NBS-LRR编码基因在两种转录组中的差异表达Solanum Phureja.基因型具有对比的抗性Globodera rostochiensis

背景

马铃薯主要抗病基因(R基因)的鉴定是马铃薯分子育种的重要课题。然而，R基因进化迅速，在基因组中经常以复杂结构的簇状出现，精确的定位和鉴定非常复杂和耗时。

结果

根转录组比较分析Solanum Phureja.基因型具有对比的抗性Globodera rostochiensis发现了一些表达差异的基因。然而，由于缺乏注释，无法将候选R基因进行进一步的分离分析。然而，将转录组学分析与马铃薯nbs - lrr编码基因预测数据相结合，显著提高了结果的质量，并提供了合理数量的候选基因S. Phureja.对马铃薯金囊线虫具有较强的抗性。

结论

结合抗病和易感基因型组织特异性转录组的比较分析，可作为快速鉴定候选马铃薯R基因的方法，用于共分离分析，并可与基于基因组重测序的更复杂的研究并行使用。

新的抗病基因（R基因）通常通过内部和/或间隙渗出杂交引入作物植物中。栽培和密切相关的野生物种都已经为此目的使用了很长时间。有效地利用标记辅助选择以促进成功培育新的抗性品种，并将几个R基因与单一基因型合并成[1，2］．抗性位点的定位通常通过表型分型、群体分离和大量遗传标记进行基因分型。一些R基因已经克隆并进行了表征。结果表明，核苷结合位点富亮氨酸重复序列(NBS-LRR)基因构成了最大的植物抗病基因家族，占植物抗病基因总数的70%〜超过140个克隆R基因中的80% [3.］．然而，寻找抗病品种或抗病小种的R基因变异仍是一项复杂而耗时的工作。在许多情况下，相关的R基因仍未被识别，遗传标记(如果可用)与包含多个(或多个)候选基因的质量性状位点(qtl)相关。

最近，在基因组数据的基础上发展了这一领域的新方法(一些最近发表的例子如下)。全基因组重测序和与参考基因组的比较发现，普通野生稻中存在大量NBS-LRR候选基因[4]，Medicago truncatula［5]，落花生duranensis和A. hypogaea.［6］．发现含NBS-LR基因的相关物种的同步基因组区域的比较是在各种作物的基因组中定位候选抗性基因的有希望的方法（例如，[7，8])。有时抗性品种的R基因在参考基因组中未发现;例如，西班牙大麦地方品种7H染色体长臂的数量性状位点具有抗白粉病的能力，并包含了参考大麦基因组中缺失的NBS-LRR基因簇[9］．许多R基因类似物(RGAs)具有保守结构域，可能被生物信息学工具预测[10.]有助于他们的身份证明。

基因组和转录组合方法的组合提供了识别候选R基因以进行进一步验证的有效方法。例如，搜索灰肝基因组中近九个QTL的ascochyta枯燥基因显示出约30nbs-lrr候选基因。其转录模式的进一步比较抗性和易感基因型的转录模式显示出具有基因型特异性表达的五个候选基因[11.］．与叶片锈蚀抗柳抗肺抗血管抗肺菌的研究显示了候选TIR-NBS-LRR基因，其在接种之前和之后的易感基因型中的组成型表达相当低得多Melampsora larici-epitea［12.］．比较转录组分析陆地棉抗性和敏感的肾状线虫的基因型揭示了一些临近定量特质基因座的候选RGA [13.］．抗性重组自交系的rna序列分析落花生hypogaea在与线虫接种后的不同时间点Meloidogyne arenaria揭示了发病机制和植物防御的分子机制以及组成型表达的TIR-NBS-LRR基因，其可能激活效应诱导的免疫反应[14.］．

对抗性植物基因型的基因组和转录组进行分析，通常会得到一系列候选R基因，这些候选R基因应通过共分离分析或其他反向遗传工具进行进一步检测。人们开发了各种实验方法来识别负责识别特定病原体的候选NBS-LRR基因(effectoromics，定义为一种高通量、功能基因组学方法，使用效应剂探测植物种质资源来检测R基因[15.]），DsRNA介导的抗性工厂中候选基因的抑制[16.， NBS-LRR基因在易感植物中的过表达[17.，18.]， 等等。）。但是，通过自然变异性，对NBS-LRR基因的搜索受到阻碍;通常，栽培植物的基因组含有具有数十个重复和重组RGA的簇，具有高度相似的结构[19.，20.］．

快速靶基因鉴定的潜在方法之一可以是对NBS-LRR相关转录物的生物信息预测的抗性和敏感植物基因型的比较转录组分析的组合（预测可以基于其保守的NBS结构域（例如，[21.，22.)或其他计算技术[23.])。我们应用这种方法来评估NBS-LRR基因在两个根转录组模型上的差异表达数量Solanum Phureja.从VIR收集的不同来源的资料。这些材料可能具有不同的进化R基因集，而且早前就发现这些基因型至少在对马铃薯疣体的抗性方面是不同的同步血症胚胎［24.和金马铃薯包囊线虫Globodera rostochiensis(Wollenweber) Behrens (GPCN) [25.］．抗性基因型含有未知的GPCN强抗性基因的遗传标记物Gro1-4和H1.［25.并且可能携带新的R基因变异。我们假设使用组织特异性转录组预测nbs - lrr相关转录本可以快速识别候选R基因，以进行进一步的实验验证。

土豆囊肿线虫起源于南美安第斯坦地区[26.］．目前，GPCN在世界范围内都有发现，是经济上最重要的马铃薯病原体之一[27.］．现在，G. Rostochiensis.发生在俄罗斯的欧洲部分、西伯利亚南部和俄罗斯远东的局部地区[25.，28.］．根据马铃薯品种的不同，产量损失从19%到90%不等[29.]，而GPCN卵子可在囊肿内休眠和存活30年[30.］．大多数化学境内毒剂不高效[31.，32.在欧洲是被禁止的，而对GPCN的控制主要是基于单抗基因(r -基因)的部署。然而，只有少数R基因是可用的，它们的效力受到线虫进化能力的威胁。对Ro1型具有强抗性的R基因G. Rostochiensis.从Andean马铃薯种类中累赘的商业土豆品种：H1.来自栽培物种的基因Solanum tuberosum subsp。安涅涅姆［33.)和Gro1-4来自玻利维亚野生物种的基因美国spegazzinii［34.，35.］．自从此以来S. Phureja.本研究中使用的基因型不包含H1.和Gro1-4基因(25.，抗性基因型可能包含一个新的R基因变异。本研究的目的之一是编译一套新的抗GPCN的候选R基因，以进一步研究和包含在马铃薯育种计划或其他生物技术方法中，以提高植物对病原菌的抗性(例如，[18.，36.，37.，38.，39.])。

植物材料

两种二倍体栽培种的加入S. Phureja.k-11,291(秘鲁采集)和k-9836(玻利维亚采集)是从VIR马铃薯收藏中选择的。每个登录由一个克隆(基因型)代表，分别为VIR引入编号i-0144787 (k-11,291)和i-0144786 (k-9836)。这些材料具有核SSRs、染色体计数和形态特征[40］．根据Plastid SSRS数据，这些摘录具有不等的单倍型，表明不同的母体起源[41.］．以前发现这些基因型在其对GPCN的抵抗力中不同（致病型RO1）：I-0144786易感，而I-0144787是高度抗性但不含DNA标记Gro1-4和H1.(TG689, 239E4 left/Alu I, and Gro1-4) [25.］．美国tuberosum以对GPCN敏感和抗性的品种‘Nevsky’和‘Red Scarlett’为对照。

评价S. Phureja.抵抗GPCN.

人口G. Rostochiensis.(Ro1型)来自俄罗斯列宁格勒地区(别洛戈尔卡)一块受感染的土地，以前为特征[25.]，以适当的分子标记[42.］．在温室条件下，在感病品种“Nevsky”上繁殖线虫种群。用浮选法从土壤中提取包囊，在4℃下保存4个月。

为了促进根的形成，在2周内将马铃薯块茎置于无菌浇水的沙盘上，每个块茎进一步转移到10厘米直径的塑料罐中(500 ml)，其中一半填满无菌土壤，用于GPCN接种。在接种前，为了估算线虫的种群密度，对包囊进行粉碎，并计算线虫卵和幼虫的含量。用1 ml水悬浮液喷撒约1500个卵和幼苗在一个马铃薯块根上接种GPCN。接种后用无菌土壤覆盖，在4000lx光照16 h, 22℃下培养[25.］．用酸紫红色染色的受感染的根用于在公务镜A1光学显微镜（Carl Zeiss，Germany）下的线虫存在。

为了评价植物对GPCN的抗性，接种后3个月用浮选法从根中提取包囊并粉碎，并计算幼虫和卵的数量。然后，采用以下标准评分系统(OEPP/EPPO, 2006)记录GPCN耐药程度:9-7分，高度耐药;6-4分，中等抗性;比分3-1，易感。

RNA提取

对于RNA-SEQ，接种后72小时收集根。对于每种基因型，使用了三种感染和三种对照（接种的水溶液）植物。将这些植物的根用无菌蒸馏水彻底冲洗，固定在液氮中并用于RNA提取。用RNEasy植物迷你试剂盒（QIAGEN）提取总RNA。

RNA-SEQ分析

使用生物分析仪2100(安捷伦)评估RNA样本的质量。在使用Dynabeads mRNA纯化试剂盒(Ambion)提取poly-A mRNA之前，将ERCC Spike-In Mix2添加到每个RNA样本中。RNA-seq文库的制备使用Ion Total RNA-seq Kit v2 (Life Technologies)，按照制造商的说明进行修改。化学5分钟长的RNA片段被使用而不是酶法处理，以增加长片段的重现性和比例。使用Caliper LabChip XT (perkins - elmer)进行尺寸选择，获得250-300 bp长的文库插入。用One-Touch 2和One-Touch ES系统(Life Technologies)进行离子激流测序的E-PCR、富集和定量。使用Hi-Q View测序试剂盒和318v2芯片在Ion PGM (Life Technologies)上进行测序。ERCC分析显示没有显著的误述(r平方值，0.93-0.97)。

中存在

对于QPCR，用DNase（无QIAGENRNASE的DNA酶组）处理RNA。RNA的0.7微克等分试样用于通过逆转录基于一个的RevertAid™试剂盒（赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，MA，USA）和（DT）中以制备单链cDNA_15.底漆。

引物采用IDT PrimerQuest软件设计(http://eu.idtdna.com/PrimerQuest/Home/)十度。

β-微管蛋白基因序列(登录号:609,267)作为参考。利用OLIGO软件设计引物序列如下:Forward, 5 ' -AGCTTCTGGTGGACGTTATG-3 '， Reverse, 5 ' -ACCAAGTTATCAGGACGGAAGA-3 '。随后的qRT-PCR基于SYNTOL SYBR Green I试剂盒(SYNTOL, Moscow, Russia)。每个反应进行了三个技术重复。

RNA-seq数据的生物信息学分析

图书馆预处理

Prinseq工具[43.用于评估序列质量并过滤库。使用大于50nt的核苷酸序列，并且具有大于20的平均PHRED质量分数用于进一步分析。

库映射

我们使用了美国tuberosum集团Phureja.克隆DM1-3516 R44 (genome version 3.0.34, European Nucleotide Archive ID GCA_000226075.1) [44.]作为参考。从Ensembl植物数据库下载核苷酸序列及其注释[45.］．此外，755个预测的NB-LRR位点的位置[46.通过借助于GMAP工具对齐它们的序列来映射在参考基因组上[47.]（潜在的R基因的位置列于额外文件中1）.

为了绘制基因组中过滤过的文库，TopHat2 [48.利用Bowtie2软件构建基因组指数后实现[49.］．使用Cufflinks管道处理读取对齐[50.］．映射到每个基因组段的读数数，无论是在基因组组合物（'转录物'）中的表达或注释），以及相应的rpkm（每百万映射读数读取每千碱基读取）值[51.的差异表达基因(DEGs)检测S. Phureja.登记入册。

度的预测

差异表达分析S. Phureja.基因是使用Cufflinks管道的Cuffdiff效用进行的。总RPKM值小于12的转录本被丢弃。如果转录本在丰度上有两倍或更高的差异(|logFC| > 1，显著性水平q < 0.05)，则认为在两个文库中有差异表达。对于功能分析，上调转录本和下调转录本分别进行分析。

关于特征肽（肽ID）的数据是从Spud数据库中的注释中的（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/data/PGSC_DM_v3.4_g2t2c2p2func_nonredundant.txt.zip）[52.提供了基因与相应转录本、CDS和多肽之间的联系。显著上调和下调基因的肽id列表用AgriGO数据库处理[53.对这些基因的丰富的本体论术语进行评价。

验证阻力水平S. Phureja.加入I-01444786和I-01444787到GPCN

的根S. Phureja.登记入册i - 0144787, i - 0144786,美国tuberosum对敏感品种‘Nevsky’(10个块茎)和抗性品种‘Red Scarlett’(10个块茎)接种GPCN，并在多个时间点进行分析。两者的根的渗透S. Phureja.从接种后3 h开始检测GPCN幼鱼的基因型(图)。1）.经培养3个月后，在两种植物的根上均发现GPCN形成大量的包囊S. Phureja.i-0144786和敏感控制' Nevsky '(图。2)而不是在根源上S. Phureja.I-0144787或耐腐蚀美国tuberosum品种“红思嘉”(Table1）.根据国际9分数规模[44.]，S. Phureja.“i-0144786”和“Nevsky”分别为2分和1分，而“i-0144786”和“Nevsky”则分别为2分和1分S. Phureja.i-0144787和品种‘Red Scarlett’均表现出抗性(得分分别为7分和9分)1）.这些数据证实了之前报道的结果(i-0144786，得分2;I-0144787，分数7-9 [25.])。

对于转录组分析，根的样本S. Phureja.分别用线虫和水接种72 h后获得两份材料i-0144786和i-0144787。i-0144786/water (Sus_cont)、i-0144787/water (Res_cont)、i-0144786/GPCN (Sus_nem)和i-0144787/GPCN (Res_nem)共获得12个样品(3个技术重复)。

图书馆预处理

作为原始测序数据，产生了12个聚合reads库，共包含48059222个短reads，包含7.44 gb。去除1.5%的短读后，过滤产生47310018个短读，包含7.31 gb序列(表2）.

抗病与感病根的差异基因表达S. Phureja.基因型

分析S. Phureja.在Cufflinks流水线的帮助下，转录组数据显示了45171个基因组片段，分别对应于参比基因组装配中的注释基因和未注释基因组片段美国tuberosum［45.］．计算RPKM值，并计算中DEGs的数量S. Phureja.附录中列入了I-0144786和I-0144787和I-01447873.详细描述可在附加文件2）.

为了验证RNA-SEQ结果，10次更丰富的成绩单S. Phureja.-抗性基因型转录组。日志₂（FC）RNA-SEQ数据预测的值和实验日志₂（FC）验证基因的值以及引物和其他技术信息的序列如额外文件所示3.．优先使用nbs - lrr编码基因进行验证。这个列表包括S. Phureja.DEGS类似于从参照基因组的以下基因：晚疫病抗性蛋白的Rpi-BLB2（PGSC0003DMG400004561），TMV抗性蛋白N（PGSC0003DMG400020722），Tospovirus抗性蛋白C（PGSC0003DMG402016602）的Rpi蛋白（PGSC0003DMG400023288），晚疫病耐药蛋白（PGSC0003DMG400005970），CC-NBS-LRR抗性蛋白（PGSC0003DMG400026666），抗病抗性蛋白R3A（PGSC0003DMG4027402），抗病蛋白（PGSC0003DMG400018464），NBS-LRR抗性蛋白（PGSC0003DMG400013308）和HJTR2GH1蛋白（PGSC0003DMG400011517）。QPCR的结果支持RNA-SEQ数据。在所有情况下，靶分比率在抗性基因型的转录om中更丰富，并且在8例中，差异大于双重和统计学意义（附加文件4）.

由于与注释的参考马铃薯基因组的比对揭示了这些差异基因，我们对gpcn抗性基因型中上调和下调的基因进行了基因本体论术语搜索。对于下调基因，富集的氧化石墨烯术语包括“翻译”(p= 0.0011)， '核小体组装' (p = 9.17·10⁻⁴),“核小体”(p= 5.6 * 10⁻⁴）和核糖体的结构组分'（p = 2.4·10⁻⁴）.由于用水或线虫接种植物根源导致组织伤害，因此抑制房屋保持基因的表达可能反映了对这种压力条件的反应（附加文件5）.对于上调的基因，最丰富的氧化石墨烯术语包括“对氧化应激的反应”(p= 5.72 * 10⁻¹⁶)及过氧化物酶活性(p= 3.05 * 10⁻¹⁶)(额外的文件6）.这些术语反映了通常导致ROS（反应性氧物质）和氧化应激（有时被编程的细胞死亡的氧化应激的非特异性细胞应答，以及用于细胞壁改性的过氧化物酶的合成．通常，去术语富集对应于对根伤害的组合非特异性反应的框架中的预期转录组，以及对GPCN侵扰的特异性反应的开始（接种后72小时）。

进一步检查DEG名单，发现基因型之间存在显著差异。我们可以看到耐药性的转录组S. Phureja.基因型的特征在于根据其注释的同样与各种马铃薯防御相关基因相似的转录物的含量更高（[52.，54.' description '字段)(附加文件2）.由于本研究的目的是鉴定对GPCN具有强抗性的主要R基因，最有可能的候选基因可能属于NBS-LRR家族。然而,注释美国tuberosumgenes is frequently scarce, and only a very few DEGs revealed in this study contained the specific term ‘NBS-LRR’ or a similar term in the ‘description’ field, whereas non-specific terms such as ‘disease resistance’ were more abundant (Additional file2）.因此，我们使用了马铃薯基因组中预测的755个NB-LRR位点的额外信息[46.］．这项分析显示大约有330个S. Phureja.可能编码NBS-LRR相关蛋白的根转录本(附加文件)7）.这个deg列表是基于下面的简单描述进行排名的(附加文件8):第1组包含最可能的候选基因，在易感基因的根中没有或很少表达mRNAS. Phureja.而耐药基因型则代表根型i-0144787(2个基因)。第二组包含S. Phureja.MRNA在易感基因型的水接种根部和抗性变异（17个基因）的水接种根中的水接种根部没有或几乎没有表示。最后，第3组含有在抗性和易感腐蚀性的MRNA中，但在抗性基因型（11个基因）中的几次更丰富（额外文件8）.

马铃薯群体和近缘野生种中新的主要抗性位点的鉴定是马铃薯育种的重要步骤。R位点定位通常通过表型、分离群体和大量遗传标记进行基因分型。然而，R基因的鉴定往往受到其性质的限制。植物基因组中NBS-LRR基因的复杂聚类正在迅速进化;植物品种的特征通常是高水平的拷贝数变异和不成比例的SNP积累在这些基因[5，19.］．

新一代测序技术的发展使得基因组核苷酸序列的积累，为该领域提供了新的机遇。抗性植物基因型基因组的重测序有助于识别感兴趣的R基因(例如，[4，5，6])。利用生物信息学工具(例如，[21.，22.，23.])，并将这些工具应用于基因组分析，可提供大量潜在RGAs [10.］．

尽管存在各种基于NGS的方法，但提供了广泛的新机遇，但识别r基因的感兴趣是复杂且耗时的过程。易受耐受植物基因型的组织特异性转录组的组织特异性转录组的组织特异性转录组的结合可能提供潜在的NBS-LRR编码基因的生物信息预测，可以提供一种快速的方式来编制候选RGA列表以获得分离群体的基因分型。由于大多数病原体通常感染特异性组织，转录组分析剥去了在参考基因组中注释的非特异性官能R基因和非转录的假药。反过来，NBS-LRR编码MRNA的预测可以基本上改善核苷酸序列数据库中的相关基因的注释。

为了测试这种方法，我们选择了两种不同的S. Phureja.来自可能携带多种功能性R基因的VIR集合。以前已经证明，这些材料在对重要病原体的抗性方面是对比的G. Rostochiensis.（致命型RO1）[25.，我们评估了NBS-LRR基因在其根转录组中的差异表达数量。

GPCN侵染与主要抗性基因

在亲和不亲和的作用下，根结线虫幼体侵入根系和向维管束迁移到取食点的过程是相似的。1）.在线虫注入食管腺分泌物以启动饲养部位的形成之后，可能发生特定的线虫识别。如果相互作用是不相容的，则在接种后，可以早于24小时发生过敏反应，并且可以由营养供应中的细胞死亡线区域区域鉴定[55］．但是，稍后也可以启动电阻。G. Rostochiensis.要么G. Pallida.可以建立合色酸盐，并在抵抗番茄和含NBS-LRR抗性基因的土豆厂成为久坐不动（英雄和GPA2.而周围的植物细胞则进一步坏死，从而阻止了线虫生命周期的完成。延迟的HR可能是由于识别能力弱或线虫效应器出现较晚[55］．线虫接种的另一个重要特征是显著的组织损伤，导致植物细胞壁碎片诱导的非特异性损伤应激反应。这种非特异性伤害反应可能与对GPCN的特异性反应重叠，或成为其组成部分[56］．

先前在Solanaceae中鉴定了来自其他栽培物种或其野生亲属的许多定量性状基因座，其含有部分耐药于马铃薯囊肿线性[57］．发现了几个适宜马铃薯育种的主基因。的H1.该位点具有对GPCN(致病型Ro1和Ro4)的超敏抗性，并在育种中得到了非常积极的开发[33.］．Gro1-4是Gro1位点的成员，该位点几乎对所有的病型都具有绝对抗性G. Rostochiensis.因此，它被认为是有用的抗性基因[58］．广谱耐抗体G. Rostochiensis.和G. Pallida.是由Grp1基因(59］．只有两个G. Rostochiensis.在分子水平上对抗性基因进行了表征:GPA2.从美国tuberosumssp。andigena［60),Gro1-4从美国spegazzinii［58］．GPA2.和Gro1-4来自番茄的基因和抗性基因（英雄）属于NBS-LRR家族。

S. Phureja.模型

众所周知，加入I-0144786易感，而I-0144787对GPCN具有高度抗性[25.，这些抗性程度在本研究中得到了证实。1和2；表格1）.我们可以假设，i-0144787植物的根转录组中含有编码NBS-LRR基因的mrna，这些基因在i-0144786植物的根中没有转录(或转录水平显著降低)。为了验证这一假设，接种两种基因型的根转录组分别在72小时后采集G. Rostochiensis.或者水被排序。编制deg列表，GO项分析显示，下调组的管家基因富集，上调组的应激相关基因富集(表)3.；附加文件2）.该结果反映了对单独组织伤害的典型响应（与水接种）或组织伤害和线虫侵扰的组合（与GPCN接种）。还发现参考中只有一种相应的基因美国tuberosum基因组被注释为属于NBS-LRR家族，这使得进一步分析候选R基因的选择复杂化。这一发现可能是由于标准管道的严格意义阈值和稀缺注释造成的。因此，我们使用了755个NB-LRR位点的额外信息美国tuberosum基因组(46.］．这一信息揭示了根转录组中大约300个转录本S. Phureja.可能编码nbs - lrr相关蛋白的基因型。

有趣的是，i-0144786和i-0144787基因型的特征是表达nbs - lrr样RGAs的不同亚群8）.这些植物是在不同的条件和致病压力下进化而来的。我们认为，RGA亚群的差异表达与对各种病原菌抗性的表型筛选之间的系统比较，可能是鉴定新的候选R基因的一个前瞻性来源。在本研究中，比较了4个转录组(接种水或线虫72 h后，抗性和敏感基因型的根)。线虫幼体在渗透过程中明显损伤组织，造成非特异性损伤应激。接种过程本身也会损伤根组织。因此，水接种根系的转录组可以被认为是揭示生物胁迫反应组分的一个适当的控制。为了筛选潜在的R基因，将nbs - lrr样基因分为3组(附加文件)8）.第一组包含两份抄本S. Phureja.存在于抗性基因型I-0144787的根部的基因，并且在易感I-0144786中以非常少量的量缺席或存在。第二组含有17个转录物，其在水接种易感植物的根转录组中缺少或少量。强抵抗力G. Rostochiensis.通常基于快速的超敏反应，随后邻近植物细胞程序性死亡，很可能有效的NBS-LRR基因应该在线虫侵袭前表达(例如，[12.，14.])。我们假设NBS-LRR受体基因在没有GPCN侵染的情况下低表达导致了超敏感反应的延迟，可能为线虫进展的成功提供了时间。最后，第三组包括两种基因型的根中存在的转录本，但在i-0144787登录中更为丰富。

对型转录om的比较分析Solanum Phureja.具有额外的MRNA的基因型对NBS-LRR样蛋白编码的MRNAS的额外计算预测显示了用于进一步共分离分析的合理数量的候选R基因。在我们看来，该方法提供了一种快速候选基因选择方法，并且可以与基于基因组重构的更复杂的研究并行使用。如果成功，这种方法会大大加速鉴定靶向育种所需的时间。还应该提到，除了新基因的来源，S. Phureja.是可育型细胞质的供体，这对普通马铃薯的遗传改良大有前途美国tuberosum［61］．

不适用。

资金

这项工作得到了俄罗斯科学基金会(RSF) No. 16-16-04073(包括出版费用)的资助。在IC&G温室设施中种植植物(由预算项目0324-2016-0001支持);测序在IC&G基因组研究中心进行。

可用性数据和材料

原始测序数据可在NCBI获得，如BioProject PRJNA408434。

关于这个补充剂

本文已作为一部分发布BMC植物生物学2017年第17卷增刊2:2017年Belyaev会议植物生物学文章选集。该补充剂的完整内容可在//www.cinefiend.com/articles/supplements/volume-17-supplement-2网站上找到。

隶属关系

1. 俄罗斯新西伯利亚科学院细胞学和遗传学研究所，新西伯利亚630090

   Alex V. Kochetov, Anastasiya Y. Glagoleva, Kseniya V. Strygina, Elena K. Khlestkina, Sophia V. Gerasimova, Salmaz M. Ibragimova, Natalja V. Shatskaya, Gennady V. Vasilyev, Dmitry A. Afonnikov & Nikolay A. Shmakov

2. 新西伯利亚国立大学，新西伯利亚630090，俄罗斯

   Alex V. Kochetov, Anastasiya Y. Glagoleva & Elena K. Khlestkina

3. 瓦维洛夫植物遗传资源研究所(VIR)，圣彼得堡，19万，俄罗斯

   Olga Y. Antonova、Tatyana A. Gavrilenko和Natalia V. Alpatyeva

4. 圣彼得堡国立大学，圣彼得堡，199034，俄罗斯

   Tatyana A. Gavrilenko.

5. 俄罗斯植物保护研究所，圣彼得堡，196608，俄罗斯

   Alexander Khiutti & Olga S. Afanasenko

6. 新西伯利亚州农业大学，新西伯利亚，630039，俄罗斯

   亚历克斯·沃基特夫

贡献

AVK设计了这个研究并撰写了手稿。OSA和AK为GPCN接种和抗性评价的实验部分。GVV编写文库，并在Ion Torrent平台上对文库进行测序，参与数据解读。NVS参与了图书馆的编制和排序工作。KVS、AYG、SVG参与了RNA的提取、cDNA的制备、qRT-PCR内参基因引物的设计、qRT-PCR的性能以及手稿的起草。NAS和DAA对测序数据进行硅分析，并参与了手稿的起草。EKK和SMI对研究的设计和协调以及对手稿的严格修改做出了贡献。OYA和NVA准备了S. Phureja.植物材料为GPCN接种，进行RNA提取S. Phureja.根并参与数据解释。标签建议使用所选S. Phureja.本研究中的基因型，提供了这种材料并参与了该研究的协调。所有作者阅读并认可的终稿。

通讯作者

对应到亚历克斯·沃基特夫．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

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