影响单子叶植物种类中花青素生物合成途径基因进化的因素

背景

现有数据表明，即使在普遍的代谢途径中，也存在一些特定物种的结构基因调控特征。例如，在花青素生物合成途径（ABP）中，基因可能受ABP特异性调节因子的调节，其表达水平可能与花青素色素沉着密切相关，也可能独立于色素沉着而表达。同源ABP基因数据集(CHS.那ch那F3h那F3'H.那DFR.那ANS.通过构建具有不同基因调控模式和不同传粉方式的单子叶和双子叶植物，检验这些因素是否影响基因的进化。

结果

使用最大的似然方法，我们证明了尽管整个ABP基因在纯化选择下，​​但在上游基因上的选择比下游基因更大，来自不同植物种群的基因经历了不同的选择性强度。基因的选择性压力在Dicots中比单焦（F3h进一步下游基因）和依赖于授粉的植物，而不是在粉丝犬无关的物种（ch进一步的下游基因），表明授粉类型在花青素生物合成基因网络的进化中起着重要作用。对不同的调控模式对进化的影响进行了对比F3h和DFR.基因，具有更大的选择性压力F3h基因在植物物种中的表达与色素沉着和更大的选择压力不强相关DFR.在基因表达与色素沉着相关的植物种类中。

结论

我们证明了授粉类型和调节模式对ABP基因的演变的影响，但在这些因素的框架中，一些基因的演变不能解释，例如较弱的选择性压力作用CHS.吸引传粉者的物种或更强的选择压力F3h在基因表达与色素沉着无关的植物物种中。观察结果表明，其他因素可能会影响这些基因的进化。其中一个因素可能是基因复制的影响，基因复制体之间的功能进一步分化，并放松了对它们的选择压力。为了验证这一假设，需要使用适当的数据集对重复的基因序列及其在类黄酮生物合成途径中的功能进行额外测试。

花青素生物合成途径（ABP）产生负责植物不同部位着色的颜料。它分享了许多常见酶，其途径产生各种类类的黄酮类化合物（附加文件1：图S1），它提供重要的生理功能，包括免受病原体和不利的环境因素，信号传导和与共生的相互作用，促进花粉管生长和激素运输的调解[1那2那3.]．ABP的结构基因在所有被子植物中都是通用的，并且在许多植物中都有其特征。他们可以分为两组:上游基因编码查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮-黄酮异构酶(CHI)、黄酮3-羟化酶(F3H)和二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)，合成一个或多个非花青素类黄酮通路的前体，下游基因编码花青素合成酶(ANS)、糖基转移酶(GT)、鼠李糖基转移酶(RT)，乙酰转移酶(AT)和甲基转移酶(MT)是花青素途径特异的(附加文件)1：图S1）。

ABP在时间和空间上受到三组主要调控因子(MYB、MYC (bHLH)和WD40)的转录因子的调控，这三组因子产生激活结构基因所需的MBW复合物[4.]．

作为最佳特征的代谢途径之一，ABP基因网络提供了一种有用的系统，用于研究同一代谢途径内基因的演化模式[5.]．上游酶与下游的较慢演变已经证明，涉及单焦和Dicots以及在属中的比较番薯， 具体来说 [6.那7.]．这种进化模式的一个可能的解释是上游酶在比下游酶更大的选择性约束（即，在纯化选择的更大强度下）。可能出现较大的约束，因为上游基因参与不同类类黄酮类化合物的合成。这些基因中的突变将对植物适应性具有更有害的脂肪熵作用，并且通过净化选择更有可能消除，与下游基因发生的突变可能持续存在[6.那7.那8.]．据报道，Terpenoid据报道了沿代谢途径的选择性约束的类似模式[9.[carotenoid [10.生物合成途径。然而，在对苯丙素通路的研究中，未发现通路中基因的位置与选择性约束之间的关系拟南芥蒂利亚纳[11.]奥西泽菌部落中的吉伯林途径[12.或淀粉途径奥雅萨苜蓿[13.]．

另一种进化模式与结构基因相比，ABP的调节基因更快地进化[6.]．尽管已经获得了MYB，MYC（BHLH）和WD40调节基因中阳性选择的证据，但数据已经证明了对调节基因的选择性约束的变化，在MYB基因上具有更轻松的（较弱）的选择。调节基因所经历的选择性约束的差异也通过其不同的功能载荷解释，具有更大的选择性压力作用于具有更多功能的基因[14.]．

Ho和Smith揭示了ABP遗传网络的另一个进化模式[15.]，世卫组织研究了花卉色素沉积损失在途径结构基因的演变中的影响。他们发现，虽然来自色素和未简化谱系的Solanaceae的基因经历了纯化选择，但在研究的三种结构基因中的两种中有缓解选择性压力（ch和F3h与来自着色谱系的基因相比，在未简化的谱系中检测到。假设色素沉积损失是由于调节基因的突变，我们假设ABP的结构和调节基因的演化之间存在联系。

现有数据表明，在普遍的花青素生物合成代谢途径中，结构基因的某些物种特异性调控特征出现。在不同的植物物种中，共同的结构基因受到不同的调控，这取决于预先决定不同器官中色素沉着的调控基因的表达（图。1）.在一些植物物种中，例如玉米（Zea Mays.）和大麦（普通大麦），整组ABP基因由MBW复合物共调控，作为一个监管单位[16.那17.]．在其他植物物种中，仅通过ABP调节因子强烈地调节这些基因的一部分或甚至单个基因，而该途径其余部分的基因具有独立的调节模式，与ABP调节因子和花青素色素沉着不同。已经描述了这种模式，例如拟南芥蒂利亚纳幼苗，基因分为“早期”和“晚”生物合成的基因。“早期”基因在没有颜料合成的情况下表达，而“晚期”基因在花青素生物合成的MBW复合物存在下共同表达（联合调节）[18.]．

我们假设确定色素沉着型发育的调节模式可以对与色素沉着的基因相比，对色素沉着的基因产生额外的选择性约束。进行目前的研究以测试不同调控模式是否影响ABP结构基因的分子演变。数据集是基于单圈和双子叶植物物种构建，具有最表征的结构基因及其调节模式。数据集允许测试可能影响分子演进的其他因素。特别是，测试了ABP基因的选择性约束，以确定单子叶和二蛀植物种类的差异以及授粉类型如何影响ABP基因进化。

鉴定近型花青素生物合成基因及其监管模式

六个ABP基因的序列（CHS.那ch那F3h那F3'H.那DFR.那ANS.)在单子叶植物中(山羊草焦肋骨。，安杉西亚姆林登exandré，普通大麦l奥雅萨苜蓿l普通小麦lTriticum Urartu.图姆。Gandil交货。Zea Mays.L.）和Dicots（琴叶拟南芥(l)O 'Kane & Al-Shehbaz拟南芥蒂利亚纳(l)Heynh。Malus Domestica.borkh。，Solanum Tuberosum.l山葡萄Rupr。葡萄L.），具有最具特征的结构基因的途径，并从数据库中检索其调节模式（附加文件2：表S1）。所选植物物种的编码区的长度从1170到1203 bp变化CHS.从687 ~ 777 bpch，从1077到1167 bpF3h，从1530到1671 bpF3'H.，从1014到1155 bpDFR.，并在年内由1065至1368个基点ANS.。通过在进化期间发生的插入缺失（Indel）事件来预先确定基因之间的长度的变化。这些诱惑被排除在分析之外。

在所有基因中，单子叶植物和双子叶植物的核苷酸水平上的两两差异从0到45%不等ch）.在单焦点和双点之间，分歧达到65％（ANS.)(额外的文件3.:图S2)。为了进行分子进化分析，我们基于组合ABP基因构建了每个物种的系统发育树(图1)。2）.在树中区分单焦点和双点的组，树木对应于为分析所选择的植物物种的分类分类分类。

在选择分析的植物种类中，ABP基因调节的模式是不同的（图。1）.据报道，通过ABP调节因子进行整个基因的共调查发生在玉米和大麦的谷物中[16.那17.]，在苹果的皮肤中（M. Domestica.）[19.]在土豆的肉（S. Tuberosum.）块茎[20.]．两种类型的差异调节基因，以其对与ABP监管因素的共同调节的依赖性的依赖性或与监管因素无关的表达，在大麦叶护套中揭示了[21.]，水稻幼苗(o .漂白亚麻纤维卷）[22.),拟南芥[18.]小麦颗粒[23.，马铃薯块茎皮[24.那25.Flamingo花的铲子（A. Andraeanum.）[26.]和葡萄浆果的皮肤[27.那28.]综上所述，ABP基因的调控模式是物种特异性的，不依赖于植物物种的种类。

ABP基因的选择性压力的变异

对每个基因的同义替代率（DN / DS或ω）的非同义的单比率模型显示Ω值从0.036变化（对于CHS.)至0.121(ch） （桌子1)，表明这些基因主要经历了纯化选择。比较基因之间的dN/dS比率（附加文件4.：表S2）。CHS.经历了最强的选择性压力（DN / DS = 0.036），其显着低于作用于其他ABP基因的选择性压力。减少约束的选择取决于F3h(0.061)，与其他基因有显著差异。基因组F3'H.那DFR.和ANS.选择压力在0.085 ~ 0.095之间差异显著，与其他基因差异显著。检测到最弱的选择压力ch基因（0.121）。在ABP代谢途径中基因编码的结构基因的DN / DS比与基因编码的位置之间没有相关性（表2， 全球的）。

影响ABP基因选择性压力的因素

植物物种基于它们是否属于单子叶或单萝卜类（图。2），授粉类型（图。2）或调节模式（图。1）.为了检验这些因素可能对作用于基因的选择压力产生影响的假设，对这些组应用了具有独立dN/dS比值的分支模型。

为了区分单子叶植物和双子叶植物，使用了这两个比率模型，结果显示单子叶植物的dN/dS比率显著高于双子叶植物F3h(0.125vs0.034），F3'H.(0.120vs0.065），DFR.(0.201vs0.061），以及ANS.(0.219vs0.049)。这些基因的双比率模型导致的可能性显著高于单一(全局)比率模型，而在双比率模型下的似然函数没有得到改善CHS.和ch（桌子1， 无花果。3）;因此，单个比率模型无法拒绝。在单圈植物物种组中检测到由代谢途径中基因编码的结构基因的DN / DS比的强阳性相关性和由代谢途径中的基因编码的位置（R._S. = 0.81,P.< 0.05)，而双子叶组则无相关性(R._S. = −0.03,P. > 0.05) (Table2）.

授粉类型是测试的第二因素，其可能影响作用于ABP基因的选择性压力。三比率模型显示植物物种的基因没有授粉的植物物种的基因显着更高的DN / DS比率与吸引粉粉授粉的物种（表1， 无花果。3 b）， 除了CHS.，该组中的DN / DS比受授粉授粉的小组，粉丝授予的群体的两倍多，没有粉丝簇（0.099vs0.042）。观察到两组之间的ω比的最大差异ANS.基因，在不吸引传染案种子的情况下展示了植物种群中的近三倍较高的比例（0.196vs0.067）。对于整套测试基因，将植物种类分为两组基于授粉类型的模型导致比单比率模型显着更高（表1）.排除ch来自分析的基因，结构基因的DN / DS比与由植物种类组合的代谢途径中的基因的DN / DS比率之间发现了强的正相关性的强阳性相关性（R._S. = 0.97,P. < 0.05）（表1）2）.

通过对调控模式影响作用于基因的选择压力的假设的检验，发现了较高的dN/dS比值F3h该基因受abp特异性调控因子的调控，并与颜色发育相关(0.032vs0.127），而是为了DFR.基因，观察到相反的趋势，植物种类略微增加，其中基因独立于显色（0.098）vs0.107）（表1， 无花果。3 c）.为F3h和DFR.与单比率模型相比，基因在双比模型下观察到似然性的显着改善。虽然DN / DS比率CHS.那ch和ANS.分别在植物种类中增加和减少，其中基因以颜色依赖的方式调节（0.051vs0.035 for.CHS.，0.136vs0.119 for.ch和0.087vs0.106ANS.)，单比率模型不能被这些基因拒绝(表1）.

ABP基因经历了净化选择

我们的数据支持先前发现，ABP的核心基因具有高度保守和经验丰富的纯化选择，可能由于它们在植物生理学的广泛功能以及上游基因比下游基因更受约束的影响：6.那7.那8.]．在目前的研究中，在单个比率模型下基因之间的选择性压力的比较证明了基因可以分为四组：（i）CHS.，（ii）ch（iii）F3h(四)一组包含F3'H.那DFR.和ANS.。这些群体的选择性压力显着不同，具有最强的选择性压力作用CHS.和最弱的行动ch；对基因组的显着不区分的选择性压力比作用的选择弱F3h（附加文件4.：表S2）。如前所述，对于不同代谢途径的结构和调节基因，通过具有抗性阶段的基因体验更强的选择性压力[5.那9.那12.]．在目前的研究中，除了ch，作用在ABP基因上的选择压力符合这一规律;CHS.是黄酮类化代谢中的入口点，并在此酶的参与中合成所有类类黄酮类化合物F3h参与少量类黄酮化合物的生物合成。一种难以区分的选择压力作用于下游的一组基因F3'H.那DFR.和答,表明这些基因具有类似的功能负荷和共同进化。上游基因奇，行动后CHS，不符合最小进化的规则。对轻松选择性压力的可能解释之一ch没有Chi的参与，是在没有参与的情况下将Chalcons自发转化为黄芪的可能性[29.]．

在单比率模型下，基因与通路中的位置之间没有相关性，即使当选择压力作用于ch没有包括基因（表2）.然而，当允许植物物种的不同DN / D比的两种或三比率模型被应用于数据集时，在单圈植物种类的组中检测到途径中的基因和位置之间的相关性在植物种类中是自我和风力授粉的（表2）.这一观察结果使我们认为ABP基因在不同植物类群中的进化模式不同。

影响ABP基因选择性压力的因素

比较单个和局部比率进化模型下产生的可能性函数显示ABP基因在不同谱系中经历了不同的选择性压力（表1）.为了测试哪些因素可能影响选择性压力，将单比率模型与两种或三比模型进行比较，允许基于植物物种类组合的分支的分离分离ω（图。2），授粉类型（图。2（图）和调节模式（图。1）.

比较三个假设下构建的似函数的改善表明，授粉类型对整个基因的选择性压力相关联，其具有较为较大的选择性约束，对植物物种的植物物种的植物种类中的基因作用。CHS.，在没有授粉授粉的植物种群中更受限制（图。3 b）.据报道，上游基因可以进行复制，并在复制副本之间划分广泛的功能多效性，这可能会放松对某些基因副本的限制[30.那31.]．关键黄酮化生物合成基因的观察到的放松约束CHS.在花粉剂依赖性植物物种中，可以通过可能发生的基因的功能较少的载荷来解释，因为专门从而减少类黄酮类别的生物合成的基因。重复的CHS.基因已在广泛多样化的植物物种中报道，包括为该分析选择的植物物种[32.那33.]．

有趣的是ANS.花青素生物合成的特异性基因在依赖传粉者的物种中受到的限制几乎是对照组的三倍ANS.来自独立传粉者群体。在依赖传粉者的植物物种中，ABP基因具有更高的选择压力，这种观察到的分子进化模式可能是因为花的颜色是吸引传粉者的特征之一。这是授粉综合症的特征之一[34.因此，与来自植物种类的基因相比，负责颜色的基因另外约束，其中颜色没有这种功能（在自我或风授粉植物种类中）。

在Dicots，选择性压力F3h进一步下游基因比单焦度更强，而选择性压力CHS.和ch在属于不同类别的植物中难以区分（表1， 无花果。3）.最有可能，观察到的模式为演变F3h更多的下游基因可以用授粉类型来解释，因为在研究的单子叶植物组中，只有一种植物，A. Andraeanum.，通过吸引传染案素授粉（图。2）.

调节模式对作用于ABP基因的选择性压力有一些影响，并且最明显的效果在于F3h基因，其中有一个出乎意料的更高的选择压力的基因F3h基因在植物物种中的基因不依赖于ABP特异性调节因子或显色（表1）.利用最小肺炎的原理意味着具有更广泛功能的基因更受限制，我们可以假设“不受监管”F3h基因可能参与多种类黄酮的合成，包括花青素，而“共同调节”的功能F3h基因可能更多地与花青素的生物合成有关，而较少地与非色素类黄酮的合成有关。

这种功能多样化也可能发生在复制事件之后，这可能会放松对所有或部分基因复制的限制[30.那35.]．在选择用于分析的植物种中，重复的F3h该基因已被报道用于小麦及相关物种[36.].一份F3h由针刺组织中的ABP特异性调节因子进行特别调节，并在其他未能的器官中表达，其中其功能可能与未简化类的类黄酮类生物合成有关，而副寄生副本F3H-B2与色素发育无关，仅在无色素根中特异表达[36.]．

虽然整组花青素生物合成途径基因是在纯化的选择中，表明其在植物寿命中的重要功能，但在不同的植物物种组合中揭示了作用于基因的选择性压力的变化，基于它们是否属于单码或双滴，它们的授粉类型或基因的调节模式。在测试的因素中，只有授粉类型对整个ABP基因的选择性约束仅对选择性约束产生影响，这表明授粉类型在花青素生物合成的演变中的重要作用，而调节模式对一些的演变有影响途径基因。一些基因的演变如CHS.在依赖于传导士依赖的植物种类中，如F3h在基因与色素沉着不相关的植物种类中，无法在测试的因素的框架中解释。我们假设额外因素的影响，例如基因副本之间的多重复制和多样化，这可能会解释观察到的放松约束CHS.和F3h一些群体的基因。后一种假设应通过合适的数据集进行测试，该数据集将数据与复制基因序列的数据及其在类黄酮生物合成途径中的功能结合起来。

数据集建设

为了分析ABP基因的分子演进，植物物种覆盖具有关于结构基因的最具特征途径的宽分类学距离（CHS.那ch那F3h那F3'H.那DFR.那ANS.）及其监管模式如下：单圈子，AE。Tauschii.那A. Andraeanum.那h . vulgare那o .漂白亚麻纤维卷那T. Aestivum.那T. Uraartu.那Z. Mays.；双子叶植物,A. Lyrata.那答:芥那M. Domestica.那S. Tuberosum.那V.Amurensis.那V. Vinifera.。

已知的基因序列答:芥那V. Vinifera.， 或者Z. Mays.用作BLAST搜索的查询序列[37.] NCBI中的直译基因（www.ncbi.nlm.nih.gov/database/），URGI（https://urgi.versailles.inra.fr/blast/blast.php）或谷仓（http://apex.ipk-gatersleben.de/apex/f?p=284:10)(额外的文件2:表S1)数据库。的ANS.基因T. Uraartu.与从URGI数据库检索的两种Centig组合（1,371,254和1,363,707）。通过应用底漆对，前进：5'ATGCCGATCGAGAA3'和反向：5'TTGGTGAGATGAAGGAGAG3'来对该基因的缺失部分进行测序，使用PRIMERQUEST工具软件（https://eu.idtdna.com/primerquest/home/Index.)(额外的文件5.）.

为了确保所检索和注释序列的质量（以及排除推定的罕见罕见的内部SNP或测序错误，它们被爆炸到NCBI数据库并与同源序列进行比较。在我们的比较研究中进一步使用的所有序列通过了成功的质量测试。

将基因的核苷酸序列转换为相应的肽序列，并用MULTALIN 5.4.1进行比对[38.]．手动编辑氨基酸序列比对以消除肽的N-和C-末端的信号序列，以及诱导和间隙。随后将编辑的肽对准转化为相应的核苷酸序列比对允许维持编码读取帧以进行进一步的基于密码子的分析。

基于bootstrap neighbor joining (NJ)方法和Kimura 2参数模型，MEGA v5.1将ABP基因序列结合构建系统发育树[39.].内部节点的稳定性通过对1000个重复的bootstrap分析进行评估。

所选择的物种中基因的调节模式从公开的制品中取出并在图1中示意性地组合在一起。1。

分子进化分析

HyPhy包中包含的基于密码子的最大似然法[40应用以确定非同义对同义取代（DN / DS或ω）的比例，其提供蛋白质水平的选择性压力的量度，其中ω<1表示净化选择，ω= 1和ω> 1表示中性演变和阳性选择。将一般时间可逆模型（GTR或Rev）作为核苷酸替代模型应用[41]。每个基因的ω值在全局（或一个比率）模型下进行评估，该模型具有所有分支的共享ω。使用Ho和Smith描述的方法比较基因之间的ω值[15.]对于该分析，将基因分组为所有可能的配对。将允许每个基因具有不同密码子频率和替换率但符合单个dN/dS比率（ω）的模型的可能性与应用似然比检验估计每个基因单独ω的模型的可能性进行比较[42]．

在代谢途径中基因的ω比和由代谢途径中基因编码的酶的位置之间计算Spearman的秩相关系数。

为了检验不同因素对作用于ABP基因的选择压力的影响，我们将全局模型与分支模型进行了比较，后者对组合的分支组估计了单独的ω值，以检验各种假设。显著性检验采用似然比检验。

使用构造的数据集进行三种因素的效果：计算植物物种的类（每个ABP基因的两个单独ω用于单焦点和双斑点，ω_m/ω._D.）;授粉授粉授粉的授粉授粉授粉的授粉授粉授粉的植物物种，但在没有传授园的吸引力，ω_P./ω._NP.）;调节模式（每种ABP基因的两个单独ω用于植物物种，其中基因受ABP调节因子强烈调节，与色素沉着和植物物种相关，其中基因受到肤色的调节;该ω比称为颜色依赖性和与颜色无关，Ω_光盘/ω._Ind.）.基于假设检验的植物种类和内部节点的组合见(附加文件)6.：图S3）。为了基于其调节模式结合所选择的分子分析的植物物种，制定了两种假设：（1）密切相关的物种具有类似的ABP基因调节模式（例如，那已知的调节模式答:芥被分享了A. Lyrata.，该调节模式尚未知道）;（2）导致具有颜色相关的谱系的内部节点以及色彩无关的调节模式与物种相结合，其中基因独立于花青素生物合成。

ABP：

花青素生物合成途径

答:

花青素合成酶

在：

乙酰转移酶

Chi：

Chalcone-Flavanone异构酶

CHS：

Chalcone合成酶

DFR：

Dihydroflavonol 4-reductase

F3'H:

类黄酮3 ' -羟化酶

F3H:

黄酮3-羟化酶

GT：

糖基转移酶

公吨：

甲基转移酶

RT：

rhamnosyltransferase.

不适用。

资金

出版成本由俄罗斯基础研究基金会资助（授予第16-34-60052号）。

可用性数据和材料

本研究中使用和分析的序列比对均可根据合理要求由通讯作者提供。

关于这个补充

本文已作为一部分发布BMC植物生物学第17卷补充2,2017：2017年Belyaev会议的选定文章：植物生物学。补充的完整内容可在线提供//www.cinefiend.com/articles/supplements/volume-17-supplement-2。

隶属关系

1. 俄罗斯新西伯利亚科学院西伯利亚分公司细胞学和遗传学研究所，俄罗斯

   olesya yu。肖瓦省，阿纳斯塔西亚宇。Glagoleva＆Elena K. Khlestkina

2. 俄罗斯新西伯利亚新西伯利亚州立大学

   安娜贾西亚。Glagoleva＆Elena K. Khlestkina

贡献

OYS进行了分子生物学分析，解释数据，并准备了稿件的草案。AYG构建了数据集并参与了起草稿件。EKK构思了这项研究，促成了其概念，以解释数据和稿件的关键修订。所有作者阅读并认可的终稿。

通讯作者

对应于olesya yu。雪叶。

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商说明

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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