RNA-SEQ鉴定核基因控制大麦叶绿素合成的核基因gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

植物白化病的特点是缺乏叶绿素，导致光合作用障碍，植物发育异常和过早死亡。这些异常在种间杂交和组织培养实验中经常遇到。分析叶绿素完全缺失或部分缺失的白化突变体表型，可以揭示白化的遗传决定因素和分子机制。在这里，我们报告了大麦(gydF4y2BaHordeum Vulgare.gydF4y2Ba近等基因系，其中一个为突变等位基因载体gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba白化外稃和果皮表型基因(第1行:BwgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

1221个基因组片段在第i行:Bw之间的表达水平有统计学意义的变化gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba和鲍曼，有148个片段，表达水平增加I：BWgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba， 1073个基因组片段，包括42个质体操纵子，在第i行:Bw中表达水平降低gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba．我们在I：BW中检测到具有较高和较低表达水平的基因之间的功能异化gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线。I：BW中表达水平较低的基因gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线大多数与光合作用和叶绿素合成相关，而具有更高表达水平的基因在功能上与囊泡运输有关。差异表达的基因显示出涉及几种代谢途径;对于Calvin-Benson-Bassham循环，观察到这些基因的最大部分。最后，gydF4y2Ba德诺维gydF4y2Ba转录组的装配包含几个转录本，在当前没有注释gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba基因组的版本。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的结果提供了有关基因的新信息，可参与白血岭和果皮表型形成。它们证明了这种生理过程中核和叶绿体基因组之间的相互作用。gydF4y2Ba

叶绿素是植物色素中最丰富、最重要的一类，在光合作用过程中起着核心作用，是植物的主要能量来源，也是地球大气中氧气的主要来源。在真核植物和藻类细胞中，叶绿素位于叶绿体中。叶绿体是一种器官，像线粒体一样，包含自己的基因组，有时被称为“质体”[gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba］．然而，叶绿体强烈依赖于植物细胞的核基因组。在血管植物中，塑料仅含有约50个蛋白质编码基因，涉及叶绿素合成，光合作用和一些代谢过程，以及TRNA和RRNA基因[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，而预测靶向叶绿体的量核编码蛋白的蛋白质高达2500-3500（如gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba；[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba那gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba])。在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba，从1400到1500个蓝藻蛋白已经被识别，其中大约一半是针对叶绿体[gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba］．有人说大约4500人gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba然而，从蓝藻基因组进化而来的基因中，预计只有大约1300个基因的产物是针对叶绿体的[gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

叶绿体基因组的转录由两种类型的RNA聚合酶提供——核编码质体RNA聚合酶(NEP)和质体编码质体RNA聚合酶(PEP)。PEP是细菌设计的一种RNA聚合酶，它使用sigma因子进行转录起始，该因子是核编码的[gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba］．叶绿体基因可分为三类:第一类基因有启动子，只被PEP识别;第二类基因有启动子，两种酶都能识别;第三类基因只被NEP转录[gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba］．大多数质体中的基因都有启动子，可以被两种类型的聚合酶识别[gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

叶绿体基因的控制主要是转录后的。它是由核编码蛋白调控的，在某些情况下，单个核编码蛋白是控制单个叶绿体编码基因的表达所需要的[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

上述所有表明，需要对血液形成和运作的塑料和核基因组的复杂协调。这种协调是通过从核向叶绿体 - 和逆行信号传导 - 从叶绿体到核[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．叶绿素合成途径的中间体，即原子卟啉IX，用作信号分子，并从叶绿体输送到核[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．另一方面，许多作者不同意原因卟啉IX作为信号分子的作用[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba那gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．由此可见，核到叶绿体和叶绿体到核的信号传导机制尚不清楚。gydF4y2Ba

虽然已经描述了许多具有完全或部分叶绿素缺乏的突变表型，但对这种表型形成的基因大部分是未知的。大麦(gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Bal .)gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba染色体基因(3 h;[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba确定白化病外稃和果皮的基因序列尚未确定，其靶标或调控基因gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba仍然未知。近代线（NIL）是通过转录组织，蛋白质组学或代谢组种方法分离基因的适当模型，以通过转录组，蛋白质组学或代谢组学方法（在[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba])。大麦基因组参考序列的可用性[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]有助于应用基于wgs的方法(如RNA-seq)来研究表型变异的遗传网络。RNA-seq方法已经成功地用于揭示野生大麦驯化和分布的历史[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，研究大麦水通道基因家族[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]或创建大麦的SNP地图[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在目前的研究中，RNA-SEQ被利用用于使用近代的近似源性线鉴定参与组织特异性分析症的基因gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba基因等位状态。gydF4y2Ba

Alm近等基因系表型特征及多效性gydF4y2Ba

我:BwgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba近等基因系以白化外稃(基部和中部)为特征，外稃上部和芒为绿色。鲍曼外稃和芒呈绿色(图。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．在Bowman的中央部分观察到叶绿素荧光，而在I：BW的中心部分中不存在gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba引理(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)．在Bowman的引理 - AWN过渡点也观察到叶绿素荧光（图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)．我:BwgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba，分析白色和绿色区域之间过渡点的荧光图案(图。gydF4y2Ba1 fgydF4y2Ba)检测到细胞中含有荧光叶绿体和缺乏荧光叶绿体的变化(图。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)．当向基方向移动时，检测到的荧光细胞数量减少至消失(图。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)．AWNS的外观和荧光图案（以及中间杆和叶片等植物的其他类似颜色的部分）没有揭示Bowman和I：BW之间的差异gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

热情效果gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba在耳廓(和邻近的叶片区域)、茎节(和邻近的茎区域;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)和i:Bw第一片叶子的鞘gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线。在鲍曼，植物的所有这些部分都是绿色的。沿着茎表面，两条线具有具有明亮叶绿素荧光的绿链（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，但在i:BwgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba节点邻近区域这些线平坦，并检测到荧光线碎片成松散间隔的岛屿(图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba那gydF4y2BafgydF4y2Ba)．Bowman和i:Bw在该区域含有荧光叶绿体的细胞群的形状是不同的gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba．鲍曼植物细胞呈锉状排列(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．我:BwgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba荧光细胞形态不规则，未见细胞档案(图)。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

就这样gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba基因导致外稃、果皮、邻近叶片区域的叶耳、邻近茎节和第1叶鞘的叶绿体群体消失。含有荧光叶绿体的细胞和没有荧光信号的细胞在白色和绿色区域之间的过渡区模式的变化是明显的(图)。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．I：BW之间的差异gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba鲍曼在细胞排列中(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba那gydF4y2BafgydF4y2Ba)表明,gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba基因除了对叶绿体的影响外，还改变了果皮和耳廓中含有活性叶绿体的细胞的形态。gydF4y2Ba

qPCR基因差异表达验证gydF4y2Ba

基于QRT-PCR的两种基因转录的QRT-PCR的转录评估在图1中总结。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．第一个是编码III型光收获复合体II叶绿素a/b结合前体蛋白的MLOC_17002基因。根据RNA-seq数据估计其表达水平在i:Bw中降低gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba超过45倍(通过Benjamini-Hochberg程序纠正gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.002）。第二种是XLOC_012413转录物，即根据基因本体分析，在功能上与囊泡输送相连。其表达水平从RNA-SEQ数据估计I：BWgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba植物超过1000倍(更正)gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.002)。根据RT-PCR数据，III型LHCII CAB前体蛋白基因转录本在Bowman中丰富，在白化植物中显著减少(18.5倍)(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．XLOC_012413转录本在Bowman中检测较差，但在i:Bw小穗中表达量显著增加(121 ford)gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba植物(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．RT-PCR估计的这两个基因表达水平的差异是gydF4y2BapgydF4y2Ba = 0.033 for MLOC_17002 gene andpgydF4y2Ba= 0.008的XLOC_012413基因根据gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba

库质量评估gydF4y2Ba

28481151六个汇集库中的短读被制作为原始测序数据。检查每个文库的质量控制，修剪适配器序列，并除去长度不足或过低的平均质量读数，导致丢弃六个文库中的五种读数的7.4％，并丢弃了40％序列的7.4％至13.4％图书馆鲍曼（2）（表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

接下来，我们对六个库的映射进行了分析，以估计Mismatch参数的最佳值。映射读取到参考基因组gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba使用TopHat2工具进行了10次，如方法部分所述，允许的不匹配数量从2个增加到20个。每个转录基因组片段的FPKM计数结果列在附加文件中gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba．我们观察到在每个文库中映射到基因组的片段百分比增加，增加了不匹配数（图。gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba)．在6个库中的5个库中，映射读的比例从23%到38%(允许2个不匹配)到64%到79%(允许20个不匹配);对于Bowman(1)库，在有2个和20个不匹配的情况下，对齐百分比从21%变化到39%(图1)。gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

此外，我们监测了6个文库基因组覆盖质量的4个特征(见方法部分)与错配数的变化。这些值与它们的最大值的比率在十个TopHat2对齐显示在图中。gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba．这个图（图。gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba)证明了映射读的数量会随着允许的不匹配数量的增加而增加。然而，当mismatch值大于12时，匹配的读数将饱和其最大值。同样,NgydF4y2Ba_{uncovgydF4y2Ba}随着允许的不匹配数量的增加，和NgydF4y2Ba_{孤子gydF4y2Ba}与允许有两个或四个不匹配的对齐相比，允许有六个或更多不匹配的对齐减少。这三个参数的组合被认为是最优的校准18允许不匹配。gydF4y2Ba

对齐与星节目的参考基因组对齐导致成功映射72到83％的五个图书馆的读取，其中六个图书馆，鲍曼（1）库只有46％的映射读取（表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在考试考虑参数后，用18℃的映射进行进一步分析。从所有六个图书馆映射到参考基因组的总共1490万读数。袖扣管道鉴定了33537个基因组片段，这些基因组片段由至少一个文库的短读数和/或在当前基因组组件中注释。gydF4y2Ba

接下来，我们比较了gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba从每个图书馆阅读抄本。我们生成了24158个基因组区域的转录本覆盖率的计数表gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba使用cuffnorm工具进行基因组注释，其中有18820条通过了过滤标准。6个库按区域覆盖相似度聚类结果如图所示。gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba．树图展示了覆盖范围的估计gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba基因与两种对应于两个对比基因型的大簇相对应对对准方法和样品复制。图表的详细分析表明，由Tophat2和Star Tools执行的读数计数估计与相同的复制相同的复制是近于不同复制的估计。gydF4y2Ba

转录本丰度分析gydF4y2Ba

cufflinks pipeline检测到的1786个基因组片段(占转录基因组片段总数的5%)在|日志下表达水平发生了变化gydF4y2Ba_2gydF4y2BaFC | > 2。表达水平变化大于4倍的转录片段和基因列表见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．一千二百八十四片碎片在I：BW中具有较低水平的表达gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba，而在i:Bw中有502个片段表达量较高gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba与鲍曼相比。在这些片段中，有1140个基因在目前的大麦基因组中被注释。其中804个基因在i:Bw中表达水平下降gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba，在i:Bw中有336个基因表达水平增加gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba．表达水平变化的基因列表含有149个具有已知产品的基因，其中132具有I：BW的表达率降低gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba17 I中有更高的表达率：BWgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba与鲍曼相比的线。在图2中示出了基因组片段和具有表达水平差异的基因的分布。gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba．i:Bw中功能已知且表达水平较高的基因gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba列于表格gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba并在下面详细描述。gydF4y2Ba

基因MLOC_33278和MLOC_74627分别编码DNA螺旋酶和胱丹蛋白酶的推定同源物。gydF4y2Ba

MLOC_65942基因编码铁调节溶质载体(SLC)家族蛋白。大多数SLC转运体是二级主动转运体，如交换剂、同向转运体和反转运体，其转运由各种能量耦合机制驱动[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

MLOC_66447基因编码果胶酯酶蛋白。这种酶催化果胶的去甲基化。果胶是陆地植物细胞壁的组成部分，在植物细胞中果胶酯酶是与细胞壁相关的一种普遍存在的酶[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．已知参与多种方法，包括花粉管生长和花粉四分之三分离[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．MLOC_22576基因编码一个果胶甲基酯酶抑制剂超家族蛋白。gydF4y2Ba

基因MLOC_5895编码平台/ LH2家族的蛋白质。它是含有平台（聚霉蛋白-1，脂氧合酶，α-毒素）或LH2（脂氧合酶同源性）结构域的蛋白质系列蛋白质gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．这个域绑定了CagydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}离子(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Bowman中最丰富的转录基因是编码Rubisco小链条和核糖体S12蛋白和编码Rubisco小链子的核基因的叶绿体基因（表gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba)．这些基因在I：BW中具有较低水平的表达gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba．在Bowman基因中高表达的基因还包括蔗糖合酶、微管蛋白α-3链、s -腺苷亚甲硫氨酸脱羧酶原酶、苯丙氨酸解氨酶、ATP合酶β亚基、翻译控制的肿瘤蛋白同源物和两个非特征蛋白。这些基因在i:Bw中也有非常高的表达水平gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线（表gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

微分表达式识别gydF4y2Ba

我们使用了两种工具来识别I：BW之间的差异表达基因gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba和鲍曼线。使用Cufflinks管道，我们检测到了902个差异表达的基因组片段(见方法)，其中119个片段在i:Bw中表达水平较高gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba783在鲍曼系植物中表达量较高。通过对R实现EdgeR包，我们检测到i:Bw中有79个和802个表达水平较高和较低的片段gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba植物,分别(无花果。gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba)．在第i行:Bw中，有512个片段表达量增加，50个片段表达量减少gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba两种工具都能检测到。gydF4y2Ba

因此，显示1221个基因组片段以具有差异表达（|gydF4y2Ba_2gydF4y2BaFC | > 1,pgydF4y2Ba< 0.05)，约占全部转录片段的3.6%。其中i:Bw表达水平较低的基因组片段有1073个gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba．其中694个片段是在大麦基因组当前装配中注释的基因，115个片段有已知的蛋白质产物。148个基因组片段差异表达，在i:Bw中表达水平较高gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba．这些片段中的67个是基因注释gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba基因组组装。其中4个基因已知蛋白质产品 - 基因MLOC_61063，其编码3-酮酰基-COA合酶基因MLOC_63089，其编码浅酰胺合成酶，基因MLOC_51356编码富含亮氨酸的受体样蛋白激酶家族蛋白，以及编码非特异性脂质转移的基因MLOC_3822蛋白质。数字gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba在I线I：BW中显示一组具有较高和更低水平的基因之间的差异：BWgydF4y2BaAlm。gydF4y2Ba

此外，cufflinks pipeline鉴定出571个基因组片段具有差异亚型表达(见方法)gydF4y2BapgydF4y2Ba-通过Benjamini-Hochberg程序校正的值小于0.05。在这些片段中，282个是在当前大麦基因组中注释的基因。其中83个基因具有已知的功能。差异表达亚型基因包括编码四肽样超家族蛋白的MLOC_50938、编码类囊体罗丹样蛋白的MLOC_60122、编码非特异性脂质转移蛋白的MLOC_3822、编码叶绿素a-b结合蛋白的MLOC_945和MLOC_20487。该列表还包括质体基因组上的16个片段。差异亚型表达的基因组片段列于补充表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

叶绿体基因表达分析gydF4y2Ba

在袖扣文库读取映射的结果中观察到叶绿体基因组片段覆盖的不同。根据获得的结果，有34个基因组片段在两个株系中表达量为零。在这些片段中有23个tRNA基因，编码两个核糖体蛋白、光系统II蛋白Z、两个rna聚合酶亚基、4个细胞色素蛋白、nadh - plasoquinon氧化还原酶亚基6和基因gydF4y2BaYCF15gydF4y2Ba编码假想的叶绿体蛋白质。在Bowman系中表达的15个基因组片段在i:Bw中表达量为零gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线。在这些片段是编码三个照相I蛋白的基因，两个电极系统II蛋白，ATP合酶CF0亚基IV，四个NADH-塑性醌氧化还原酶亚基，叶绿体包膜膜蛋白，照相我的光系统I组装蛋白YCF4，5S核糖体RNA的基因和三种基因TRNA。额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba列出表达叶绿体基因组片段，各自的FPKM值I：BWgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba图书馆和鲍曼图书馆和日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba表达式折叠变化的值。gydF4y2Ba

在i:Bw中所有非零覆盖的叶绿体基因组片段gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba在鲍曼线有更高的覆盖级别。数字gydF4y2Ba10gydF4y2Baillustrates a number of operons with one of four levels of expression change: ‘Zero transcription’ for operons with no transcription observed in both studied lines, ‘log(FC) < 2’ for operons with less than four-folds change of transcription level, ‘log(FC) > 2’ for operons with change in transcription level from four-folds to 368-fold, and ‘log(FC) > 10’ for operons with zero transcription in line i:BwAlmgydF4y2Ba以及Bowman基因中足够高的转录水平gydF4y2Ba

含有17个基因的体积基因组片段在I：BW中的所有塑性片段水平中具有最高的覆盖率gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线。在这17个基因中，13个是核糖体蛋白的基因。其他四个基因编码光系统II蛋白N、翻译起始因子1、rna聚合酶α -亚基和nadh -质体醌氧化还原酶亚基2。在i:Bw中有高覆盖率的其他片段的列表gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线包括四种核糖体RNA编码基因，三个光系统II蛋白基因，Rubisco大链基因，ATP合酶CF0亚基I和III基因，ATP合酶CF1α亚基基因和核糖体蛋白S12基因。gydF4y2Ba

差异表达基因的基因本体论分析gydF4y2Ba

我们分析了推定蛋白质产品的分布三类：生物学功能，分子功能和细胞室定位。归因于鲍曼中具有较高水平表达水平的基因的分子功能，生物过程和细胞室局部化相关的最显着呈现的基因本地化术语gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

对于I：BW具有更高表达水平的基因gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba只识别了与细胞定位相关的GO术语。65个基因中有19个与以下术语相关:' vesicle '， ' membrane bound vesicle '， ' cytoplasmic vesicle '， ' cytoplasmic membrane bound vesicle 'gydF4y2BapgydF4y2Ba = 0.00128 for each of the terms.

附加文件gydF4y2Ba4.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5.gydF4y2Ba显示在i:Bw中表达水平较低的基因与生物过程和细胞成分相关的GO术语gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线,分别。额外的文件gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba说明与具有更高表达水平的蜂窝分量相关联的GO术语I：BWgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

差异表达基因的途径分析gydF4y2Ba

分析了694个表达水平发生变化的基因参与代谢途径的情况。PlantCyc数据库的“组学数据图谱”工具识别出了132个这样的基因。17条代谢途径中至少有2个基因表达水平发生显著变化。表中列出了5个不同表达水平基因数量最多的途径gydF4y2Ba6.gydF4y2Ba．其他途径是：蔗糖生物合成I（从光合作用），三酰基甘油降解，NAD / NADH磷酸化和去磷酸化，同态肌酐降解，有氧呼吸III（替代氧化酶途径），葡糖生成I，糖酵解I（来自葡萄糖6-磷酸），CDP-二酰基甘油生物合成I，三酰基甘油生物合成，磷酸盐采集，叶绿素α生物合成I（有氧，轻依赖）。gydF4y2Ba

图中显示了包含最多差异表达基因的“Calvin-Benson-Bassham圈”路径。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba．它与“蔗糖生物合成I(来自光合作用)”途径有关，该途径有四个不同表达水平的基因。MLOC_65956基因编码一个未鉴定的蛋白，差异表达未被证实。该通路中包含的其他三个基因分别是MLOC_62317、MLOC_19670和MLOC_76055，它们也包含在Calvin-Benson-Bassham周期中，并已被证实存在差异表达。gydF4y2Ba

卡尔文-本森-巴沙姆周期中包含差异表达基因数量最多的这一步是限速的[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba] CO.gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba固定，以d -核酮糖-1,5-二磷酸羧化的形式发生。这一步涉及二磷酸核酮糖羧化酶。它由大大小小的亚基组成，每一个亚基都存在于一个功能性多肽的八个拷贝中。大亚基包含酶的活性位点，是叶绿体编码的。在植物中，核基因的一个家族gydF4y2Ba红细胞表面gydF4y2Ba编码可能参与酶催化活性调节的不同形式的小链亚基[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．研究还表明，在缺乏小亚基蛋白的情况下，大亚基的翻译水平受到抑制[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在本研究中，编码rubisco大链的基因MLOC_61558和编码三个rubisco小链亚基的基因MLOC_44795、MLOC_21811、MLOC_64679在i:Bw中的表达水平较低gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba与鲍曼相比。用EdgeR工具检测MLOC_61558和MLOC_21811基因，用EdgeR和cuffdiff工具检测MLOC_64679和MLOC_44795基因的差异表达。gydF4y2Ba

该途径的下一步包括编码磷酸甘油酸激酶(PGK)的基因MLOC_76055, PGK是一种催化3-磷酸- d -甘油酸磷酸化的酶。它存在于所有的生物体内，并具有高度保守的结构。这种酶起单体的作用。在植物中，PGK据报道有两种同工酶，一种是胞质酶，一种是叶绿体酶，由两个不同的核基因编码，相互独立表达[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Calvin-Benson-Bassham循环的下一步是将1,3-双磷基醇的羧基还原为醛。它涉及酶甘氨醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。在植物中，GAPDH在胞嘧啶中作为异质溶解剂和不同形式的叶绿体中存在[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．该酶的亚基由核基因编码[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．PlantCyc数据库显示，该步骤包含两个基因，其中一个是MLOC_44511基因，该基因在所研究的大麦品系间表达差异较大。该基因的蛋白产物在大麦基因组装配版本1v28中称为“预测蛋白/未特征蛋白”。gydF4y2Ba

差异表达的基因MLOC_62317和MLOC_19670包括在核糖丝的再生中。该阶段包括一系列反应和各种酶，其中包括果糖-1,6-双磷脂酶，其也参与葡糖生成和蔗糖生物合成。gydF4y2Ba

最后，编码磷酸核酮激酶蛋白的MLOC_58999基因参与了d -核酮糖-5-磷酸的磷酸化。这一阶段的产物是d -1,5-二磷酸核酮糖，它后来被二磷酸核酮糖isco用作底物。然而，MLOC_58999基因的差异表达并没有被cuffdiff或EdgeR工具证实。gydF4y2Ba

此外，对几种植物色素生物合成途径的分析表明，它们都含有一些差异表达基因。' pathway of anthocyanin biosynthesis (from delphinidin 3-O-glucoside) '和' Superpathway of anthocyanin biosynthesis (from pelargonidin 3-O-glucoside) '都有三个大麦基因在PlantCyc数据库中注释gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba．没有任何基因在特定意义水平下表现出差异表达。途径'叶绿素循环'含有五个基因，其中三个具有显着的表达水平变化（图。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)．途径'Zeaxanthin，Antheraxanthin和violaxanthin互联网有八个注释基因;其中三个具有显着的表达水平变化，一个具有差异同种型表达（图。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)．在这两种途径中包含的所有差异表达基因具有较低的表达水平：BWgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线。表格gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba显示上述途径中包括的注释大麦基因列表。gydF4y2Ba

从头转录组组装gydF4y2Ba

德诺维gydF4y2Ba进行转录组组装，以验证转录组数据中是否存在新的转录本。在组装分析之前，我们合并了来自同一基因型的不同样本的数据。表中提供了结果序列集的统计信息gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba．导致转录物的对准gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba利用BLAST包的megablast工具参考基因组。iBw组合中有565个转录本和605个转录本gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba分别为任何参考基因组序列显示出没有显着同源性的显着同源性。gydF4y2Ba

在细节中检查了对大麦基因组没有显着同源的转录物。他们被映射到了gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba以去除可能的污染物。来自i:Bw的29份成绩单gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba鲍曼大会的组装和28名转录物展示了同源性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba基因组序列。将这些转录物从进一步分析中除去。在没有的情况下对齐组装的转录物之后gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba与CDS序列相似gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba和gydF4y2BaBrachypodium distachiongydF4y2Ba发现了若干同源序列。对齐,gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2BaCDS序列在任何转录物中都没有显示出同源性。gydF4y2Ba

因此，来自i:Bw的564份转录本gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba与604份Bowman组装转录本无显著同源性gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba基因组（参见其他文件gydF4y2Ba7.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8.gydF4y2Ba)．其中，320份转录本对两种组合都是共同的(表gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

差异表达分析gydF4y2Ba

将1221基因组片段区分为具有差异表达，而基于其RPKM值，1786基因组片段的表达水平具有大于四倍的表达水平变化。在植物的研究中，差异表达基因的比较转录组数量通常呈现成千上万：3096 [gydF4y2Ba32gydF4y2Ba), 4811gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]，5944 [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．此外，据称，在黑暗和光线中不低于20％的植物基因表达差异[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba那gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．因此，我们认为，我们确定的一些差异表达的基因不应该被认为是夸大的。同时，转录水平的变化不一定与翻译水平的变化相关[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，并不是所有观察到的基因转录水平的变化都可能与两种大麦株系之间的表型变化在功能上相关。gydF4y2Ba

5个编码不同五磷酸重复蛋白(pentatricoptide repeat-containing proteins, PPR)的基因表达水平发生变化，其中4个基因在第i行:Bw表达水平较低gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba在这一行有更高层次的表达。PPR蛋白是rna结合蛋白，在陆生植物中尤其丰富[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．植物细胞中大多数PPR蛋白为线粒体或叶绿体，其中它们结合RNA并影响基因表达[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．发现了400多个PPR基因gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba基因组(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba而在大麦基因组中注释的PPR基因只有10个，这表明实际存在的在Bowman和i:Bw之间表达差异的PPR基因数量gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线条更大。gydF4y2Ba

基因本体学分析显示，在I：BW中表达较低的基因：BWgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba主要与卟啉色素生物合成有关。由于叶绿素a和b是卟啉的化学衍生物，这些基因很可能与叶绿素的合成间接相关。第i行:Bw表达水平较高的基因gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba在功能上与胞质囊泡相关。尽管TIC和TOC膜复合物是蛋白质进入质体的主要途径[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，众所周知的尿布传输在这个过程中发挥作用[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

途径分析表明，差异表达的基因参与了几种代谢途径，包括在叶绿体中发生的光合作用光反应和Calvin-Benson-Bassham循环。几种黄嘌呤衍生物的互联是在叶绿体膜上发生的另一个生物过程[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．不同形式的黄嘌呤包括在叶绿体的光收集复合物中，并参与非光合猝灭过程，保护细胞免受氧化应激[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．该途径中包含的基因表达水平的降低与叶绿体功能相关基因表达水平的普遍降低是一致的。同样，在“叶绿素循环”途径中所观察到的较低的基因表达水平与研究器官中叶绿素含量的降低是一致的。gydF4y2Ba

在叶片和其他器官中有白化细胞斑块的杂色突变体，已经对缺乏叶绿素的细胞的质体组成进行了研究。研究表明，在许多杂色突变体中，叶绿体缺乏类囊体而积聚囊泡[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba那gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Bowman和I：BW的塑性基因表达模式gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba基因型gydF4y2Ba

在两条大麦线之间观察到大多数塑性基因组片段的转录物丰度的变化（SET。文件。2）。我们没有观察血液塑性基因组片段，其在I线中的含量：BWgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba与鲍曼相比增加了。在i中唯一没有改变其丰度的基因:BwgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba/ Bowman是大麦线上覆盖的那些。为大多数转录的体积基因组片段（47个转录的基因组片段中的20个）观察到的覆盖的变化是四倍至16倍（2 2gydF4y2BaFc <4）。表达水平变化的操纵子中的大多数（55个中）基因是蛋白质编码基因，主要编码核糖体蛋白（6基因）和光系统I和II蛋白（16基因）（图。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)．根据显微分析的结果，研究器官中的许多细胞缺乏叶绿素。然而，观察到的一些质体基因组片段的表达表明这些细胞仍然含有质体，无论这些质体是不含叶绿素的异常叶绿体还是其他类型的无色质体，推测为原质体或黄化质体。与此同时，这些质体在鲍曼植物细胞中的数量和/或转录活性都不如叶绿体。这一建议可以解释第i行:Bw中质体基因组片段覆盖率的总体下降gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

虽然大多数质体基因组片段的转录丰度下降了4到16倍，这可以归因于质体数量和/或一般转录活性的下降，但一些基因组片段的转录下降更为突然。三个基因组片段的转录本丰度在i:Bw中降低了约32倍gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba而鲍曼。其中一个片段含有基因gydF4y2BaPSBCgydF4y2Ba和gydF4y2BaPSBD.gydF4y2Ba编码照相系统II的亚基，其他片段含有TRNA基因，第三个含有基因gydF4y2BaPSAC.gydF4y2Ba编码照相我的亚基和基因gydF4y2Bande.gydF4y2Ba和gydF4y2BangydF4y2Ba编码Nadh-PlastoquinoneOxyDoxyduclease亚基。基因gydF4y2Barps14gydF4y2Ba编码一种核糖体蛋白的转录本减少了87倍。编码4.5S、16S和23S核糖体rna的基因的转录本丰度从155倍下降到368倍。gydF4y2Ba

最后，在Bowman中表达的15个基因组片段在i:Bw中覆盖率为零gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba．该列表包含多种编码光系统I和II亚基的基因，NADH-塑料喹啉氧基酶亚基，TRNA基因，5S rRNA基因和编码ATP合酶CF0亚基IV的基因。gydF4y2Ba

结果表明，大多数塑性基因gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba属于II型，即，只有PEP和NEP的启动子，只有gydF4y2BaRPOB.gydF4y2Ba由NEP单独转录的基因[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．考虑到这一点，我们看起来令人惊讶的是，我们没有观察到的表情gydF4y2BaRPOB.gydF4y2Ba和gydF4y2Barpoc2.gydF4y2Ba两条线的基因。编码Plastid TrNA的23个基因也不在榫翅内表达。同时，塑性rRNA编码基因在两条线中具有高水平的转录物丰度，除了5S核糖体RNA基因，表明I：BW中没有表达gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线路在鲍曼线转录活跃的同时。gydF4y2Ba

黄体是一种缺乏叶绿素且无色的质体。叶面无光时形成黄化质体。通过比较叶绿体和黄体蛋白质组，发现黄体中存在的一些蛋白质并不存在于叶绿体中[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．即，据信，蛋白氯化物还原酶是Etioplast蛋白质组的不可缺少的组分。基因gydF4y2BaporAgydF4y2Ba在i:Bw中，该酶的编码都具有转录活性gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba和鲍曼。但是，其表达主要在翻译阶段进行控制[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．NAD（P）H脱氢酶亚基I和J也存在于牙型血片中[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．与此同时，在我：BWgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba没有基因的成绩单gydF4y2BaNDHI.gydF4y2Ba和gydF4y2Bandhj.gydF4y2Ba在Bowman中发现了编码两个各自亚基的基因，而这两个基因的转录水平都很低。gydF4y2Ba

然而，值得注意的是，改变某些基因的转录水平可能不是白化病的主要原因[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．植物的白化病可能是由于各种原因，也包括自发的染色体和ptDNA重排，主要是单个或多个DNA片段的缺失。大多数缺失发生在大的单拷贝区域，这是整个质体基因组中最不稳定的区域。该区域主要包含负责光合作用的基因，编码光系统I和光系统II蛋白的基因。因此，需要进一步研究以阐明in i:Bw的可能分子机制gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba突变体在细节。gydF4y2Ba

德诺维gydF4y2Ba转录组的组装gydF4y2Ba

三个gydF4y2Ba德诺维gydF4y2Ba(2)三个Bowman库组合和(3)三个i:Bw库组合gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba图书馆在一起。结果，所有六个合并的文库的组装被认为是无效的，因为与其他两个组件相比，该组件中的转录物和N50值的总长度较差。因此，从进一步的分析中取出所有六个汇集库的组装。gydF4y2Ba

超过99%的转录本组装成功地映射到当前gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba基因组组装。此外，两个组件的N50略高于其他作品中的报告gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba转录组组装(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba那gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．这说明组装的质量是令人满意的。相对较少的转录本显示与大麦基因组没有同源性，以及在比对过程中没有映射到基因组的短读的低百分比，指出了目前的版本gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba基因组，尽管仍在发展中，是足够的深刻。gydF4y2Ba

用于序列gydF4y2Ba德诺维gydF4y2Ba如果装配与其他植物的基因组序列没有同源性，且在其他装配中没有重复，则可以假定它们可能是装配错误。另一方面，据报道[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba那gydF4y2Ba54gydF4y2Ba其他植物的转录组有一小部分独特的序列，与其他植物的基因组不一致。需要对组装的转录本进行更彻底的调查，以区分组装错误和独特的转录本。事实是没有新的转录本与A一致gydF4y2Ba．芥gydF4y2BaCDS表明，新的转录本至少包含特定于gydF4y2Ba禾本科gydF4y2Ba，甚至可能更窄的群体。gydF4y2Ba

尽管控制白化外稃和果皮表型形成的遗传机制的特性尚不清楚，需要进一步研究，但这一过程的几个方面已被阐明。尽管缺乏叶绿素和适当形成和功能的叶绿体，白化细胞保留转录活性质体。而在i:Bw中表达水平较低的基因gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线大多数与叶绿素合成和光合作用相关，I：BW中具有较高表达水平的基因gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba线在功能上与囊泡形成相关。囊泡在将蛋白质传送到叶绿体中的基本作用，并且在同一时间内囊泡以不同类型的非光合作用体积累积，即铸型棒和脑血糖。此外，已知在杂色的叶片中，缺乏细胞含有叶绿体，也含有积聚囊泡的叶绿体。gydF4y2Ba

因此，抑制白化细胞的质体可能变异为原质体、黄化质体或不含叶绿素的受损叶绿体。基因表达水平与黄体蛋白组成关系不大。为了明确白化细胞中的质体数量和结构，还需要进一步的研究。gydF4y2Ba

尽管是最先进的方法，但不应实施RNA-SEQ和转录组分析，而不从其他调查技术辅助，例如显微镜和蛋白质组学和代谢组分析。为了在这种特定情况下揭示部分白化性表型形成的机制需要进一步检查，即微观分析，以澄清白化细胞中的体积数，结构和位置。由于大多数塑性基因的表达对转录后阶段进行调节，因此蛋白质组学分析可以熟悉白化细胞的实际蛋白质含量，并在塑性基因转录和实际蛋白质产品的实际水平之间进行脱光。gydF4y2Ba

最后，怀疑，由于在子组织期间从脑血管卟啉过渡到叶绿体，因此形成器官的转录组分析不太可能揭示表型形成的遗传背景。为了检测白血岭后面的遗传机制和Pericarp表型形成，应检查和比较鲍曼线植物植物叶绿体的叶片发育的早期阶段。gydF4y2Ba

植物材料，DNA和RNA提取，基因分型gydF4y2Ba

H.Vulgare.gydF4y2Ba品种Bowman和近等基因系i:BwgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba（NGB20419）在Bowman背景开发但携带gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba在14H光周期下的细胞学和遗传学Sb Ras研究所的共享中心“人工培养实验室”的水培温室中生长基因。植物是基因分型并用于RNA-SEQ分析。使用[中描述的方法从叶片材料中提取DNA。gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．扩增大麦3H微卫星位点的引物gydF4y2BaXgbms0022gydF4y2Ba那gydF4y2BaXgbms0046gydF4y2Ba那gydF4y2BaXgbms0048gydF4y2Ba那gydF4y2BaXgbms0050gydF4y2Ba那gydF4y2BaXGBMS0085.gydF4y2Ba那gydF4y2BaXGBMS0102gydF4y2Ba那gydF4y2BaXGBMS0149.gydF4y2Ba那gydF4y2BaXgbms0212gydF4y2Ba那gydF4y2BaXebmac541, Xbmag225gydF4y2Ba那gydF4y2BaXBMAG877.gydF4y2Ba[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba那gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]用于根据[的PCR）进行gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．在分离通过5％琼脂糖（Actgene，Inc.，Piscataway，NJ，USA）凝胶分离后可视化所得的扩增子。NGB20419 NIL染色体中的供体片段的方案呈现额外的文件gydF4y2Ba9.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

表型特征gydF4y2Ba

H.Vulgare.gydF4y2Ba利用透射光和叶绿素荧光显微镜，对鲍曼品种和近等基因系NGB20419进行了比较。利用激光扫描系统LSM 780 NLO (ZEISS, Germany)获得不同植物器官的叶绿素荧光图像。新鲜分离的植物碎片的样品被放置在一个玻璃片和盖玻片。利用二极管激光器的405 nm射线线激发获得荧光发射光谱，在550 ~ 700 nm范围内检测发射的荧光。利用ZEN软件(ZEISS, Germany)进行最大强度投影处理，以代表体积器官的叶绿素荧光模式。gydF4y2Ba

DNA和RNA提取gydF4y2Ba

从I中提取总RNA：BWgydF4y2BaAlmgydF4y2Ba发展小穗与白化的外稃和果皮和从那些鲍曼控制使用植物RNA迷你prepgydF4y2Ba^TMgydF4y2Ba套件（Zymo Research Corporation，Irvine，CA，USA）。将从几种植物中提取的RNA合并在一起以排除通过生物材料的偏差引入的可能误差。为每个基因型制备三种生物重复。gydF4y2Ba

RNA制备和测序gydF4y2Ba

RNA被汇集到6个文库中(每个文库有3个重复)。对短篇阅读的集合图书馆的阅读质量进行了检查。文库与多t尾珠孵育用于多聚a富集。在每个库中都添加了ERCC spike-in mix，以创建一种内置控制形式。RNA在核酸酶孵育下片段化。利用IonTorrent平台进行测序。gydF4y2Ba

qPCR实验验证gydF4y2Ba

对于QPCR RNA被用DNA酶（无QIAGEN RNA酶DNA酶组）处理。使用0.7μg等份的RNA通过逆转录制备单链cDNA，基于RevertaidTM试剂盒（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，Ma，USA）和（DT）15引物。随后的QRT-PCR基于Syntol Sybr Green I套件（Syntol，Moscow，俄罗斯）。使用相应的引物对（5'CGACACACGGCAATCAC 3'/ 5'AGACGGGCTCCTTGAACTC 3'和5'ACACTTGCTGCGTCTGTTTTGA 3'，评估III型LHCII前体蛋白基因和XLOC-012413转录物丰度。使用IDT Primerquest软件（gydF4y2Bahttp://eu.idtdna.com/primerquest/home/gydF4y2Ba)．使用的参考序列是UBC（泛素），使用[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．每个反应进行了三个技术重复。gydF4y2Ba

读取预处理和映射gydF4y2Ba

我们使用FASTQC（gydF4y2Bahttp://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc.gydF4y2Ba)来估计测序质量，cutadapt [gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]去除适配器序列和prinseq [gydF4y2Ba61gydF4y2Ba通过质量(最小平均Phred质量20)和长度(最小片段长度50)来过滤序列。生成的过滤库被映射到gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba来自Ensembl植物数据库的参考基因组组件082214V1.28。gydF4y2Ba

我们使用tophat2 [gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]和明星[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]读取映射的工具。对这两个映射器进行初步分析以获得最佳结果。gydF4y2Ba

从2到20运行“允许的不匹配”，“读取编辑距离”和“读取间隙长度”参数的“允许的不匹配”和“读取间隙长度”参数的值为2。使用袖扣处理TopHat2的结果[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba[管道，以获得mRNA片段计数和注释。我们估计以下质量措施，以选择提供最大基因组覆盖率和最小映射错误的对齐参数：gydF4y2Ba

1. （1）gydF4y2Ba

   连续读数覆盖的基因组段数，ngydF4y2Ba_浸gydF4y2Ba；gydF4y2Ba

2. （2）gydF4y2Ba

   6个文库中单读覆盖的基因组片段数gydF4y2Ba_{孤子gydF4y2Ba}；gydF4y2Ba

3. （3）gydF4y2Ba

   没有库片段的注释基因组区域的数量对齐，ngydF4y2Ba_{uncovgydF4y2Ba}；gydF4y2Ba

4. （4）gydF4y2Ba

   文库片段与参考基因组的比例，FgydF4y2Ba_{映射gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

STAR用于将库与4,8,12和18设置的参数'Outfiletmismatchmax'对齐。检查了一部分对齐的库片段，以调查允许数量不匹配的影响。允许的不匹配数量增加不会导致映射读数数量显着增加。将具有18个允许的不匹配的星形比对进一步分析。gydF4y2Ba

为了估计来自不同文库的mRNA表达数据的一致性，我们使用cuffnorm将Tophat方法获得的读计数归一化。STAR的地图文件由Bedtools的“coverageBed”工具处理[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]为每个映射片段生成计数表的程序。基于由袖扣管道产生的基因组标记的GFF文件用作参考基因组注释，以便评估来自星映射的计数表。将MRNA片段表达的这些估计用作Genecluster3.0的输入[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba使用平均聚类方法通过UPGMA方法集群六个库的软件。使用TreeView程序可视化描述所有六个库中mRNA表达估计的相似性的重建树[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

基因表达分析gydF4y2Ba

利用Cuffldiff和EdgeR两种方法对TopHat2作图结果进行差异表达基因的鉴定[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．要运行袖扣管道，我们使用了默认参数。如果表达水平的变化大于两倍的话，基因被区别为差异表达（|gydF4y2Ba_2gydF4y2BaFC| > 1gydF4y2BapgydF4y2Ba-值经benjaminii - hochberg程序校正后小于0.05 (q < 0.05)。EdgeR采用似然比检验进行差异表达检测。如果表达水平变化大于2倍，错误发现率小于0.05，则区分为差异表达(|log)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaFC | > 1 and FDR < 0.05). Lists of differentially expressed genes with higher and lower levels of expression in i:BwAlmgydF4y2Ba然后分别进行分析。将袖扣管道和EdgeR工具获得的差异表达基因列表进行比较。进一步分析使用任何一种工具确认的显著差异表达的基因列表，同时跟踪其差异表达与哪个工具确认的每个基因。gydF4y2Ba

用袖扣管道计算同种型差异表达。基于在基因组组件中注释的外显子内结构的数据，袖扣形成每个转录的基因组片段的潜在同种型列表。如果它们具有鉴别表达，基因被区分为具有差异的同种型表达，其中具有上面列出的两种同种型的标准。gydF4y2Ba

记录功能注释gydF4y2Ba

在转录组序列注释之前，我们将大麦affymetrix阵列序列分配到第i行:Bw中表达水平较高和较低的差异转录本列表中gydF4y2BaAlmgydF4y2Ba分别采用Blast软件进行序列相似性分析。由AgriGO在线服务进行基因本体分类和富集分析[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

用于途径分析所采取的基因列表由注释中的基因组成gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba基因组组装和表达水平的变化大于4倍，从他们的FPKM值在所有12个映射。途径分析使用PlantCyc (gydF4y2Bahttp://www.plantcyc.org/gydF4y2Ba)数据库。的细胞概述选择了“叠加实验数据”选项gydF4y2BaH.Vulgare.gydF4y2Ba（gydF4y2Bahttp://pmn.plantcyc.org/overviewsweb/celov.shtml.gydF4y2Ba)．实验数据以文本文件的形式提供，具有基因标识符列和具有日志值的列gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba两种大麦线之间的各种基因的FPKM改变。gydF4y2Ba

此外，还对BarleyCyc数据库中植物色素生物合成途径进行了专门研究。研究了“花青素生物合成超级途径(飞蝗苷3- o -葡萄糖苷)”、“花青素生物合成超级途径(天竺葵苷3- o -葡萄糖苷)”、“叶绿素循环”和“玉米黄质、蒽黄质和紫黄质相互转化”等途径，这是“类胡萝卜素生物合成超级途径”的一部分。实施“自定义或覆盖路径图上的组学数据”选项，使用差异表达基因列表覆盖路径中包含的基因列表。gydF4y2Ba

de novo转录组装配和分析gydF4y2Ba

德诺维gydF4y2Ba使用Trinity工具组装转录组[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．每个生物案例的所有库被汇集在一起，结果片段集使用默认参数进行组装。每个组件对齐到gydF4y2BaH.vulgaregydF4y2Ba使用Blastn工具的参考基因组与[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．同源检测的可靠性阈值是E <10gydF4y2Ba^{−10gydF4y2Ba}．与参考基因组无显著同源性的片段进行比对gydF4y2Ba奥科希亚大肠杆菌gydF4y2Ba基因组（NCBI参考序列NC_000913.3）以去除可能的污染物。去除污染物后，剩余的contigs对齐gydF4y2BaBrachypodium distachiongydF4y2Bacd库版本1.0.28，gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Bacd库版本1.0.28和gydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳gydF4y2Ba版本Tair10的CD库。gydF4y2Bao .漂白亚麻纤维卷gydF4y2Ba和gydF4y2Bab . distachiongydF4y2Ba序列从Ensembl Plants数据库中检索，gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba从TAIR数据库获得序列[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]gydF4y2Ba

客户关系管理:gydF4y2Ba

叶绿体RNA剪接和核糖体成熟蛋白gydF4y2Ba

FPKM:gydF4y2Ba

每千票零百万读的碎片gydF4y2Ba

GAPDH：gydF4y2Ba

Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶gydF4y2Ba

去：gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

JRL:gydF4y2Ba

jacalin相关章程gydF4y2Ba

NADP-ME:gydF4y2Ba

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸苹果酶gydF4y2Ba

nsLTP:gydF4y2Ba

非特异性脂质转移蛋白gydF4y2Ba

PGK:gydF4y2Ba

磷酸甘油酸酯激酶gydF4y2Ba

PPR:gydF4y2Ba

Pentatricopepride重复蛋白gydF4y2Ba

TIC和TOC:gydF4y2Ba

内/外叶绿体膜上的摇音符gydF4y2Ba

TPR：gydF4y2Ba

四肽重复蛋白质gydF4y2Ba

我们感谢Galina Generalova女士和Tatiana Kukoeva女士(ICG，新西伯利亚，俄罗斯)提供的技术援助，以及Andreas Börner博士(IPK-Gatersleben，德国)为NILs提供的大麦种子。我们也感谢伊沃·格罗斯博士(Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg)富有成果的讨论。新西伯利亚州立大学高性能计算中心因提供计算机设施而受到感谢。gydF4y2Ba

声明gydF4y2Ba

本文已作为BMC植物生物体积16补充3,3,2016的一部分发布：来自BGRS \ SB-2016的所选文章：植物生物学。补充的完整内容可在线提供gydF4y2Ba//www.cinefiend.com/articles/supplements/volume-16-supplement-3gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究得到了RFBR (no . 16-34-00924，生物信息学数据分析)、RSF (no . 14-14-00734，显微图像制备与分析)和ICG项目324-2015-0005 (ICG植物生长核心设施大麦种植)的资助。论文发表费用由俄罗斯科学基金资助(项目编号14-14-00734)。gydF4y2Ba

可用性数据和材料gydF4y2Ba

RNA-SEQ数据在Bioproject Prjna342150的NCBI中获得。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

NAS参与提取RNA，进行gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba分析测序数据并参与起草稿件。GVV准备的库，对IONTorrent平台进行了库的测序，参与了研究协调，解释数据并起草手稿。NVS参与了图书馆的制备和序列。EKK构思了这项研究并参加了起草手稿。GEI进行了RNA提取并进行了QPCR实验。AVD进行了显微分析和表型表征。DAA和EKK协调了这项研究，促成了其概念和设计，以解释数据并批判性地修改稿件。所有作者阅读并认可的终稿。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 俄罗斯新西伯利亚大学细胞学和遗传学研究所gydF4y2Ba

   Nickolay A. Shmakov，Gennadiy V.Vasiliev，Natalya V.Shatskaya，Alexey V. Doroshkov，Elena I. Gordeeva，Dmitry A. Afonnikov＆Elena K. KhlestkinagydF4y2Ba

2. Novosibirsk州立大学，俄罗斯新西伯利亚gydF4y2Ba

   Nickolay A. Shmakov, Dmitry A. Afonnikov & Elena K. KhlestkinagydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaNickolay A. Shmakov.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。gydF4y2Ba

重印和权限gydF4y2Ba