胞外核糖核酸酶基因的表达增加了电阻黄瓜花叶病毒在烟草

背景

质外体在针对病原体引起的植物防御中起重要作用。有些细胞外PR-4蛋白具有核糖核酸酶活性，并且可以直接抑制致病真菌的生长。这可能是细胞外核糖核酸酶还可以对某些病毒与RNA基因组保护植物。然而，许多植物RNA酶是多功能和他们的核糖核酸活性和抗病毒防御之间的直接联系仍然需要加以澄清。在这项研究中，我们评估的阻力烟草植物表达对非植物单链特异性RNA酶外黄瓜花叶病毒。

结果

接种10 d后，对照非转基因植株出现严重的花叶症状和萎缩现象黄瓜花叶病毒（CMV），而这样的疾病症状在表达核糖核酸酶基因的转基因植物抑制。在Western blot分析，在控制植物的上部未接种叶中观察到病毒增殖，而病毒水平在这些转基因植物的非常低。这些结果表明对CMV的阻力增加了异源RNA酶基因的表达。

结论

我们之前已经证明，表达外源核糖核酸的烟草植株具有对烟草花叶病毒的高抗性。在这项研究中，我们证明了细胞外RNase活性水平的升高导致对一种基因组组织和生命周期不同的病毒的抗性增加。因此，我们认为病原体诱导的植物外体细胞RNases的表达可能会增加对RNA基因组病毒的非特异性抗性。

该血晶体在植物防御中对各种病原体进行了重要作用[1-3.]．核糖核酸酶属于质外体动态蛋白质组，它们的合成随着各种刺激而增加。特别是一些具有核糖核酸酶活性的细胞外s样RNases和致病相关蛋白4 (PR-4)在损伤或病原体侵入后局部和全身均升高[4.]．它已被认为胞外核糖核酸酶参与打击与RNA基因组的病毒防御。然而，对RNA病毒RNA的质外体水解活性和阻力之间的直接联系尚未得到证实。两个PR-4蛋白和S-等核糖核酸酶具有多种功能，并且响应于病原体侵入可以通过除直接病毒RNA降解的其它过程进行说明合成增加。S-像RNA酶被认为是磷酸盐的酶重新激励;它们消化衰老期间或受伤后[从植物细胞中释放出来的RNA分子5.]，有些则用作抗真菌蛋白[6.那7.]．不同的PR-4蛋白质可以具有若干功能（例如，几丁酶，RNASE，DNASES和编程细胞死亡的诱导），主要被认为是抗真菌蛋白[8.-10.]．PR-4和S样RNase基因的表达模式相当复杂，并且它们参与抗病毒防御机制尚不清楚。

非植物细胞外RNases可以用作测试核糖核分子溶液活性与RNA病毒抗性之间的核糖核溶解活性之间的直接连接的工具。在这项研究中，我们分析了表达牛胰腺核糖核酸酶（RNasea）的转基因烟草植物的抗性黄瓜花叶病毒（CMV）。异源细胞外RNase的升高水平显着增加了阻力水平。基于这些结果和其他间接证据，我们得出结论，妊娠rNases参与非特异性抗病毒防御作为植物非宿主阻力机制的一部分[11.]．

烟草（烟草简历。SR1）通过含有牛胰腺RNase cDNA的遗传构建体转化，甘露醛合酶2'启动子的控制[12.]．使用在25°的塑料罐中使用蛭石和珍珠岩（1：1）的混合物生长三种独立转基因系（ESR-3，ESR-8和ESR-10）和野生型（对照）植物的烟草植物C在人造光下（16小时的光/ 8小时）。黄色菌株黄瓜花叶病毒被用来评估病毒的抵抗能力[13.]．4周龄的叶子烟草benthamiana如前所述，用含CMV的碳化硅对植物进行摩擦接种(Takahashi et al. [14.])。1周后，通过将接种的叶片在1：5（w：v）0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.2）均匀化，在4℃下将接种的叶片均化接种的叶片均化。在4℃下将匀浆物离心10分钟。ESR植物和对照植物用10μL上清液接种，用无菌去离子水洗涤，并用塑料包装覆盖1天。10天后，观察疾病症状，并且使用抗涂层蛋白多克隆抗体通过Western印迹分析未征收的上叶中的病毒水平[14.]．根据前面所述的方法测定粗提物和质外体馏分中的RNase活性[15.那16.]．

转基因结构及转基因植物特征

遗传构建[12.]含牛胰核糖核酸酶基因cDNA的[17.在Mannopin合酶2'启动子的控制下，在PC27载体中克隆了[18.]．启动密码子上下文已优化[19.那20.]．选择合适的启动子是设计遗传结构的重要步骤[21.]．甘露醛合酶2'启动子在根和叶中活性活性，并且其活性通过伤害局部局部诱导[22.], making it an appropriate choice to mimic S-like RNase gene expression patterns.以前的研究表明，牛RNase预蛋白质在植物细胞中表现出正确的成熟，并且强烈增加全细胞外核糖核酸酶活性[12.]．选择并筛选十个耐霉素的独立初级转化体，展示了粗提取物中的核糖核酸酶活性显着较高。选择具有稳定的RNase水平的三种转化体进行进一步分析（纯合线ESR-3，ESR-8和ESR-10通过T2代的分离分析验证）。转基因的表达对植物生长和发育没有明显的影响。

巨细胞病毒的积累和疾病症状的发展

在接种后10天的对照植物（对照）观察到严重的马赛克症状和收缩，而在表达RNase A基因的ESR转基因植物中抑制了这些疾病症状（图。1）.

在Western印迹分析中，在对照植物的未征收的上叶中观察到病毒增殖，但在ESR植物的那些中，病毒水平非常低（图。2）.

在三个ESR株系的每个转化体中均稳定地观察到CMV增殖抑制。这些结果表明，RNase A基因的表达增加了CMV的抗性。

在ESR植物中获得的粗提取物和胎选级分的RNase活性比在对照植物中获得的那些（图。3.），进一步支持了酶的胞外定位。

植物细胞外蛋白与RNase活性

本研究以在质外体中表达异种RNase的转基因植物为模型，探讨植物胞外RNase在RNA基因组防御病毒中的潜在作用。下面是具有RNase活性的植物胞外蛋白的简要描述。

PR-4系列（13-16kDa）的蛋白质具有保守的C末端结构域BALWIN，有些具有保守的N-末端邻丁质结合结构域（I类PR-4蛋白）。大多数蛋白质具有N-末端信号肽，并且该系列的一些成员还含有引导它们进入液泡的C末端信号[23.]．PR-4.基因通常形成小的基因家族;例如，在水稻，五个基因布置在串联重复和特征在于不同的表达模式已被发现[24.]．

PR-4家族中不同基因的表达是由非常不同的刺激诱导的，包括病原体入侵、诱导子、组织损伤、茉莉酸甲酯、脱落酸、乙烯、臭氧、干旱、盐度、寒冷、紫外线和热休克(综述见[4.])。一些（但不是全部）PR-4蛋白在体外实验中表现出RNase活性和杀真菌性质。有趣的是，没有RNase活性的突变蛋白变体也缺乏杀真菌性质（例如，小麦PR4-4 [25.]，薜FAPR -4- [26.]， 和Theobroma可可PR-4B [27.])。Malus Domestica.PR-4表现出针对三个苹果病原真菌菌丝生长的单链RNA和显著抑制作用既核糖核酸酶活性特异性，Botryosphaeria dothidea那Valsa ceratosperma,Glomerella炭疽病[28.]．

PR-4蛋白的RNase活性对其杀菌功能很重要，但其潜在机制尚不清楚。RNase活性可以直接起到杀菌作用(通过核酸酶分子渗透到病原菌细胞后水解真菌的mRNA库)，或者通过在病原菌入侵位点诱导程序性细胞死亡(超敏反应)。RNase分子穿透病原真菌细胞的机制尚不清楚。有人认为，n端hevein样结构域与几丁质结合，并与致病真菌的凝集素相互作用，促进渗透到真菌细胞中，而c端RNase结构域可能负责细胞毒性作用[9.]．PR-4蛋白的RNase活性也可以参与PCD的诱导。例如，辣椒PR-4C蛋白是血浆膜局部化多肽，其具有核糖核酸酶和蛋白酶抑制剂活性，植物细胞死亡和防御信号所需的方法[10.]．

s样RNases在结构上与T2家族中的蛋白质相关[29.]．这些酶中的一些是本地化的（例如，RNAS RNS1的局部拟南芥，LE的Lycopersicon esculentum,不尼古利亚娜alata.，nk烟草和zrnase IIZinnia Elegans.）.s -样RNases被广泛认为参与植物器官衰老或损伤过程中磷酸盐的再活化以及对病原菌的防御机制。细胞外RNases RNS1, LE, Nk和ZRNase II的表达是创伤诱导的[30.-33.]．A. Thaliana.在局部（在组织伤口的部位）和系统性上诱导rnS1诱导病原体侵袭30.]．烟草s样RNase Nk的诱导反应黄瓜花叶病毒接种[33.]．

一些s样外体细胞核糖核酸酶也具有杀菌活性。烟草胞外RNase NE抑制生长Phytophthora parasitica.在体外以及当给药到在接种部位质外体作为。所述重组蛋白质的无酶活性的形式不具有杀真菌性能[7.]．胞外s样RNases杀菌活性的分子机制目前尚不清楚。据推测，RNase分子可以穿透真菌细胞壁，破坏细胞rna [7.]．

是否涉及抗病毒反应的细胞外rnases？

细胞外的S样RNases和PR-4蛋白没有全身测试作为抗病毒蛋白，并且在病毒感染或伤口后的诱导可以反映其多种功能或植物应激反应的复杂调节[34.]．据报道，过敏反应和局部细胞死亡与具有RNase和DNase活性的PR-4合成有关Capsicum Chinense.抗多巴病毒的植物[8.]．然而，需要澄清RNA水解活性和抗病毒保护的直接连接。我们生成转基因烟草表达异源牛胰腺RNase（RNase A）的植物。这些植物的特征在于较高的妊娠核糖核酸酶活性而不是对照植物的特征（图。3.）和RNase A可能在植物中没有特定的功能。较高的RNase水平导致增加对CMV的抗性，表明RNA水解酶在植物抗病毒反应中的作用。实际上，RNase A可能偶尔对CMV或CMV基因组RNA分子的特异性活性可以特别暴露和容易地消化。然而，我们以前的结果表明RNase A表达烟草植物对烟草病毒（TMV）的增加抗性[12.]．

CMV和TMV属于不同的家族，有不同的基因组组织和生命策略。TMV (Virgaviridae, Tobamovirus)有一个杆状衣壳，通过机械伤害进入细胞，这或打开质膜或允许胞饮作用[35.]．病毒赛迅速拆卸，细胞蛋白质合成机械引发了编码四种病毒蛋白的正感TMV基因组RNA的翻译。新合成的病毒颗粒从细胞到细胞通过Plasmodesmata移动并开始新的复制循环。最后，他们达到血管系统，以通过韧皮植物传播到感染植物的其他部分（详情，见[35.])。巨细胞病毒(Bromoviridae, Cucumovirus)的基因组由三种不同的正意义rna组成，封装在不同的球形颗粒中。它可以通过树液和蚜虫通过花柱传播(非持久性)的方式从一株植物传播到另一株。CMV的细胞间运动也通过胞间连丝进行，长距离运动则通过韧皮部进行(详情见[36.)或其他地方)。

存在若干可能的妊娠rnase介导的抗病毒效应机制。如果它暴露在病毒粒表面上，它们可以消化病毒基因组RNA。它们还可以将植物细胞与植物盒一起与病毒一起渗透，并在从病毒夫河释放后立即水解病毒基因组RNA分子。最后，病毒经常穿过伤口表面渗透植物细胞。如果妊娠rNases通过受损的细胞壁渗透细胞质，则它们可以通过mRNA和/或rRNA消化杀死细胞，从而降低病毒复制易感的细胞数量。通过机械伤害进行实验中的RNase-Capisting烟草转基因植物的接种（[12.];它模拟了自然界中TMV和CMV的传播机制。因此，细胞外s样RNases和PR-4蛋白可能也参与了植物对RNA基因组病毒的非特异性防御机制。有趣的是，荞麦叶片提取物中核糖核酸酶活性相对较高的品种对荞麦燃烧病毒也具有相对较高的抗性(rhabdoviridae.）[37.]．

众所周知，植物细胞外RNases在各种生理过程中起重要作用，包括对致病性真菌的抗性。在这里，我们证明了胰腺炎中的RNase活性增加与具有RNA基因组的高抗性抗性相关。因此，需要延长妊娠RNases的功能，以包括植物抗病毒防御作为基础或非宿主阻力机制的一部分[11.]．

还在表达双链特异性RNase基因的转基因植物中评估对一些病毒的抗性[38.]．对番茄花叶病毒、CMV、马铃薯Y病毒和番茄斑点枯萎病毒的抗性增强已在烟草、凤仙花和菊花中表达PAC1Ribonuclease基因来自Schizosaccharomyces Pombe[39.-41.]．虽然双链特异性RNase基因的表达可以诱导对一些病毒的抗性，但已经观察到不同程度的抗性，从仅仅延迟疾病症状的出现到几乎完全的保护。已经在表达细菌双链特异性RNase基因的烟草植株中评估了对一些病毒的抗性[42.，转基因植物能抵抗RNA基因组分裂的病毒的感染，但不能抵抗单个RNA基因组病毒的感染。

这些观察强调了细胞外rna酶基因作为作物改良的合适工具的应用。例如，与提高质外体核糖核酸酶活性水平相关的遗传标记可用于针对病毒和真菌的高抗性的标记导向育种[37.那43.]．编码植物或异源细胞外RNases的转基因可用于预期的GM-作物生产（[12.那44.]， 这张纸]。似乎是一种妊娠者“核糖核酸酶屏障”为渗透和增强非特异性阻力机制提供了病毒的侵蚀环境。

诱导抗CMV和TMV的结果本身是有意义的，因为这些病毒是学术和工业观点中最重要的五个最重要的病毒中[45.]．因此，使用细胞外单链特异性RNase基因的转化可能是植物工厂的有希望的策略，抗抗大类病毒。该技术应通过额外的对其他病毒和病毒源剂的耐药性评估来建立，使用双链特异性rNase基因在转化研究中报道抗性的抵抗力[41.那46.]．

本文已作为BMC植物生物体积16补充3,3,2016的一部分发布：来自BGRS \ SB-2016的所选文章：植物生物学。补充的完整内容可在线提供//www.cinefiend.com/articles/supplements/volume-16-supplement-3。

资金

这项工作和出版成本得到了科学研究（24248006）到TS和YK的补助金，而RSF授予16-16-04073至AVK。

作者的贡献

YK和AVK设计了研究并撰写了手稿。EAT和AVK进行了基因构建和原代转化体检测。ST和YK进行了病毒抗性评价的实验部分。所有作者阅读并批准了手稿。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

同意出版物

不适用。

伦理批准和同意参与

不适用。

从属关系

1. 东北大学农业科学研究生院，仙台981-8555，日本

   彻平菅原义则与金山

2. 细胞学和遗传学研究所，SB RAS，Novosibirsk，630090，俄罗斯

   Ekaterina A. Trifonova＆Alex V. Kochetov

3. 新西伯利亚国立大学，新西伯利亚630090，俄罗斯

   亚历克斯·五Kochetov

相应的作者

对应于亚历克斯·五Kochetov或金山义。

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