态描述Nigrimontana和Companulata(表1)可以作为对这一假设的补充确认。

本研究是基于DNA条形码方法对哈萨克斯坦特有和稀有物种进行全面描述的大规模项目的初步尝试。在对20个当地葱属植物ITS变异水平比ITS高6.6matK．另一个重要的结果是对特有和稀有植物的分类地位的评估葱属植物生长在哈萨克斯坦的物种研究证实了单系起源葱属植物在一些已发表的报告中确定的属[8，13，14］．此外，还对比较进行了详细的研究Reticulatobulbosa主要关注生长在卡拉托国家自然保护区的物种的形态和分子遗传描述。

尽管在系统发育分类学上已有基础研究葱属植物属，由Friesen和合著者[8]，仍有许多描述不清葱属植物在世界不同地区可用的类群。在本研究中，为了评估20种地方性的、罕见的和经济上重要的系统发育葱属植物两个DNA条形码标记ITS和matK被应用。结果表明，20株植物ITS序列变异明显葱属植物物种比物种高6.6倍matK．ITS序列生成的系统发育树与现有的新系统发育分类(Friesen et al.， 2006)一致，确认了该属的单系起源。它和matK分析表明，区域性地方病答:oreoscordum用高概率可以定位在剖面上Nigrimontana亚属的Reticulatobulbosa．这一结果也被4个不同品种的形态性状的评价所证实葱属植物亚属的种Reticulatobulbosa。该研究是对我国生物分类学澄清的又一贡献葱属植物．

植物材料

2015年和2016年在全国五个不同的地区组织了收集旅行(图)。1)，并对20种罕见的、具有重要经济意义的地方病进行了采样葱属植物物种。

收集地点的位置和地理特征见表(附加文件)1)．代金券标本保存在哈萨克斯坦植物生物学和生物技术研究所植物标本室。在每个采集地点，每种植物有5 - 10株1)．海拔从96米到2669米不等。将生长距离较远的植物叶片样品收集在含有硅胶的塑料袋中，用于DNA提取。

DNA提取、扩增和测序。

根据delaporta DNA提取方案，从干叶或新鲜叶中提取总基因组DNA [25］．从叶绿体基因组的成熟酶K基因(matK)和核糖体复合物，包括内部转录间隔体1和2，以及5.8S rRNA。

所有PCR反应均在Veriti热循环仪(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中进行，总容量为16 μl。ITS的核苷酸序列[26),matK［20.引物及扩增子大小见表2．

在80 V电压下，用1.5%琼脂糖凝胶电泳40分钟，检测每个PCR产物的全部体积matK和ITS的可视化，从凝胶中切割，并根据公司提供的协议使用ULTRAPrep®琼脂糖凝胶提取迷你准备试剂盒(AHN Biotechnologie GmbH, Nordhausen, Germany)进行纯化。分别用纯化的DNA扩增子与正向引物和反向引物进行序列反应。根据公司协议，所有反应均使用BigDye终止循环测序技术(应用生物系统公司，福斯特市，CA, USA)进行。

比对和系统发育分析

局部生成序列葱属植物样本以mega5软件输入[27]，并使用ClustalW程序进行对齐[28］．此外，ITS和matK本地物种的序列与葱属植物来自NCBI参考数据库的物种[29］．最大复合似然模型用于构建系统发育树[30.，加入邻居统计方法[31]，并使用1000复制引导测试。

作者想要感谢哈萨克斯坦共和国教育和科学部对国家项目N0237的资助，以及卡拉托国家自然保护区官员对组织收集旅行的支持。

资金

这篇文章的发表是由哈萨克斯坦共和国教育和科学部提供的国家计划N0237预算中的具体拨款资助的。资助方没有参与研究设计、数据收集和分析、决定发表或手稿的编写。

数据和材料的可用性

支持本文结论的数据集包含在本文中。代金券标本保存在植物生物学和生物技术研究所(哈萨克斯坦)的植物标本室。

关于这个补充

本文已作为BMC Plant Biology Volume 17 Supplement 2, 2017: Selected articles from Belyaev Conference 2017: Plant Biology的一部分发表。该补充的全部内容可在网上找到//www.cinefiend.com/articles/supplements/volume-17-supplement-2．

从属关系

1. 哈萨克斯坦阿拉木图植物生物学和生物技术研究所

   Saule Abugalieva, Lyubov Volkova, Yuliya Genievskaya和Yerlan Turuspekov

2. 阿拉木图国家自然公园，哈萨克斯坦

   安娜Ivaschenko

3. 阿尔泰植物园，里德尔，哈萨克斯坦

   尤里Kotukhov

4. 卡拉托国家自然保护区，肯托，哈萨克斯坦

   古尔扎汗·萨考娃

贡献

SA和YT进行了实验设计。AI, YK和GS已收集葱属植物种，进行形态学描述和开发植物标本室标本。LV进行了DNA提取、DNA测序和序列比对。SA, YT, YG参与了手稿的编写。所有作者都审阅了手稿的初稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

通信Yerlan Turuspekov．

伦理批准和同意参与

本研究不包含任何需要伦理同意或批准的研究。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

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