四倍体Timopheevi小麦中弹簧形式的发生与第一内含子的变化相关VRN-A1基因

背景

Triticum Araraticum.和小麦属植物timopheevii是Timopheevi组的四倍体物种。前者包括冬季和春季形式，呈冬季形式，而且T. Timopheevii.被认为是春季物种。为了阐明春天生长习性的起源T. Timopheevii.，等位变异的VRN-1在一组四倍体物种和二倍体物种的材料中研究了基因Ae。spottoides.他被认为是这些四倍体G基因组的供体。

结果

的启动子区域VRN-A1在所有研究的四倍体遗传araraticum.和T. Timopheevii.表示前面描述的等位基因VRN-A1F.在起始密码子附近有50 bp删除。确定三个额外的等位基因，即VRN-A1f-del那VRN-A1f-ins和VRN-A1F-DEL / INS，它在第一（1）中包含了大突变（1^圣)基因内区VRN-A1。第一个等位基因在内含子1的中心部分缺失2.7 kb，在少量的插入中出现araraticum.而且没有附赠T. Timopheevii。这VRN-A1f-ins等位基因，含有0.4kb螨元件的插入约0.4kb从内含子1的开始和等位基因VRN-A1f-del / ins具有删除的这种插入甚至为2.7kb是特征的特征T. Timopheevii。等位基因变异VRN-G1位点包括上述等位基因VRN-G1A.(在启动子中插入一个0.2 kb的螨)在两种四倍体物种的少数入种中发现。我们展示了这个等位基因VRN-A1f-del和VRN-G1A.与春季增长习惯没有关联，而在所有换乘过程中T. Timopheevii.这一习惯与占主导地位的人有关VRN-A1f-ins和VRN-A1f-del / ins等位基因。没有一个Ae。spottoides.本研究中包含的加入在启动子或1中发生了变化^圣内含子地区VRN-1这可能会赋予春天生长的习性。这VRN-1本文分析并从数据库下载的启动子序列已被用于构建文学图以评估分歧的时间Ae。spottoides.关于其他小麦物种。

结论

在加入中araraticum.，优先的冬季前身T. Timopheevii.，两者都发现了两个大突变VRN-A1和VRN-G1基因座（VRN-A1f-del和VRN-G1A.）发现对vernalization要求没有影响。春天四倍体T. Timopheevii.有一个VRN-1两种物种共同的等位基因（VRN-G1A.）和两个是特定的（VRN-A1f-ins那VRN-A1f-del / ins)．后一种等位基因包括1的突变^圣内含子VRN-A1并且还在内含子的开始附近分享了0.4 kB的螨虫插入。我们建议这种插入导致祖先的春季生长习性T. Timopheevii.这可能是在后来的驯化过程中被选择的。系统发育图建立在…基础上的系统发育图VRN-1启动子序列证实了B/G基因组祖先的早期差异(~3.5 MYA)Ae。spottoides.．

面包或常见的小麦，Triticum Aestivum.L.是最重要的作物之一，为全世界几乎一半的人群提供了一系列主食。它是通过与D-基因组的二倍体供体的二倍体小麦物种（BBAA）杂交产生的Allohexaploid（Bbaadd Genome，2n = 42）。这个活动发生在大约8000年前[1那2］．在普通小麦的四倍体祖先中有二粒小麦T. dicoccoides.（BBAA，2N = 28），衍生现代四倍体和六倍六倍栽培小麦的野生祖细胞，以及属于Timopheevi A. Filat的单独的物种组。et dorof。（GGAA）。

Tetraploid Timopheevi小麦包括密切相关的物种araraticum.Jakubz。和T. Timopheevii.(甲虫)甲虫。araraticum.主要增长在亚美尼亚、阿塞拜疆、格鲁吉亚、伊朗、伊拉克和土耳其[3.那4.和源于自然杂交的T. Uraartu.（AA，2n = 14）和Ae。spottoides.（SS，2N = 14），分别是A-和G-基因组的捐赠者[1那5.-7.］．araraticum.是国内的祖先T. Timopheevii。后者在格鲁吉亚西部Zanduri村附近有一个限制的原产地区[8.］．由于此功能，T. Timopheevii.不仅是通过形态学均匀性，还具有低细胞遗传学变异性的特征9.］．

春化要求，即冷处理诱导开花的必要性，是影响小麦作物产量和适应性的重要性状之一。这一特性已在普通小麦上作了深入研究T. Aestivum.其中它主要由三个同源性控制VRN-1位点:VRN-A1那VRN-B1和VRN-D1[10-12］．冬季品种是三个隐性等位基因的纯合VRN-1而春小麦在这些基因座中有一个或多个显性等位基因。占主导地位的VRN-1等位基因通常与两个主要监管区域中的突变相关联VRN-1基因，启动子和第一（1^圣基因内区。这种突变，即启动子缺失和插入，以及内含子1的大缺失，最初是在二倍体中检测到的t . monococcum（aa，2n = 14），常见的小麦T. Aestivum.和四倍体杜鲁姆[10那13那14］．

最近，我们的特点VRN-1代表野生四倍体的一套广泛的材料中的等位基因多样性T. dicoccoides.和三个二倍体A基因组祖先物种[15］．数据显示，一组显性VRN-1国内多倍体的等位基因特征可能在全多元化后出现，并在驯化期间选择。在这方面没有系统地检查四倍体Timopheevi小麦。最显着的差异之一araraticum.和T. Timopheevii.是，前者包括冬季和春天形式，具有冬季形式的优势，而T. Timopheevii.被认为是一个弹簧物种[4.那16］．因此,T. Timopheevii.为研究早熟小麦多倍体春季生长习性的起源提供了一个良好的模型VRN-1基因。

以便识别和描述VRN-1可能会影响春化要求T. Timopheevii.在本研究中，我们对其主要调控区域进行了比较分子分析VRN-1在Timopheevi小麦物种中。我们还研究了内在的变化VRN-1在二倍体Ae。spottoides.B/G-基因组的供体。

VRN-1四倍体Timopheevi小麦的等位基因变异性

启动子地区

四倍体小麦中的vernalization敏感性araraticum.和T. Timopheevii.由两个同源座位的等位基因控制，VRN-A1和VRN-G1．特定引物VRN1AF和INT1R用于鉴定促进剂区域的变化VRN-A1洛卡斯，如yan等人所述。[13] （桌子1;无花果。1)．所有研究的四倍体物种的研究都产生了约0.65 kB的PCR产物（附加文件1;无花果。2)．我们对VrnA1F/Int1R引物获得的PCR产物进行了测序，筛选出一组代表这些物种的材料(见表)2)．

所有研究的促进剂序列均为99％，彼此同源99％，并发表VRN-A1F.启动子T. Timopheevii.和araraticum.（GQ451751-451753和GQ451762-451765分别）。与其他已知相比VRN-A1序列，序列VRN-A1F.启动子在起始密码子的位置-63bp位置具有50bp删除（图。1)．在研究的序列之间也鉴定出几种诱导，其中包括1bp删除（C核苷酸在碳箱上游的C-富含C核苷酸）中的4个中的8个含量araraticum.和四种核苷酸取代．四学习VRN-A1启动子序列T. Timopheevii.与各自的序列相比是否没有特定的索引T. Araraticum。

用于分析VRN-G1基因座，引物P1 / P5用于扩增促进剂序列的约0.9kb区（表1;无花果。1)．41登记入册的araraticum.和3种进入T. Timopheevii.给出了预期的PCR产品，而4种附加araraticum.和1个加入T. Timopheevii.产生了约1.1 kb的更大的PCR产物(图。2 b)．对其中一株(PI 427403)的产物进行测序，结果表明，该产物与原株高度同源VRN-G1启动子的araraticum.（kr055682），而来自advance pi 654340和pi 119442的那些， - 后者组的代表几乎与先前发表的相同VRN-G1A.启动子的T. Timopheevii.（gq451755）（表2)．最后一个启动子包含一个微小反重复转座元件样的插入位点，位于终止密码子上游99 bp处(图)。1)．螨虫由215bp组成，包括9bp宿主复制（CTCCGCCCC）和29bp在末端反转重复（图。3.)．发现序列是与插入的折叠元件相同的92％VRN-A1A等位基因的T. Aestivum.(AY616458)。因此,隐性VRN-G1等位基因是大多数的特征araraticum.和T. Timopheevii.加入，而VRN-G1A.等位基因在两个物种中少频率发生。

1^圣内含子

引物对Intr1/C/F和Intr1/AB/R为1^圣内含子VRN-A1（桌子1;无花果。1)，用来证实隐性等位基因的存在T. Aestivum.内含子1无明显变化(缺失或插入)[14］．41登记入册的araraticum.（包括图4中所示的4个附加。2）和一个加入T. Timopheevii.产生约1kb的PCR产物，表明存在完整1^圣基因内区中VRN-A1基因（图。2摄氏度)．两种物种的剩余含量没有通过该对引物进行PCR产物。要确定解释最后一个模式的可能变化，1^圣内含子地区VRN-A1被分成通过不同的引物组合单独扩增的亚区。

内含子1的中央部分由引物int1 / a / f2和intr3侧翼（表1;无花果。1）在隐性的情况下几乎可以放大VRN-A1等位基因由于其大尺寸（〜5 kB）。但是，四个araraticum.和三个T. Timopheevii.使用这些引物（未提出的数据）扩增约2.5kb的PCR产物。这表明存在防止与对int1 / c / f // int1 / ab / r的对扩增的存在（图。1)．通过对该产物的单侧测序，我们确定了缺失的边界及其大小- 2.7 kb，与已知的隐性基因进行了比较VRN-A1等位基因。引物Delf和Delr设计缺失缺失并提供4​​50 BP片段（表1;无花果。二维)．因此，Intron 1中的2.7 kB删除VRN-A1是三个研究的特征T. Timopheevii.45个中有4个araraticum.（桌子2)．

使用引物组合Intr1 // Intr1insr，所有T. Timopheevii.结果表明，PCR扩增产物大于对照araraticum.（数据未显示）。该产品的测序显示出在外显子1的端部下游的插入位于435bp（图。3.)．该插入424bp长度被发现为99％与先前识别的螨元素相同VRN-A1F类似的等位基因的T. Militinae.[17］．为了确认这一结果，我们使用了瞄准插入右连接的底漆对Mitef /斜线（表1;无花果。1)．所有登记入册的T. Timopheevii.产生了370 bp的产物，而用araraticum.accessions（图。2 e)．因此，与2.7 kB删除不同，内含子1中的0.4kb螨插入是特定标记VRN-A1等位基因的T. Timopheevii。

在这里，我们指定了VRN-A1F.在1中具有不同突变的等位基因^圣基因内区,VRN-A1f-del那VRN-A1f-ins和VRN-A1f-del / ins(2.7 kb的缺失，0.4 kb的插入和两种突变2)．

底漆对EX1 / C / F和INT1 / B / R4设计为在内含子1中没有大突变的阳性对照VRN-B1 / G1基因座[14] （桌子1)．利用这些引物，所有的araraticum.和T. Timopheevii.产生1530bp PCR产物，表明完整1^圣内含子区域（图。2 f)．

因此，四倍体小麦araraticum.和T. Timopheevii.在1中显示最大的结构变化^圣内含子地区VRN-A1，包括0.4 kb的MITE插入特定于T. Timopheevii.．不像VRN-A1， 这VRN-G1遗址在1中显示出没有变化^圣在启动子中发现限制性变异(等位基因)VRN-G1A.)在两种物种的某些资源中。

评价四倍体涂层中生长习性

评估…的影响VRN-1通过对四倍体小麦春化要求等位基因的筛选，获得了小麦春化要求等位基因araraticum.和T. Timopheevii.表中给出2．值得注意的是，在所有研究的遗传中araraticum.等位基因的VRN-A1F.那VRN-A1f-del和VRN-G1A.与冬季生长习性有关，表明这些等位基因对春化要求没有影响。所有的四个加入T. Timopheevii.用等位基因VRN-A1f-del / ins(内含子1的插入+缺失)和VRN-A1f-ins(内含子1插入，无缺失)为春季型。因此，在1^圣内含子VRN-A1轨迹可能与春季生长习惯有关T. Timopheevii。

VRN-1等位基因变异Ae。spottoides.

启动子地区

引物对P1和P5成功扩增VRN-G1启动子araraticum.和T. Timopheevii.（见上文）在情况下没有PCR产品Ae。speltoides。设计引物对P8/P10, P1引物P8退火位置靠近退火位置的3 ' -端，P5引物P10退火位置重叠于退火位置的3 ' -半部分(见表)1)．这对在所有研究的牧区中产生约0.9 kB的预期产品Ae。spottoides.（没有提出的数据）．这表明存在完好无损VRN-G1促进剂，除非在可能已经修饰了侧翼序列的情况下，防止用P1 / p5扩增。进一步分析等位基因变异VRN-G1启动子，我们随机选择了7种Ae。spottoides.并测序用P8 / P10引物获得的相应的PCR产物。

7个序列之间高度相似(同源性≥98%)。个体序列之间的微小差异被发现，包括核苷酸替换和高达4 bp的小缺失。大多数变异位于保守区上游，距离起始密码子约0.3 kb，包含假定的调控位点[10那13那18］．在AGCC的串联轨迹中发现了一种显着的多态性在起始密码子上游〜0.6kb的串联轨道。众所周知VRN-B1 / G1小麦多倍体的序列含有4个重复，而在研究的序列中Ae。spottoides.重复的数量从两个（k-2278，I-551352，I-570060）变化，最多三（K-453，K-3257，K-911，K-443）。

这VRN-G1启动子序列Ae。spottoides.向相应的野生四倍体物种序列显示出类似的同源性（92-93％）araraticum.和T. dicoccoides.从数据库访问。与四倍体相比的序列变异包括几个小缺失和高达7bp的插入，最大缺失21bp位于起始密码子上游约0.5kb的约0.5kb是所有研究的特征Ae。spottoides.序列。

1^圣内含子

全部Ae。spottoides.利用引物Ex1/C/F和Intr1/B/R4分别与外显子1和内含子1序列进行修饰，未得到预期的1.5 kb PCR产物。考虑到两者之间的关系Ae。spottoides.和Ae。Tauschii.（DD Genome），而不是Intr1 / B / R4，我们测试了具有2个不匹配的int1 / D / R4引物对Ae。Tauschii.在同一个退火网站（表1)．后一种情况中预期的PCR产物的存在(数据未显示)表明Intr1/B/R4退火位点的分歧是使用第一引物对的阴性结果的原因。

系统发育分析VRN-1启动子序列

评估分歧程度VRN-1二倍体物种之间的推动子序列，其将其基因组赋予多倍体，以及不同的多倍体小麦（四或六倍体），我们基于在本研究中获得的核苷酸序列的对准并从数据库下载（见方法）。通常，三个主要组形成树上的不同分支（图。4.)．序列Ae。spottoides.源自与多倍体的B / G-基因组的分支相同，但根据我们的估计，相对〜约为3.6 mya。该日期与D-基因组基团（3.2 mENA）的分歧日期可比，其中占B / G和A-基团之间的中间位置。后者落入二倍体的一个单独的分支t . monococcum和包括二倍体的子组T. Uraartu.和一个基因组序列的多倍体序列。在该亚组内，先前建立的AllopolyProid分支（0.65 mya）的分歧日期用于校准（参见方法）。

各种纬度对多倍体小麦对生长的高可塑性和适应性通常由基因的等位基因变异来提供对富集化和光周期的敏感性（VRN.和产后抑郁症分别)。在对谷物植物进行了广泛的分子遗传学研究后，提出了包含两个因素的开花调控综合模型[19］．根据这个模型，VRN-1基因通过其结构中的两个主要调控区域，启动子和1^圣基因内区。这些地区的突变对VRN-1表达并使植物能够显着调节春化要求和开花时间[20.-24］．然而，仍然建立每个区域施加其效果的具体机制。

四倍体Timopheevi小麦春季生长习惯的起源

大多数野生麦科植物，无论是二倍体还是多倍体，都有冬季生长习性，表明是隐性的VRN-1等位基因是祖先的形式。相比之下，有许多栽培的多倍体小麦品种具有春季生长习性和至少有一个显性VRN-1等位基因(25］．多倍体小麦被分为两个进化谱系，二倍体小麦(Emmer, BBAA)和二倍体小麦(Timopheevi, GGAA)，它们是通过杂交形成的T. Uraartu.和Ae。spetoides.，第一个野生四倍体的分歧T. diccocoides.（BBAA）和araraticum.(GGAA)发生在数万年的过程中[26］．Emmer组中出现的弹簧形式可能与启动子或1的突变有关^圣内含子VRN-A1轨迹，主要是删除不同的长度[15］．为了研究Timopheevi小麦春季生长习性的起源，我们比较了野生物种araraticum.到其驯养的春天后代，T. Timopheevii.．

启动子区VRN-A1在两个四倍体物种中，显示出高水平的均匀性，并且与先前描述的几乎相同VRN-A1F.等位基因的T. Timopheevii.[27］．该等位基因的特征是起始密码子附近的50bp删除（图。1)．诸如emmer或二倍体小麦物种中未描述这种缺失，因此Timopheevi小麦可能是特异性的。这VRN-G1启动子的遗迹及其1^圣内含子在两个四倍体物种之间没有显着变化。单身VRN-G1A.发现0.2 kB插入的等位基因在频率下araraticum.在此进行研究（8％），也有两种换乘T. Timopheevii.， GQ451755和KX344118(表2)．对生长习惯的评估表明两者都不是VRN-A1F.也不VRN-G1A.负责弹簧型生长，因为携带这些等位基因的所有换乘都是冬季类型。同时，我们在1内发现了一种明显的特异性多态性^圣内含子地区VRN-A1。该区域中的改变包括0.4kb螨插入，分别位于内含子1的开始下约0.4kb和〜3kb的2.7kb缺失（图。1)．最近，Ivanicova等人。[17)描述了VRN-A1F类似的等位基因含有春季面包小麦线的突变，具有突出的遗传物质T. Militinae.朱。和migush。，从单一标本中选择的自由脱粒突变体T. Timopheevii.[28］．这些株系的特征是开花时间有显著差异-与影响VRN-A1F类似的等位基因。在这里，我们首次展示了螨虫插入和1中的删除^圣内含子VRN-A1是独立的起源，对增长习惯产生不同的影响。2.7 kB的删除显然出现在分歧之前T. Timopheevii.从araraticum.，因为最后一个物种的4次遗传都包含这个单一突变(等位基因VRN-A1f-del)．此外，我们发现螨的插入在没有进入araraticum.以及所有研究的牧师T. Timopheevii.其中它与2.7 KB的删除相结合(VRN-A1f-del / ins）在3种附加或作为单一突变（VRN-A1f-ins)在1个加入(表2)．因此，我们建议春季生长习惯在现代的祖先中出现T. Timopheevii.由于在1内插入螨虫^圣内含子VRN-A1并且在该物种的驯化期间选择了这种突变。

之前的数据支持内含子1的重要性VRN-1在vernalization响应的基因和前线时间的控制，所提出的“vernalization临界”调节区已经存在于从内含子1开始的〜3 kb（图。1) ［11那14］．该区域的一些突变(缺失、插入等)与不同作物的春季生长习性有关[14那21那29那30.］．有人建议所有这些突变可能会影响表观遗传染色质状态，导致较高的基础水平VRN-1为诱导一种春季型生长所必需的表达[22那30.］．以前，我们描述了主导的等位基因VRN-B1C.在内含子1的5'侧翼部分内具有大的改变（删除和复制），发现这些突变导致更高水平的VRN-1与没有这种突变的等位基因相比，转录和随后的开花时间减少[23那24］．另一个例子是VRN-A1ins.二倍体等位基因t . monococcum（AA）在同一区域中的0.5kb插入，该区域与春季生长习性相关的，在该物种的30％附加过程中[15那21］．

第一个内含子中的螨虫重复VRN-A1类似于塔塔盒序列(图。3.)．类似的复制是在主导的塔塔盒中插入的螨虫的特征VRN-A1A等位基因的T. Aestivum.[13］．最后一次突变可产生替代促进剂，或者允许调节转录的调节局部，因此vernalization要求。有趣的是，螨虫插入VRN-G1A.尽管与先前元素高，但具有完全不同的复制（图。3.)．因此，移动元件能够根据其结构和插入区域诱导不同的遗传调节模式。

等位基因变异VRN-1基因证实了早期分歧Ae。spottoides.来自B / G基因组的祖细胞

两个野生四倍体小麦物种，T. dicoccoides.和araraticum.，在植物形态中相似，但它们在其基因组体制（分别为BBAA和GGAA）中不同。B和G基因组的供体的身份仍然对猜测保持开放。基于对不同核和叶绿体基因座的分析，得出结论，这些基因组的祖先是部分的成员Sitopsis属的Aegilops.最有可能的,Ae。spottoides.Tausch [5.那7.那31］．最近，我们研究了等位基因变异VRN-B1基因的T. dicoccoides.并发现与...相比的低水平多态性VRN-A1[15］．这里显示了类似的保守主义VRN-G1蒂莫菲维小麦的所在地，除了VRN-G1A.发现等位基因对vernalization要求没有影响。然后出现了这两个基因座的结构特性是遗传的Ae。speltoides,B和G基因组的推定祖细胞。

我们的结果表明VRN-1轨迹in.Ae。spottoides.影响通常用于瞄准相应的引物的退火网站VRN-B1 / G1多倍体中的基因。因此，在启动子区域的情况下，我们使用了一个新设计的底漆，同时为1^圣使用D-基因组特异性对内含子(表)1)．在这两种情况下，都获得了与隐性形式相对应的PCR产物VRN-1基因。

排序VRN-1启动子区域从7种随机选择的Ae。spottoides.在可能的监管场所内部或附近表现出几乎没有变化，例如早期建立的塔塔盒，VRN和凯箱等[10那13那18那32那33］．大多数变异发生在调控位点的上游，包括一个由2-3个重复基序组成的短串联重复AGCC轨迹Ae。spottoides.序列，而在已知VRN-A1那VRN-D1和VRN-B1 / G1序列分别包含2个，3个和4个重复。因此，在B/G-基因组的进化过程中，有不断增加重复次数的趋势。这一趋势是否由于某些监管的影响VRN-B1 / G1基因座，或随机过程的结果，如遗传漂移，也不是未知。

这VRN-1启动子序列Ae。spottoides.与相应的野生四倍体数据库序列类似地同源T. dicoccoides.和araraticum.两种病例的同源性最高可达93%。值得注意的是，后者的序列与六倍体几乎相同(99- 100%同源)T. Aestivum.，暗示高度保护VRN-B1促进剂结构在整个小麦进化的四倍体和六倍体阶段。为了评估多倍体和相应二倍体供体的A-，B和D-基因组之间的差异之间的相对率，我们使用该构建了系统发育树VRN-1本文分析的启动子序列和公共数据库中可用的促进剂序列（图。4.)．利用分子时钟方法估计分歧时间（参见方法）。基于该估计，B / G基因组的祖细胞偏离Ae。spottoides.(~3.5 MYA)，远早于a -基因组的祖先T. Uraartu.，最接近A-基因组的二倍体供体，略早于D-基因组发生分支(分别为0.65和3.2 MYA)。后一个分支的中间位置与Marcussen等人的建议是一致的[2D-基因组祖先的出现是由于“a -和B-基因组谱系”祖先之间的同倍体杂交事件。在我们的模型中，主要分支的发散时间比前一个更早，但接近Gill等人提出的日期[34]在小麦系统发生的方案中。因此，所获得的结果证实了先前的数据，表明了相当远的位置Ae。spottoides.从多倍体形式的祖先并表明VRN-1启动子区可能是小麦族系统发育关系的良好标记。

在本研究中，我们研究了启动子和1^圣冬季化基因的内含子区域VRN-1在不同的探讨Timopheevi组及其二倍体G-基因组祖细胞的不同含量中，Ae。spottoides.．我们的结果表明，春型发生在四倍体T. Timopheevii.归因于1的变化^圣内含子地区VRN-A1基因，即，在该区域的“vernalization关键”部分内插入螨元件。所有研究的院副院araraticum.冬季生长类型没有这种突变，尽管存在其他影响调节区域的变化VRN-A1和VRN-G1位点。这意味着螨的插入发生在现代人的祖先身上T. Timopheevii.很可能是在这个物种的驯化过程中被选择的。等位变异VRN-1在二倍体中的基因座Ae。spottoides.与前一种物种捐献B和G-Genomes的四倍体后代，与四倍体的后代一样低。这VRN-1启动子序列用于构建一个植物图，证实了早期分歧的Ae。spottoides.来自B / G基因组的祖细胞（3.6 mya）。树的拓扑和主要分支机构的分歧日期与其他数据一致，使得启动子区域VRN-1用于不同基因组的定位和系统发育的估计的基因。

植物材料和DNA提取

植物材料包括四倍体小麦物种araraticum.和T. Timopheevii.（分别为45和4种附加）和23种附加Ae。spottoides.．这些加入选自俄罗斯，叙利亚，日本和美国的不同基因库（附加档案1)．

从7天大的幼苗中提取DNA [35］．使用FastPrep-24仪器（MP生物医学，USA）均化，从3-5种种子均匀化。

PCR.

PCR引物在[13那14那23那24]用于鉴定不同的等位基因VRN-A1和VRN-G1研究中的基因座（表格1;无花果。1)．进一步区分不同的契佩^圣内含子区域VRN-A1基因座我们设计了2对引物：Mitef /斜斜肌和Delf / Delr，分别检测0.4kb插入和删除2.7 kB。如果是Ae。spottoides.我们设计了引物P8和P10，而不是先前使用的P1 / P5引物，以放大VRN-G1启动子区域覆盖起始密码子上游〜900 BP（表1)．

PCR条件如[15］．通过1％琼脂糖凝胶分离扩增子。

PCR产品测序

使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（德国Qiagen，德国）从琼脂糖凝胶中纯化扩增的DNA片段，然后在两个方向上使用ABI棱镜染料终止剂循环测序测序准备反应试剂盒（Perkin Elmer Cetus，USA）。使用SB RAS Genomics核心设施的资源进行测序（Novosibirsk，Russia，http://equest.niboch.nsc.ru.)．Genbank登录号VRN-A1和VRN-G1来自四倍体物种（分别的KX344100-08和KX344116-18）的序列部分地表示2．这VRN-1启动子序列Ae。spottoides.沉淀于Ac. no . KX344109-15。

序列分析

使用Clustalw程序和Mega4软件进行多序列对准和随后的系统发育分析[36那37］．使用邻近加入算法和500引导复制构建系统发育树。MEGA4评估发散时间的时间使用校准来针对先前建立的同种质形成的年多个年前（MYA）的同种异体表倍数小麦的日期[1那38］．

评估生长习性

二倍体和四倍体含有不同的生长习惯VRN-1等位基因如[15[，来自2015-2016年的两个副本(表2)．

我们要感谢O. P. Mitrofanova博士供应小麦种类。我们感谢化学生物学研究所和基础医学研究所SB RAS（NovoSibirsk，俄罗斯）的基因组学核心设施，用于测序PCR产品。

声明

本文已作为BMC植物生物体积16补充3,3,2016的一部分发布：来自BGRS \ SB-2016的所选文章：植物生物学。补充的完整内容可在线提供//www.cinefiend.com/articles/supplements/volume-16- supplement-3．

资金

二倍体物种的研究是在国家预算计划（项目「0324-2015-2055）的框架下进行的，对四倍体小麦以及出版成本的分析由俄罗斯科学基金会提供资金（第14-14号项目-00161）。

可用性数据和材料

本研究中获得的所有DNA序列均存入国家生物技术信息（NCBI）中心，并收到加入号。KX344100-18。

作者的贡献

ABS设计了该研究，进行了分子和生物信息学实验和温室分析，并准备了稿件。AAS有助于分子分析。EA eas帮助解释结果并批判性修订了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

同意出版物

不适用。

伦理批准和同意参与

不适用。

从属关系

1. 联邦研究中心“俄罗斯科学院西伯利亚分行科学研究所”，Lavrentiev Ave。10，Novosibirsk，630090，俄罗斯

   Andrey Borisovich Shcherban＆Elena Artemovna Salina

2. 俄罗斯科院古代遗传学研究所，Gubkina Str。，3，莫斯科，119991，俄罗斯

   Aleksandra Aleksandrovna schichkina

相应的作者

对应到安德烈Borisovich Shcherban．

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重印和权限