新等位基因gydF4y2BaVERNALIZATION1gydF4y2Ba小麦基因与启动子区域DNA弯曲度和柔韧性的调节有关gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

在小麦中，春化需求主要是由小麦的植株控制的gydF4y2BaVRNgydF4y2Ba基因。不同种类的六倍体和四倍体小麦被广泛用作基础研究和实际育种计划的新突变变异体和等位基因的遗传来源。在这项研究中，gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba对6个四倍体小麦品种(gydF4y2Ba小麦属植物dicoccoidesgydF4y2Ba，gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba，gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba，gydF4y2Ba供试gydF4y2Ba，gydF4y2Bat . carthlicumgydF4y2Ba，gydF4y2Bat .硬质gydF4y2Ba)和五个六倍体物种(gydF4y2Bat .紧统gydF4y2Ba，gydF4y2Bat . sphaerococcumgydF4y2Ba，gydF4y2Bat . speltagydF4y2Ba，gydF4y2Bat .玛莎gydF4y2Ba，gydF4y2Bat . vaviloviigydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在启动子区域的新等位变异gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba根据DNA分子的曲率和柔韧性的变化来识别。的新变种gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba(指定为gydF4y2BaVrn-A1a.2，Vrn-A1b.2- - - - - -Vrn-A1b.6gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba)被发现广泛分布于六倍体和四倍体小麦中，实际上是已知的优势gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba等位基因。最大的多样性的新变种gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba(指定为gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba，gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba和gydF4y2BaVRNgydF4y2Ba-gydF4y2BaB1.mgydF4y2Ba)在四倍体和一些六倍体小麦品种中发现。gydF4y2Ba

第一次，被称为VRN-box的序列基序内的微小差异gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba与小麦生长习性相关。因此,gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba和gydF4y2Bavrn-A1b.4gydF4y2Ba在冬小麦中所揭示的gydF4y2BaVrn-A1b.2gydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-A1b.5，Vrn-A1b.6gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba。发现VRN-box单核苷酸突变可影响小麦春化需求和生长习性。我们的数据表明，VRN-box内的a -tract和C-rich片段都有助于其功能，并为VRN-box在调节转录中的假设作用提供了新的视角gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba基因。具体来说，该区域的突变组合可以调节小麦春化敏感性和开花时间。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

新的等位基因变异gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba对小麦的六倍体和四倍体基因进行了鉴定。VRN-box中A-tract和C-rich片段的突变gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba与春化需求和开花时间的调节有关。新的等位基因变异将有助于对基因调控的基础研究gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba为小麦的实用育种提供了宝贵的遗传资源。gydF4y2Ba

调控小麦对各种环境条件适应性的关键因素之一是调节季节生长习惯(春化需求)和光周期反应的基因中的等位基因多样性。春化需求决定了植物需要长时间暴露在低温下才能过渡到生殖发育阶段。根据小麦植株对春化的反应，小麦植株可分为冬季型(对春化敏感)、春季型(对春化不敏感)和兼性型(中间生长习性)。小麦的春化需求和生长习性在很大程度上受四个主要基因座的控制，这些基因座在决定开花和成熟时间方面也至关重要gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba(一种MADS-box转录因子)gydF4y2BaVRN2gydF4y2Ba锌指CCT结构域基因gydF4y2BaZCCTgydF4y2Ba)，gydF4y2BaVRN3gydF4y2Ba(与拟南芥基因同源gydF4y2Ba开花地点gydF4y2Ba),gydF4y2BaVRN4gydF4y2Ba(mads盒转录因子)[gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaVRNgydF4y2Ba基因在上位性上相互作用[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba])。的产物gydF4y2BaVRN2gydF4y2Ba表达下调转录gydF4y2BaVRN3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba通过与其他cct结构域蛋白的竞争性相互作用。这与HAP2/3/5复合物的HAP2 (HEME激活蛋白2)亚基的替换一起发生gydF4y2BaVRN3gydF4y2Ba启动子(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。反过来，VRN3蛋白从叶片转运到茎尖分生组织[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba在那里它们与转录因子FDL2(开花位点D-like2)相互作用，形成一种蛋白质复合物，激活基因的表达gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]，也可能是它的类似物gydF4y2BaFUL2gydF4y2Ba（gydF4y2BaFRUITFULL 2gydF4y2Ba),gydF4y2BaFUL3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。在春化处理,gydF4y2BaVRN2gydF4y2Ba春化条件(短光周期和低温)和激活的增加使转录逐渐下调gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba，这间接抑制了gydF4y2BaVRN2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。的后续表达式gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba在叶片中对维持抑制很重要gydF4y2BaVRN2gydF4y2Ba冬小麦春化后的转录[j]gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。之间的相互作用gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba，gydF4y2BaVRN2gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN3gydF4y2Ba形成规管正反馈循环[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba在其中gydF4y2BaVRN3gydF4y2Ba是春化和光周期花途径的整合者[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。的任何一种表达的变化gydF4y2BaVRNgydF4y2Ba这个反馈回路中的基因导致其他两个基因的转录谱的调节和开花时间的改变。假设gydF4y2BaVRN4gydF4y2Ba在叶子中活跃，并在叶子的上游操作(或作为叶子的一部分)gydF4y2BaVRN1 / VRN2 / VRN3gydF4y2Ba反馈循环，随附gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba最早的目标是(直接的还是间接的)gydF4y2BaVRN-D4gydF4y2Ba在这三个基因中[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaVRN2gydF4y2Ba位点包括三个串联复制的位点gydF4y2BaZCCTgydF4y2Ba基因。隐性gydF4y2Bavrn2gydF4y2Ba等位基因与基因的所有拷贝的功能丧失有关gydF4y2BaZCCTgydF4y2Ba可由CCT结构域编码区内的错义突变引起的所有同源基因组中的基因[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]或零等位基因的存在[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。很可能，这是遗传隐性的主要原因gydF4y2Bavrn2gydF4y2Ba到目前为止，被描述的只有gydF4y2Bat . monococcumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]并且在多倍体小麦品种中未观察到[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。的自然变异gydF4y2BaVRN3gydF4y2Ba只存在于B基因组中[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。占主导地位的gydF4y2BaVrn-D4gydF4y2Ba等位基因在小麦中分布较少，尽管在印度和附近地区的六倍体小麦中很常见[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，并且主要在…的加入中占主导地位gydF4y2Bat . sphaerococcumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。因此，绝大多数六倍体和四倍体小麦的春化需求是由等位基因多样性决定的gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba基因。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba基因已被定位到5同源组染色体长臂的中间[gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba]。等位基因变异gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba基因在很大程度上决定了小麦分为冬小麦、春小麦和兼性小麦。支配者的存在gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba等位基因导致完全消除春化需求(春型)，而存在任何一个gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba或gydF4y2BaVRN-D1gydF4y2Ba单独的等位基因与一些残留的春化反应和后期开花(兼性型)有关[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba基因拥有不少于两个调控区域，分别位于启动子和第一个内含子中[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。的显性等位基因gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba主要在启动子区域携带突变(特别是gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba/gydF4y2BabgydF4y2Ba/gydF4y2BadgydF4y2Ba/gydF4y2BaegydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-AgydF4y2Ba^米gydF4y2Ba1gydF4y2Ba/gydF4y2BaggydF4y2Ba的显性等位基因gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba（gydF4y2BaVrn-B1agydF4y2Ba/gydF4y2BabgydF4y2Ba/gydF4y2BacgydF4y2Ba),gydF4y2BaVRN-D1gydF4y2Ba（gydF4y2BaVrn-D1agydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-D1sgydF4y2Ba等位基因)主要由第一个内含子的突变决定[gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。然而，后来的一项研究发现了显性gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba等位基因(以下简称为gydF4y2BaVrn-B1 (ins)gydF4y2Ba)，它在启动子中有一个反转录转座子插入，并赋予春季生长习惯。不过，检测到这个插入主要是为了gydF4y2Bat . carthlicumgydF4y2Ba(86%)，只有3例gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。类似地，最近的一项研究发现了一个174 bp的插入gydF4y2BaVRN-D1gydF4y2Ba启动子区域，这可能促进了基础活性水平gydF4y2BaVRN-D1gydF4y2Ba基因(gydF4y2BaVrn-D1cgydF4y2Ba等位基因)[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。此外，在gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2Ba被鉴定出从1到4个副本gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。拷贝数变异(CNV)多态性是影响小麦春化所需期和开花时间的重要性状[j]。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

的启动子区域gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba基因含有多个调控位点[gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba其中最重要的是CArG-box、VRN-box和ACGT-motif。CArG-box (MADS-box蛋白的常见结合位点)位于转录起始位点上游180 bp，但位于acgt基序下游[gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba]。然而，在随后的研究中发现，在CArG-box被完全删除的植物中，春化需求得以保留(gydF4y2Bavrn-AgydF4y2Ba^米gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba等位基因)[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，表明CArG-box对春化需求的决定并不重要。皮达尔等。[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]分析了卫星的5' UTRgydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba春冬等位基因gydF4y2Bat . monococcumgydF4y2Ba的启动子区域携带突变的材料gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba。这导致鉴定出位于CArG-box上游的一个序列，其中包含与春季生长习惯相关的突变。此外，同一地区在两个主要的春季也发生了变化gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba多倍体小麦的等位基因[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。该16 bp序列(TTAAAAACCCCTCCCC)被指定为VRN-box。假设VRN-box参与了春化要求的确定。位于CArG-和vrn -box上游的是bZIP转录因子的结合位点。总的来说，在整个2.3 kb的启动子区域内gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba发现了几个这样的DNA基序，都具有ACGT核心序列。其中包括一个G-box (CACGTG)和四个假定的杂交box: a /G, a /C, G/ a, G/C，它们是TaFDL2的结合位点gydF4y2Ba花座d型2gydF4y2Ba并与TaFT (VRN3)形成蛋白质复合物[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。因此，TaFDL2与TaFT和bzip结合位点的相互作用gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba启动子是提供转录调控机制的基础gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba通过gydF4y2BaVRN3gydF4y2Ba。此外，激活gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba春化的表达与启动子不同区域组蛋白甲基化的变化有关[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]和内含子-1 [gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。此外，最近的报告强调了转录后调控gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba涉及第一个内含子序列的表达[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

六倍体和四倍体小麦中一些分布较少的品种作为新突变变异体和有农艺价值性状等位基因的遗传来源而受到研究人员的关注。例如，四倍体小麦品种gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba，gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba和gydF4y2Bat . carthlicumgydF4y2Ba和六倍体小麦gydF4y2Bat . speltagydF4y2Ba和gydF4y2Bat .紧统gydF4y2Ba等位基因在哪里gydF4y2BaVrn-A1dgydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-A1egydF4y2Ba［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，gydF4y2BaVrn-B1 (ins)gydF4y2Ba［gydF4y2Ba24gydF4y2Ba),gydF4y2BaVrn-D1sgydF4y2Ba［gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，首先被识别出来。尽管这些等位基因在小麦育种中很难在短时间内实现，但新的数据提供了显著的好处。本研究有助于扩大我们对…的结构和功能的认识gydF4y2BaVRNgydF4y2Ba基因，有助于鉴定和准确定位调控位点和区域，并进一步了解小麦发育、春化需求和开花时间的方式和机制。gydF4y2Ba

在本研究的调控区域gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba对四倍体和六倍体小麦进行了基因分析，以评价遗传变异和鉴定新的等位基因变异。DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中异常缓慢迁移的现象表明存在弯曲DNA，这是鉴定基因调控区域差异的第一步。把我们的注意力集中在调查gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba吉恩，我们也分析了gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba并将这些数据与我们之前的研究结果进行了推广gydF4y2BaVRN-D1gydF4y2Ba在相同的六倍体小麦品种中[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。这加强了实验植物基因型和表型之间的联系，并使我们能够预测新的突变变体在调控区域可能产生的影响。的新变体gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba这不仅对实际育种有用，而且对调控机制的基础研究也有用gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba基因的表达。特别是，新的数据可以有助于更准确地定位调控区域gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba启动子和第一个内含子。gydF4y2Ba

三种变体的鉴定gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba

聚丙烯酰胺凝胶电泳的PCR片段gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba启动子区gydF4y2Bat .紧统gydF4y2Ba和gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba结果显示了三个扩增子的组合，代表三个gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba等位基因变异。这些变体被命名为gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba(PCR片段853和944 bp)，gydF4y2BaVrn-A1a.2gydF4y2Ba(片段853、924和944 bp)和gydF4y2BaVrn-A1a.3gydF4y2Ba(片段765和853 bp)。的gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1a.3gydF4y2Ba变体(也称为gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba)分别在六倍体和四倍体小麦中被鉴定出来[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。新的变种，gydF4y2BaVrn-A1a.2gydF4y2Ba不同于gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba通过扩增额外的924bp片段(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.克隆该扩增子并测序(GenBank: KR782255 (gydF4y2Bat .紧统gydF4y2Ba(PI 352302))。随后的分析显示，与之相比，在MITE插入处有16 bp的缺失和4个单核苷酸缺失gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba(基因库:AY616458)。Yu等。[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]最近报道了一个222 bp的MITE_VRN插入到gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba等位基因处理一个23bp的microRNA序列(gydF4y2BaTamiR1123gydF4y2Ba)，这是对先前确定的补充gydF4y2BamiR507gydF4y2Ba［gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。重建RNA二级结构，以确定16bp缺失对形成稳定发夹环的能力的影响，这是microRNA加工所需要的(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba）.结果表明，这种缺失不仅包含30%的编码序列gydF4y2BaTamiR1123gydF4y2Ba同时也阻止了发夹环结构的形成，从而阻碍了microRNA的进一步加工。为了研究MITE_VRN与目标基因作为一个转录本被读取的可能性，利用MITE_VRN序列对小麦est进行了相似性搜索。结果，从6个聚类(Ta.98996、Ta.153105、Ta.11542、Ta.127802、Ta.219174、Ta.125868)中鉴定出9个转录本，同源性不低于82%，查询覆盖率> 77%(其中6个聚类的MITE覆盖率大于90%)。7份材料的相似性区域位于mRNA内，2份转录本的相似性区域从mRNA起始位置开始，对应于MITE序列的24bp位置。gydF4y2Ba

发现小说gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba等位基因gydF4y2Ba

PCR片段的分离gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba启动子区域，在PAA凝胶中的那些片段在琼脂糖凝胶中鉴定为隐性的gydF4y2Bavrn-A1gydF4y2Ba等位基因(713 bp)在部分四倍体小麦材料中发现了快速迁移扩增子。这些扩增子与705 bp片段的迁移密切相关，以供参考gydF4y2Bat . monococcumgydF4y2Ba与gydF4y2Bavrn-AgydF4y2Ba^米gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.两份植物的PCR片段gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba(PI 208912, PI 221422) 1gydF4y2Bat .硬质gydF4y2Ba(PI 74830)，参考编号为gydF4y2Bat . monococcumgydF4y2Ba(PI 428170)克隆并测序(GenBank: KM016789 (gydF4y2Bat . monococcumgydF4y2Ba， PI 428170)， km016790 (gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba， PI 208912)， km016791 (gydF4y2Bat .硬质gydF4y2Ba， PI 74830)， km016792 (gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba， PI 221422))。序列分析证实了该菌株的身份gydF4y2Bavrn-AgydF4y2Ba^米gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba等位基因的加入gydF4y2Bat . monococcumgydF4y2Ba结果表明，在VRN-box的a区(AnTm, n + m > =4)存在单核苷酸多态性gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba和gydF4y2Bat .硬质gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba）.这个新gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba等位变异被命名为gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba，根据Yan等人提出的春化反应基因命名法[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。在聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，弯曲的DNA比相同长度的非弯曲DNA迁移得更慢，正如已经证明的那样[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。通常，异常缓慢的电泳迁移率与DNA分子曲率的增加有关，这是由a束弯曲决定的[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。腺嘌呤到胞嘧啶的突变导致了vrn盒内a链断裂(A3而不是A5)gydF4y2BaVrn-A1i。gydF4y2Ba此外，a链内的胞嘧啶取代腺嘌呤还伴随着DNA片段灵活性的增加，这是由于a链较短，并且存在两个更灵活的核苷酸步骤“AC”和“CA”，而不是刚性的“AA”步骤，从而减少了刚性的局部弯曲。DNA分子局部弯曲角度和曲率的分布分析(附加文件)gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba:图S1)显示，A-tract的变化导致DNA片段的拉直，这使得gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba放大具有特征形状。这导致在PAA凝胶中的迁移增加gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2BaPCR片段与扩增子的比较gydF4y2Bavrn-A1gydF4y2Ba由VRN-box内完整的a束决定，由于它们的曲率，它们移动异常缓慢。gydF4y2Ba

新变种的发现gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba等位基因gydF4y2Ba

的解析过程中得到的下一个重要结果gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2BaPAA凝胶中的启动子区扩增子是检测长度接近DNA标记的PCR片段迁移率的差异gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.在琼脂糖凝胶分离或非优化或变性的PAGE中没有观察到这一点。克隆了多个多态性扩增子并对其进行了测序(GenBank: KM047641 (gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba， PI 233288)， km047642 (gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba， PI 256029)， km047643 (gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba， PI 352322)， km047644 (gydF4y2Bat . speltagydF4y2Ba， PI 330558)， km047645 (gydF4y2Bat . speltagydF4y2Ba， PI 348700)， km047646 (gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba， PI 264954)， km047647 (gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba， ua0300214)， km047648 (gydF4y2Bat .硬质gydF4y2Ba， PI 655432)， km047649 (gydF4y2Bat . vaviloviigydF4y2Ba， PI 428342)， km047650 (gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba， PI 223173)， km047651 (gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba， PI 466941)， km047652 (gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba， ua0300212)， kt692944 (gydF4y2Bat .硬质gydF4y2Ba， CItr 10024)， KT692945 (gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba(PI 220356))。与显性参考序列多次比对的结果gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba等位基因(GenBank: AY616461)鉴定了6个变异gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba。所有这些都包含三个共同的特征gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba:位于起始密码子上游137 bp的20 bp缺失，位于VRN-box上游的“T”缺失，以及在VRN-box的富C段内的“T- > C”替换。五种变体(gydF4y2BaVrn-A1b.1-b.5gydF4y2Ba)的不同之处在于VRN-box内a -tract的多态性。这些变体被命名为gydF4y2BaVrn-A1b.1gydF4y2Ba(A-tract = " AAAAT ")，gydF4y2BaVrn-A1b.2gydF4y2Ba(A-tract突变为“AACCC”)，gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba(A-tract突变为“AAACC”)，gydF4y2Bavrn-A1b.4gydF4y2Ba(A-tract突变为“AAAAC”)和gydF4y2BaVrn-A1b.5gydF4y2Ba(A-tract突变为“AAACA”)，而gydF4y2BaVrn-A1b.6gydF4y2Ba在富含C的片段中，携带额外的“C- > G”平移gydF4y2Bavrn-A1b.4gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba）.在这个命名法中gydF4y2BaVrn-A1b.1gydF4y2Ba对应于原始的gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba先前Yan等人发现的等位基因(GenBank: AY616461)。[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。值得注意的是，PCR片段gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1b.5gydF4y2Ba以及gydF4y2Bavrn-A1b.4gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1b.6gydF4y2Ba变异在PAA凝胶中以相似的速率迁移，这表明VRN-box的a通道长度在产生微小的可观察到的迁移速率差异方面的重要性。总的来说，A-道内的“A- > C”翻转伴随着A-道长度和DNA分子曲率的减少，导致DNA的异常缓慢迁移的PCR片段减少gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba在PAGE期间的变量。gydF4y2Ba

分布情况gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba小麦中的等位基因gydF4y2Ba

VRN-A1gydF4y2Ba启动子区突变等位基因和第一内含子大缺失等位基因在不同小麦品种间分布不均匀。特别是，74%的人在启动子区域携带突变等位基因，而只有26%的人在第一个内含子中携带7.2 kb的缺失(gydF4y2BaVrn-A1c(兰登)gydF4y2Ba等位基因)。在六倍体小麦、野生小麦和驯化小麦中均未检测到内含子-1突变。gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba和gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba。的最高分布gydF4y2BaVrn-A1cgydF4y2Ba被记录在gydF4y2Bat .硬质gydF4y2Ba(71%)和gydF4y2Ba供试gydF4y2Ba(58%)gydF4y2BaVrn-A1cgydF4y2Ba的子集中只检测到一个加入gydF4y2Bat . carthlicumgydF4y2Ba和gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba。占主导地位的gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba在6份材料中发现等位基因gydF4y2Bat .紧统gydF4y2Ba4次加入gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba。在这些物种中，每一种都有两个变种gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba被确定。gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba和新发现的gydF4y2BaVrn-A1a.2gydF4y2Ba在gydF4y2Bat .紧统gydF4y2Ba登记入册,gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1a.3gydF4y2Ba都记录在gydF4y2BaT.dicoccumgydF4y2Ba。这部小说gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba在5份材料中鉴定出等位基因gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba在一个样本中gydF4y2Bat .硬质gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

的变体gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba广泛存在于四倍体和六倍体小麦中:四倍体和六倍体小麦中分别有80%和77%的等位基因携带启动子突变(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表S1，附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表2)。的不同变体gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba在所有的加入中都有代表gydF4y2Bat . speltagydF4y2Ba和gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba一个突变体gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba启动子。在所有五个变体中gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba等位基因，典型变异gydF4y2BaVrn-A1b.1gydF4y2Ba仅在8%的病例中观察到。大多数(92%)携带本文描述的变异gydF4y2BaVrn-A1b.2-b.6gydF4y2Ba。在四倍体小麦中gydF4y2BaVrn-A1b.2gydF4y2Ba在所有的春季档案中都有发现gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba在42%的案例中gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba。的gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba等位基因在gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba(40%的加入)。gydF4y2BaVrn-A1b.6gydF4y2Ba在gydF4y2Ba供试gydF4y2Ba与gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba在样本中gydF4y2Bat .硬质gydF4y2Ba和gydF4y2BaT.turgidum。gydF4y2Ba最初的gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba等位基因(gydF4y2BaVrn-A1b.1gydF4y2Ba变体)只在两个词条中被发现gydF4y2Bat .硬质gydF4y2Ba还有3个gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba。在六倍体小麦中gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba在几乎所有被分析的物种中都有，除了gydF4y2Bat . sphaerococcumgydF4y2Ba。最大的多样性gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba在gydF4y2Bat . speltagydF4y2Ba，其中gydF4y2BaVrn-A1b.2gydF4y2Ba，gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1b.6gydF4y2Ba变异被识别出来gydF4y2Ba。gydF4y2Ba的两项加入gydF4y2Bat .紧统gydF4y2Ba(PI 262666和PI 41023)两者都有gydF4y2Bavrn-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1b.6gydF4y2Ba等位基因。gydF4y2Ba

显性等位基因gydF4y2BaVrn-A1egydF4y2Ba，先前在gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，在两个案件中被发现gydF4y2Bat . carthlicumgydF4y2Ba一个是gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba。的PCR片段gydF4y2BaVrn-A1egydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1fgydF4y2Ba等位基因的长度大致相同，为658 bp。因此,gydF4y2BaVrn-A1egydF4y2Ba经测序证实(GenBank: KT361213)。此外，预测DNA曲率的PCR片段gydF4y2BaVrn-A1fgydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1egydF4y2Ba让我们假设碎片gydF4y2BaVrn-A1fgydF4y2Ba在PAA凝胶中相对于gydF4y2BaVrn-A1egydF4y2Ba这是由于vrn -盒内的a束和carg -盒内的t束产生了两个额外的弯曲。最后,gydF4y2BaVrn-A1fgydF4y2Ba可能发生在小麦的gydF4y2BaTimopheeviigydF4y2Ba节(gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

有趣的是，的新变体gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba本文使用凝胶阻滞的变化(DNA分子曲率和柔韧性的变化)在小麦物种中比以前已知的更常见gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba等位基因。这表明，这些新的变异可能作为对环境条件的有益适应，积极参与了自然选择。gydF4y2Ba

发现新事物gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba变体gydF4y2Ba

的结果gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba启动子区域分析发现，几乎所有的加入gydF4y2Bat . carthlicumgydF4y2Ba(PI 168672除外)携带反转录转座子插入(gydF4y2BaVrn-B1 (ins)gydF4y2Ba等位基因)。在一定的电泳条件下，PCR片段与完整片段迁移速率的差异gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba启动子显示(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba）.这些变体被命名为gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba，gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba(根据相关PCR片段的迁移速率:“f”= fast，“m”= medium，“s”= slow)。扩增子之间迁移率的差异，使检测到替代gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba只有通过聚丙烯酰胺凝胶分离才能观察到启动子变异，并且随着DNA分子构象动力学的降低和稳定性的提高而增加。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

为了更详细的研究，放大的gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba，gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba克隆并测序(GenBank: KR782252 (gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba， PI 208912)， kr782253 (gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba， PI 191579)， kr782254 (gydF4y2Ba供试gydF4y2BaPI 134945)， kt361212 (gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba(PI 466941))。这些替代PCR片段的DNA序列比对鉴定出8个snp (T102C, G174A, A297C, T341G， +360C， +370C, C558T, C729G)和3个短缺失，分别位于7 bp(“GGAAAAA”)，3 bp(“GTA”)和2 bp(“TT”)gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba相对于gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba,在那里gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba对应于gydF4y2Bavrn-B1gydF4y2Ba具有完整启动子的等位基因。gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba不同于gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba由于缺少7bp的缺失。进一步，在相关DNA序列中发现了C654G和A693G snpgydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba，与…有关gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba。虽然总的突变gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba结果扩增子长度仅减少10bpgydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2BaPCR片段(总长度958 bp)通过PAA凝胶的迁移速度远低于gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba(968个基点)。在低温优化条件下进行PAGE时，相对于DNA分子量标记物测量的差异大于100 bp。类似地，的扩增子gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba(965 bp)比gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba(958 bp)，但慢于gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba(968个基点)。7bp和2bp的缺失位于a区，而a区又位于片段的中心附近(图2)。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba）.这两个因素都有助于DNA曲率的变化，导致观察到的异常缓慢的迁移gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2BaPAA凝胶中的PCR片段与gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba扩增子(无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba）.2 bp的缺失使t链的长度从9 bp减少到7 bp。较远的7 bp缺失位于a -tract富段，包含从原生基因起始密码子开始计数的- 549至- 509 bp区域gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba（gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba）.该区域包括6个a区，由二核苷酸步骤(“GC”和“GG”)分开。分离a - 2和a - 3链的二核苷酸步骤的多态性gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba检测到添加。通过对GenBank中15份资料的比较，发现该区域的遗传多样性gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba和gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba包括二核苷酸“GG”，而gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2Ba，gydF4y2Bat .硬质gydF4y2Ba，gydF4y2Ba供试gydF4y2Ba和gydF4y2Bat . carthlicumgydF4y2Ba进位“TT”(图2)gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

为了确定富含a链片段的7bp缺失对整体DNA曲率的改变和观察到的DNA发育迟缓的贡献gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba在PAA凝胶中扩增，产品编号PI 208912 (gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba)， PI 466941 (gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba)， IG 46528(其序列(GenBank: KM586665)对应于gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba)及pi191579 (gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba)在相同的电泳条件下进行分析(图2)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba）.结果表明，7 bp的缺失对该基因的异常迁移有贡献gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2BaPCR片段的优势程度(5 - 10%)不如t道中2 bp的减少。因此，这两种贡献对基因的电泳延迟同样重要gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba扩增子。此外，还发现来自IG 46528 (gydF4y2BaVRN-B1.m.1gydF4y2Ba)与PI 466941的扩增子(gydF4y2BaVRN-B1.m.2gydF4y2Ba)，尽管两项申请均载有gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba。序列比对显示gydF4y2BaVRN-B1.m.1gydF4y2Ba包含230 bp位置的“T”缺失和A-tract的G341T平移消除(“ATG”而不是“ATT”)，这解释了观察到的迁移速率差异gydF4y2BaVRN-B1.m.1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.m.2,gydF4y2Ba在哪里gydF4y2BaVRN-B1.m.1gydF4y2Ba迁移速度快于gydF4y2BaVRN-B1.m.2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

的分布gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba等位基因gydF4y2Ba

分布分析gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba变种表明gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba普遍存在于冬春两季六倍体和四倍体小麦品种中，而gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba根据护照或实验日期，主要在有春季生长习惯的材料中鉴定。变体分布gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba不同的六倍体小麦品种是不相等的。gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba只存在于gydF4y2Bat .紧统gydF4y2Ba和gydF4y2Bat . speltagydF4y2Ba。急剧下降gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba启动子变异的多样性，可能是由于遗传瓶颈和由于物种形成的奠基人效应的结果gydF4y2Bat .玛莎gydF4y2Ba，gydF4y2Bat . vaviloviigydF4y2Ba和gydF4y2Bat . shaerococcumgydF4y2Ba，其中所有分析的资料都具有gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba。相反，在四倍体小麦中，所有种类(除了小麦)都是如此gydF4y2Bat . carthlicumgydF4y2Ba包含一个TE插入gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba的分布较为均匀gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba变异与gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba占主导地位的。gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba只在两篇文章中被发现gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba(圆周率352322，圆周率466941)有趣的是，所有的加入gydF4y2Ba供试gydF4y2Ba与gydF4y2BaVrn-A1cgydF4y2Ba与…有关gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba，同时进行入会gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba的特点是gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba。同样的,gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba是在gydF4y2Bat . speltagydF4y2Ba与gydF4y2BaVrn-A1b.2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

采用多重PCR法进行检测gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Baintron-1。前向引物Ex1/C/F先前设计用于扩增gydF4y2BaVrn-A1cgydF4y2Ba［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。然而，序列比对表明，该引物退火为gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba因此，对引物组合Ex1/C/F、Intr1/B/R3和Intr1/B/R4进行了优化gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba。该多重PCR在长度分别为1531、1091、1055和705 bp的PCR片段中提供了4个dna标记，便于区分gydF4y2Bavrn-B1gydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-B1agydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-B1bgydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-B1cgydF4y2Ba等位基因(图2)gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba）.的显性等位基因gydF4y2BaVrn-B1gydF4y2Ba内含子-1突变在六倍体小麦品种中普遍存在。尤其是占支配地位的人gydF4y2BaVrn-B1agydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-B1bgydF4y2Ba或gydF4y2BaVrn-B1cgydF4y2Ba在四倍体小麦中未检测到等位基因gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2Ba，gydF4y2Ba供试gydF4y2Ba，gydF4y2Bat . carthlicumgydF4y2Ba。只有一次加入gydF4y2Bat .硬质gydF4y2Ba携带gydF4y2BaVrn-B1agydF4y2Ba，分别为2和5gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba和gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba分别进行gydF4y2BaVrn-B1cgydF4y2Ba。在六倍体小麦中gydF4y2BaVrn-B1cgydF4y2Ba在gydF4y2Bat . speltagydF4y2Ba(33%),gydF4y2Bat .玛莎gydF4y2Ba(一次加入)和gydF4y2Bat . sphaerococcumgydF4y2Ba(一次加入)，而gydF4y2BaVrn-B1agydF4y2Ba只在gydF4y2Bat .紧统gydF4y2Ba(50%)。gydF4y2Ba

VRN-box多态性与春化需求和开花时间有关gydF4y2Ba

根据护照资料，几乎所有的入籍都带有gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba有一个冬季生长的习惯除了两个加入gydF4y2Bat . speltagydF4y2Ba(pi 306550, pi 323438)。然而，dna标记分析表明，这些春化不敏感表型gydF4y2Bat . speltagydF4y2Ba是由支配者决定的吗gydF4y2BaVrn-B1cgydF4y2Ba等位基因。一些加入gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba在没有春化的温室中长时间光照(>16 h)生长，然后用gydF4y2BaVRNgydF4y2Ba标记(表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.接入pi428342, pi655432和UA0300214(仅检测到)gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba，gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba种植后120天(4个月)未达到茎伸长，终止试验。只有PI 223173 (gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba，gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba)花期较晚(128天)。这证实了加入gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba特点是冬季生长习性和保持春化的要求。同样，的加入gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba(PI 466941gydF4y2Bavrn-A1b.4gydF4y2Ba根据护照数据有冬季生长习惯，这在这里得到了实验证实(120天后茎伸长失败)。相比之下，所有的加入gydF4y2BaVrn-A1b.2gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1b.5gydF4y2Ba根据护照资料，在本研究进行的温室种植试验中也证实了其春季生长习性。尽管如此，几乎所有的加入gydF4y2BaVrn-A1b.2gydF4y2Ba有gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba和/或携带对方的显性等位基因gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba基因(gydF4y2BaVRN-B1 / D1gydF4y2Ba）.附件pi428178 (gydF4y2Bat .玛莎gydF4y2Ba)及pi190920 (gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba)只是例外。gydF4y2Ba

二份四倍体小麦gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba根据护照数据，PI 208912和PI 74830具有春季生长习惯，而其他4个具有冬季生长习惯。然而，在种植这些“春季”和“冬季”(PI 221422)材料时，它们都能够在没有春化的情况下开花(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，但开花时间明显晚于优势品种gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba或gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba等位基因。值得注意的是，“冬”入种(PI 221422)比“春”入种(PI 208912、PI 74830)晚25天开花，两者均有隐性gydF4y2Bavrn-B1gydF4y2Ba和gydF4y2Bavrn-B3gydF4y2Ba等位基因。我们认为春化敏感性和兼性生长习惯的降低是典型的具有gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaVrn-A1b.5gydF4y2Ba植株(UA0300212)比植株早22天开花gydF4y2BaVrn-A1b.1gydF4y2Ba(π264954)。同样，PI 208912和PI 74830比PI 221422早开花25天，但都开花gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.的gydF4y2BaVrn-A1b.5gydF4y2Ba在VRN-box内A-tract多态性与gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba，但它也包含表征所有变异的常见突变gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba等位基因。有趣的是，在所有这些情况下，较早的加入(UA0300212, PI 208912, PI 74830)被保留gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba。此外,gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba在PI 223173中被鉴定出，该菌株后来没有春化开花，与其他同样携带gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba。这表明两者之间存在联系gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba，春化敏感性降低，开花提前。应当指出，.的加入gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba(PI 466941gydF4y2Bavrn-A1b.4gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba在试验终止前未能达到茎伸长，与加入PI 223173相比gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba。进一步，发现加入物UA0300212 (gydF4y2BaVrn-A1b.5gydF4y2Ba，gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba)比PI 208912和PI 74830 (gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba，gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba）.这个差大约对应于PI 264954 (gydF4y2BaVrn-A1b.1gydF4y2Ba，gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba)及pi221422 (gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba，gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba)，为34天(表3)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.在这两种情况下，比较的遗传都不携带已知的显性基因gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B3gydF4y2Ba等位基因，它们有相同的启动子变体gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba只在gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba具有共同特征的等位基因:VRN-box富C区域内的“T- > C”SNP(图2)。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

识别的检测gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba等位基因gydF4y2Ba

由VRN-box内的突变引起的DNA分子曲率和柔韧性的差异gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba本文首先描述的等位基因变异，或通过a -束内缺失的启动子变异gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba，导致异常迁移PCR片段的速率调节。早在25年前就有研究表明，PAA凝胶中固有弯曲的DNA分子的异常迁移允许检测小序列特异性DNA结构变化[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。在我们之前的研究中gydF4y2BaVRN-D1gydF4y2Ba和gydF4y2BaPpd-A1gydF4y2Ba单倍群是根据异常迁移进行区分的[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。本研究发现PAA凝胶中PCR片段迁移率对DNA分子曲率的敏感性，为开发一种简便、快速的鉴别方法提供了良好的基础gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba等位基因变异。尽管如此，鉴定的新gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba变体需要非常特定的PAGE条件。因此，电泳条件进行了优化，以获得在低温和室温下电泳时最小的分辨率损失。例如，如图5所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在一个典型的中性页面之间的差异gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba变体是微不足道或完全不存在的，而PAGE的优化结果是两者之间的明确区分。总的来说，异常缓慢迁移的PCR片段的延迟和更清晰的条带定义对于鉴定该病毒尤为重要gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba变异,gydF4y2BaVrn-A1b.1gydF4y2Ba/gydF4y2BaVrn-A1b.6gydF4y2Ba和gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba/gydF4y2BaVrn-A1b.2gydF4y2Ba在迁移速率上表现出较小的差异，并且也是的优势变异gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba。遵守本文提出的建议促进了对gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba变异和防止潜在的错误分析遗传物质春化实验。例如，在标准条件下，通过琼脂糖凝胶或PAA凝胶的电泳不允许检测变体之间的差异gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba。因此,gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba和gydF4y2Bavrn-A1b.4gydF4y2Ba，与春化需求和冬季生长习惯相关的，可能被错误地视为已知的显性gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba等位基因，这与春季生长习惯有关。gydF4y2Ba

的多态性gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba启动子区域导致DNA分子曲率的改变gydF4y2Ba

分析gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba启动子区域鉴定出三个序列变体(gydF4y2BaVRN-B1.f，VRN-B1.sgydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba)，这可以在DNA分子低构象动力学的PAA凝胶中分离时解决。相比gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba(968 bp)gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba(958 bp)包含3个短缺失，分别位于2、3和7 bpgydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba(965 bp)不同于gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba因为没有7个bp的缺失。尽管如此,gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba迁移速度比gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba哪个比哪个慢gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba。如前所述，弯曲的DNA分子在聚丙烯酰胺中迁移速度较慢，而在琼脂糖凝胶中则不然[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]主要由a束的长度和位置决定的速率[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。的PCR片段迁移异常缓慢gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba是由a区2 bp和7 bp缺失的定位决定的。特别是，2 bp的缺失减少了9 bp的t -链的长度。正如Koo等人先前所证明的那样。[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]和我们最近关于单倍型的鉴别研究gydF4y2BaVRN-D1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，随着a链长度的减小，DNA曲率增大，当a链长度大于7 nt时，曲率通过反向等效弯曲的反相补偿而减小。因此，t链长度从9个核苷酸减少到7个核苷酸导致该DNA片段的局部曲率增加。这就解释了2个bp的缺失对鱼类异常缓慢迁移的贡献gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba。7 bp的缺失位于A-tract rich区段，该区段包括6个被二核苷酸步骤分隔的A-tract。因此，第一束产生的弯曲被第二束的弯曲所补偿，第二束的弯曲方向相反。同样，第四神经束补偿第三神经束的弯曲，第六神经束补偿第五神经束的弯曲。因此，这个区域的曲率是微不足道的。然而在gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba由于缺失，第4束没有被第3束的相反弯曲所补偿，通过7 bp的缺失包围了这一节段。这将导致DNA分子的曲率增加，并延缓gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2BaPAA凝胶中的扩增子。局部曲率的变化对减速的影响gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba扩增子显著增强是由于DNA弯曲，由7和2 bp的缺失引起，定位于片段的中心。在之前的一项研究中，Shcherban等人[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba注意到的变化gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba的某些加入的启动子区域gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba包括7,3和2bp的缺失，它们携带这里指定的gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba变体。然而，目前的研究是第一次检查这些分布gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba小麦品种间的变异及其可能的表型关联，并描述一种检测变异的方法。支配者的组合gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba等位基因与gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba与早期开花有关(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.虽然突变似乎不太可能是gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba对调控位点有影响，因为它们位于远离转录起始位点很远的地方，这些突变可以通过远端增强子或沉默子施加影响。此外，也不能排除DNA分子内部的显著弯曲gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba启动子区域，在这里通过在PAA凝胶中异常缓慢的迁移证实，促进了远程增强子和调控位点之间的相互作用gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba启动子;从而通过DNA环激活转录。另外，在的启动子区域插入gydF4y2BaVrn-D1cgydF4y2Ba，与转录水平升高相关，位于a区富区上游60 bp以上，转录起始位点上游600 bp [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。然而，虽然启动子序列变异之间的关联gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba这些变异作为多态、共显性DNA标记在遗传分析中具有很高的价值。gydF4y2Ba

的研究gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Baintron-1gydF4y2Ba

已经提出了许多用于识别显性基因的标记系统gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba内含子-1内携带大量缺失的等位基因[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。本研究优化的多重PCR系统提供了比现有类似物短近150 bp的DNA标记，用于区分完整内含子-1和三个显性内含子-1gydF4y2BaVrn-B1a, Vrn-B1bgydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-B1cgydF4y2Ba等位基因。此外，在两个单独的PCR检测中同时使用正向引物Ex1/C/F来鉴定该基因的等位基因gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba基因和显性等位基因gydF4y2BaVrn-A1cgydF4y2Ba［gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba在经济上有利。分布分析gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba显性等位基因表明gydF4y2BaVrn-B1cgydF4y2Ba等位基因在春季六倍体和四倍体小麦品种中较常见gydF4y2BaVrn-B1agydF4y2Ba或gydF4y2BaVrn-B1bgydF4y2Ba(未检测到)，而在启动子区域插入反转录转座子gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba该基因可能是四倍体小麦所特有的gydF4y2Bat . carthlicumgydF4y2Ba在美国，它是春季生长习性的主要决定因素(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表2)。这里调查的大部分春小麦种质都带有显性gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba等位基因与显性基因组合gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba。有趣的是，加入gydF4y2Bat .紧统gydF4y2Ba与占主导地位的gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba的特点是gydF4y2BaVrn-B1agydF4y2Ba等位基因，而有的则加入gydF4y2Bat . speltagydF4y2Ba携带gydF4y2BaVrn-B1cgydF4y2Ba独家。gydF4y2Ba

不那么频繁gydF4y2BaVRNgydF4y2Ba小麦六倍体和四倍体的等位基因gydF4y2Ba

所有的加入gydF4y2Bat . sphaerococcumgydF4y2Ba携带隐性基因gydF4y2Bavrn-A1gydF4y2Ba等位基因(完整的)gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba启动子和内含子1)，根据护照数据，16份材料具有春季生长习惯，2份样品具有兼性或冬季生长习惯。然而,gydF4y2BaVrn-B1cgydF4y2Ba仅在一份文件中被确认gydF4y2BaVrn-D1agydF4y2Ba在短短两个月内[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。因此，春季生长习性的优势数gydF4y2Bat . sphaerococcumgydF4y2Ba获得性主要由非等位基因决定gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba或gydF4y2BaVRN-B3gydF4y2Ba。这与春天生长习性的假设是一致的gydF4y2Bat . sphaerococcumgydF4y2Ba加入在很大程度上由支配者控制gydF4y2BaVrn-D4gydF4y2Ba等位基因(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

新发现的等位基因gydF4y2BaVrn-A1a.2gydF4y2Ba是否可以表明是否存在额外的副本gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba

Yan等。[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba的两种变体gydF4y2BaVrn-A1a,gydF4y2Ba名字在这里gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1a.3gydF4y2Ba。他们认为gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba是六倍体小麦所特有的，而gydF4y2BaVrn-A1a.3gydF4y2Ba是四倍体小麦所特有的。在目前的研究中gydF4y2BaVrn-A1a.3gydF4y2Ba仅在四倍体小麦中检测到，而gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba在六倍体和四倍体小麦品种中均有发现。一个新的等位基因，gydF4y2BaVrn-A1a.2gydF4y2Ba在本研究中首次鉴定到的一种单克隆抗体仅在六倍体小麦材料中检测到。gydF4y2Ba

使用与之匹配的探针进行杂交gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba外显子4和8之间的区域[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba显示等基因系携带gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1a.3gydF4y2Ba(分别为TDD和Anza)与具有隐性的系具有相同的杂交片段和相似的强度gydF4y2Bavrn-A1gydF4y2Ba等位基因(TDC, Winter-Anza)。这些数据表明，加入gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba有相同的拷贝号吗gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba基因是与gydF4y2Bavrn-A1gydF4y2Ba，如TDC线路。最近，使用gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba拷贝数Taqman测定，发现TDC中含有1个拷贝gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。身份识别gydF4y2BaVrn-A1a.2gydF4y2Ba启动子区域和外显子1的额外拷贝，与gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1a.3gydF4y2Ba允许我们假设加入gydF4y2BaVrn-A1a.2gydF4y2Ba包含不少于2份gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba(即多一份gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1a.3gydF4y2Ba)，两者的不同之处在于在启动子区域插入MITE_VRN时缺失了16bp。gydF4y2Ba

原来的MITE来自gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba等位基因转录成RNA后形成高度稳定的发夹环结构(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)，便于后期加工形成microRNA -gydF4y2BaTamiR1123gydF4y2Ba［gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。然而，在本研究中发现的突变型(命名为spring2或MITE_VRN.2)来自于gydF4y2BaVrn-A1a.2gydF4y2Ba等位基因有一个16 bp的缺失，包含8 bp的DNA序列gydF4y2BaTamiR1123gydF4y2Ba这导致RNA二级结构的改变，阻止了pri-miRNA中的环路(图2)。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba）.16bp缺失的两侧是核苷酸重复(CAGGT)，这是内部缺失的特征gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]，并提出非同源末端连接的双链DNA断裂修复机制是由单链类似退火机制介导的[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba可以用来解释它们的出现。序列和靶点重复的特征使MITE_VRN成为一个Mutator-like element (MULE) [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。众所周知，骡子可以携带转录基因的启动子[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。此外，植物中的大多数miRNA基因都含有TATA盒基序，并由RNA聚合酶II转录[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。在任何情况下，这个启动子必须位于序列编码的上游gydF4y2BaTamiR1123gydF4y2Ba自转录水平gydF4y2BaTamiR1123gydF4y2Ba与转录水平呈正相关gydF4y2BaVrn-A1a.1gydF4y2Ba在TDD线内[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。因此,gydF4y2BaVrn-A1a.2gydF4y2Ba启动子必须是完整的，因为在MITE中16bp的缺失位于起始位置的下游gydF4y2BaTamiR1123gydF4y2Ba。这是对的gydF4y2BaTamiR1123gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba被转录成单一产物[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。小麦est的BLAST分析结果假设mRNA可以被位于24 bp位点上游的MITE_VRN替代启动子读取，这表明MITE_VRN和靶基因实际上可以作为一个转录物被读取。直接或间接诱导的可能性gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba通过gydF4y2BaTamiR1123gydF4y2Ba要解释它们转录水平的正相关似乎不太可能gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba不是唯一的来源吗gydF4y2BaTamiR1123gydF4y2Ba-冬季也会出现[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

VRN-box多态性与小麦春化需求和开花时间的调控有关gydF4y2Ba

四个启动子区域的多态性区分了已知的变异gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba完好无损的gydF4y2Bavrn-A1gydF4y2Ba等位基因。这包括VRN-box内a -tract和C-rich区域的多态性，以及VRN-box下游和上游分别有20bp的缺失和“T”缺失。我们确定，上游“T”的缺失以及下游VRN-box的20bp缺失对于确定春季生长习性可能不是关键的，因为它只在gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba在其他显性中无变异和缺失gydF4y2BaVrn1gydF4y2Ba具有突变VRN-box的等位基因，如gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-AgydF4y2Ba^米gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-AgydF4y2Ba^米gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。此外,gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba和gydF4y2Bavrn-A1b.4gydF4y2Ba携带这些突变与冬季生长习惯有关。因此，我们认为VRN-box的多态性决定了携带该基因的植株春化敏感性的降低gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba。然而，我们不能排除VRN-box外突变的可能影响，这些突变与VRN-box内的特定突变有关。VRN-box是由Pidal等人提出的。gydF4y2Ba31gydF4y2Ba作为春化的另一种调控位点。最著名的排列gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba在启动子区域内具有影响春化需求的突变的等位基因(gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-AgydF4y2Ba^米gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-A1dgydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-A1egydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-AgydF4y2Ba^米gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-A1hgydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba)发现所有的VRN-box中都含有突变，如snp、InDels或其完全消除(图2)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba）.这一事实强调了VRN-box序列在转录调控中的重要性gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba在小麦的春化反应中。gydF4y2Ba

总的来说，VRN-box的多态性主要由A-tract和C-rich区域的突变决定。我们的研究假设这两个区域的突变都会影响gydF4y2BaVrn1gydF4y2Ba突变体VRN-box的植株在春化需求和开花时间上存在差异gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.VRN-box的5 '端包括T-repeat和A-tract序列。Yan等。[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba指出，尽管该序列与TATA-box有显著的相似性，但该区域似乎不太可能在起源中起重要作用gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba转录，因为显性等位基因，包含这个区域的缺失有相似的gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba完整基因的转录水平。事实上，根据Bucher先前提出的权矩阵，a -束和T-repeat区域的包围区域(“TTAAAAA”)与TATA-box具有良好的相关性[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。此外，当分析超过1500 bp的5 ' UTR时，该序列被识别为TATA-boxgydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba利用多个独立的工具预测植物启动子，如TSSP [gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]， nsite-pl [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]及PlantCARE [gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。在最后一种情况下，序列“TTTAAAAA”被确定为for的核心启动子元件gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba甘油醛-3-磷酸脱氢酶gydF4y2Bagpc2gydF4y2Ba)基因。尽管如此，VRN-box内占主导地位gydF4y2BaVrn-A1dgydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-A1egydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-AgydF4y2Ba^米gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba等位基因被完全删除。这些等位基因的表达可以通过替代启动子的转录起始来解释。可能是位于VRN-box上游的假设的替代启动子的转录或完整VRN-box内启动子的转录被与VRN-box序列结合的假设抑制子阻断。因为只有当VRN-box被突变破坏时，才能实现用替代启动子进行转录。的发起者gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba转录，与基因内可移动元件的插入有关gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba启动子区域和内含子-1，或第一个内含子内的大缺失，尚不完全清楚。gydF4y2Ba

通常假设蛋白质对DNA的亲和力涉及目标序列内核苷酸的加性贡献。然而，固有DNA结构的序列依赖特征及其可变形性是所谓的“间接读出”的组成部分，这是特定蛋白质-DNA识别的非加性的主要来源[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。例如，包含3-4个连续腺嘌呤的TATA盒子具有刚性的上下文无关的合作结构，这可以用最近邻的非加性蛋白质结合模型来最好地描述[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。根据该模型，TATA-binding protein (TBP)/TATA-box系统是一种特定的蛋白质-DNA复合物，在极端情况下使用DNA构象，相互作用主要通过“间接读出”[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。特别是在TBP识别TATA盒的结构信号中，可以区分TATA盒中间的螺旋扭转角和全局DNA柔韧性的识别[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。然而，在本研究揭示的A-tract多态性中，由于A-tract (additive component)的核苷酸序列(长度)决定了该序列区域(non-additive component)的DNA分子的柔韧性和空间结构(形状)，因此不能明确区分加性和非加性成分。gydF4y2Ba

冬季和春季的变种gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba，而且gydF4y2Bavrn-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba在VRN-box的a区中，只有一个或几个snp存在差异，它们与春化需求和开花时间的差异密切相关。因此，假设VRN-box内A-tract的多态性对调制的作用很大gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba表达式。到目前为止，我们已经明确地知道，由于其独特的结构和影响内在DNA曲率的能力，a -束提供了一种通用的遗传机制，可以通过不同的转录因子来调节启动子活性，并以可预测的方式微调表达，其分辨率甚至可以比通过改变转录因子位点获得的分辨率更精细[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]。这种启动子元件的功能主要取决于其内在结构，而不是与序列特异性dna结合蛋白的相互作用[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]。本研究表明，VRN-box内a -tract的多态性伴随着DNA分子曲率和柔韧性的变化(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.因此，不能排除由VRN-box内a -tract突变决定的DNA曲率和柔韧性的变化，影响VRN-box内(或侧翼区域)的调控DNA序列与下调转录的假设蛋白质或蛋白质复合物的结合强度gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba。例如，正如先前在CArG-box中所显示的那样，在CArG-box区域两侧存在的a -束可以促进DNA在mads结构域转录因子结合上的环化，这反过来可能有助于高阶复合物的DNA结合特异性[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。另一方面，分子动力学模拟和实验数据显示，a通道的小凹槽是一个高度水合的位点，这表明这些步骤在蛋白质- dna相互作用过程中具有作为氢键位点的潜力[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

VRN-box中富c段的重要性也不能排除。“T- > C”的转变只在gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba因此被检测为“spring”(gydF4y2BaVrn-A1b.1gydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-A1b.2gydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-A1b.5，Vrn-A1b.6gydF4y2Ba)和“冬天”(gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba，gydF4y2Bavrn-A1b.4gydF4y2Ba)变异。然而，先前的研究表明，基因中有20个bp的缺失gydF4y2BaVrn-AgydF4y2Ba^米gydF4y2Ba1gydF4y2Ba推动者与春季生长习惯有关[gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba]。该缺失包括VRN-box中部分富C区域(C3代替C4TC4)，包括下游12 bp的“T- > C”过渡位点。本研究揭示了具有相同等位基因的材料之间约30天的差异gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B3gydF4y2Ba基因，但vrn -box的差异gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba在富C片段中只有一个SNP(“T- > C”转变)(gydF4y2BaVrn-A1b.5gydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba等位基因)的差异是显著的，具有完整富c区的品种的开花表型更晚(gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba等位基因)。此外，显性等位基因gydF4y2BaVrn-A1b.6gydF4y2Ba不同于隐性gydF4y2Bavrn-A1b.4gydF4y2Ba在c -富段只有一个SNP。几乎所有的显性等位基因gydF4y2BaVrn1gydF4y2Ba突变的VRN-box在富含c的片段内携带突变(图2)。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba）.只有gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba有一个完整的富含c的区域，这与开花时间较晚有关。这些数据强调了VRN-box中富含c的序列在抑制基因表达中的重要性gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba转录。众所周知，富含鸟嘌呤和胞嘧啶的DNA区域能够形成非规范的核酸亚结构构象，包括四链DNA二级结构，即g -四重体和i-基序。这些结构通过调控转录活性参与基因表达的控制[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]或转录后调控[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]。因此，可以假设VRN-box富含c的区域调节gydF4y2BaVrn1gydF4y2Ba通过形成四重结构进行转录，四重结构被“T- > C”转变破坏(对于gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba)或由于核苷酸序列几乎完全缺失而无法形成(为gydF4y2BaVrn-AgydF4y2Ba^米gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)伴随的转录激活gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba。例如，C-MYC(人类癌基因)启动子g -四重体的突变不稳定导致更大的转录活性，这是由于dna -蛋白质复合物的不稳定，其中蛋白质是转录抑制因子[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]。此外，还有一种观点认为g -束的转录特性与a -束的转录特性几乎相同[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]。有趣的是，根据生物物理稳定性研究，g -四重构象和i-基序构象的形成导致近端双工区域的不稳定[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba这可能是VRN-box中富含c段和a束之间相互作用的基础。虽然与四重基序的相似性较低，但VRN-box的富c区域(以及VRN-box下游20 bp的缺失)gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba等位基因)也与一个核心启动子元件有关，即所谓的Y-Patch，这是一个经常在植物TATA盒启动子中发现的富含ct的区域[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]。例如，大约50%的水稻核心启动子含有一个或多个y - patch [gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba对六倍体和四倍体小麦进行了基因分析。在调查过程中，发现了gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和三个启动子序列变体gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba被确定。为了在PCR片段的PAGE中检测这些变异，优化了低温和室温的电泳条件。的新等位变异gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba与以前已知的相比，本文所确定的更为常见gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba等位基因。假设A-tract在VRN-box内的多态性gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba基因与小麦春化需求和开花时间的调控有关。此外，很明显，富c段和邻近的a束都有助于VRN-box的功能。gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba与春小麦提早开花有关。综上所述，我们的研究结果不仅丰富了小麦育种的遗传来源材料，而且为更好地理解小麦基因的调控机制提供了一组天然突变体gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba小麦中的表达。gydF4y2Ba

植物材料gydF4y2Ba

对来自57个国家和不同生态地理区域的5个六倍体和6个四倍体小麦品种共178份材料进行了调查gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表S1，附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba表2)。六倍体种(基因组BBA)gydF4y2Ba^ugydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^ugydF4y2BaDD)包括gydF4y2Bat . speltagydF4y2BalgydF4y2Bat .玛莎gydF4y2BaDekap,gydF4y2Bat . vaviloviigydF4y2BaJakubz,gydF4y2Bat .紧统gydF4y2Ba宿主gydF4y2Bat . sphaerococcumgydF4y2Ba珀西瓦尔。四倍体种(基因组BBA)gydF4y2Ba^ugydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^ugydF4y2Ba)由…组成gydF4y2Bat .硬质gydF4y2BaDesf。gydF4y2Bat . turgidumgydF4y2BalgydF4y2Ba供试gydF4y2BalgydF4y2Bat . carthlicumgydF4y2Ba·涅夫斯基,gydF4y2Bat . dicoccumgydF4y2Ba双门衣柜和gydF4y2Bat . dicoccoidesgydF4y2Ba科恩。种质资源来自美国国家植物种质系统(NPGS)和乌克兰国家植物遗传资源中心。gydF4y2Ba

实验植物在光周期控制的温室中生长，自然光16小时(长日条件)。对每一种入种的花期进行登记。在试验结束时(120 d)未达到茎伸长的植株被认为具有冬季生长习惯。gydF4y2Ba

DNA提取及PCR扩增gydF4y2Ba

采用改良的ctab法提取4日龄小麦幼苗的总DNA [gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]。PCR反应包括:DNA (~40 ng)， Tris-HCl (pH 8.8) 20 mM, NH 10 mMgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba）gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 2.6 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 250 μM dNTPs, 1.5% DMSO，每个引物3 ng/uL, 0.05 U/uL taq -聚合酶。采用以下程序进行PCR:在94°C (2 min)下初始变性;30个周期的扩增:94°C (10 s)，退火(10 s)， 74°C (50 s或1.5 min的扩增gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba然后是3个循环:退火(10 s)， 74°C (40 s)，最后延伸72°C，持续3分钟。所有引物的进一步详细信息，包括退火温度，见表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba。gydF4y2Ba

聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶电泳gydF4y2Ba

的扩增产物gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba第一个内含子,gydF4y2BaVRN-B3gydF4y2Ba的等位基因和变异gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba在1.38 TBE缓冲液(123 mM离子强度)中，使用6.6%非变性聚丙烯酰胺(PAA)凝胶(单/双丙烯酰胺比82:1)，在室温下，在6 V/cm下分离，直到条带迁移到凝胶长度的50 - 70%。的等位基因变异的检测gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba的PCR片段gydF4y2BaVRN1gydF4y2Ba在低温和室温条件下，优化了聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)启动子区的条件，使其在这些条件下的分辨率损失最小(另附文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.因此，在低电场(2.5 V/cm)和高离子强度(123 mM，凝胶中的x1.38 TBE)条件下，在室温下进行6.6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，在低温(10-20°C)和高电场强度(5-10 V/cm)下进行电泳，在短时间内获得最佳结果。PCR片段在PAA凝胶中的可视化使用改进的银染色方案[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]。琼脂糖凝胶电泳用1.5%琼脂糖在x1 TBE缓冲液中进行。PCR产物用溴化乙锭染色，并在紫外光下观察。gydF4y2Ba

PCR片段的克隆与测序gydF4y2Ba

PCR扩增子在1.5%琼脂糖凝胶上分离，使用GeneJET凝胶提取试剂盒(Thermo Scientific)进行凝胶提取，并根据制造商的说明将DNA片段连接到pGEM-T (Promega)中。质粒DNA转染JM109gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba能态细胞(L2001, Promega)。在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的培养基上，用白-蓝选择法检测含有携带外源DNA片段插入的质粒的转化细胞。用通用pUC引物(正向和反向M13引物)PCR检测阳性菌落是否存在克隆PCR产物，然后在琼脂糖凝胶上分离和可视化PCR产物。质粒DNA提取使用GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific)，测序pcr使用ABI3700生物分析仪(Applied Biosystems)，按照制造商的方案。荧光标记的延伸产物在HiDi甲酰胺(应用生物系统)中沉淀和重悬。gydF4y2Ba

命名法gydF4y2Ba

的不同序列变体gydF4y2BaVrn-A1bgydF4y2Ba等位基因是根据一个数字指数来指定的，即gydF4y2Ba责任gydF4y2Ba”、“gydF4y2Bab.2gydF4y2Ba”等。的变体采用了类似的约定gydF4y2BaVrn-A1agydF4y2Ba，通过一定长度的PCR片段的特定组合来鉴定。的序列变体gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba启动子区域用“f”、“m”和“s”表示，分别表示相关PCR片段在PAA凝胶中的相对迁移速度为“快”、“中”或“慢”。这些序列变体结合起来不同gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba等位基因(gydF4y2Bavrn-B1gydF4y2Ba，gydF4y2BaVrn-B1agydF4y2Ba和gydF4y2BaVrn-B1cgydF4y2Ba)除了gydF4y2BaVrn-B1 (ins)gydF4y2Ba。的部分核苷酸序列gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba(启动子区)，并存入GenBank，编号:KR782255 (gydF4y2BaVrn-A1a.2gydF4y2Ba)、km016789 (gydF4y2Bavrn-AgydF4y2Ba^米gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)、km016790-km016792 (gydF4y2BaVrn-A1igydF4y2Ba)、kt361213 (gydF4y2BaVrn-A1egydF4y2Ba)， km047646 (gydF4y2BaVrn-A1b.1gydF4y2Ba)、km047641-km047645 (gydF4y2BaVrn-A1b.2gydF4y2Ba)、km047647-km047650 (gydF4y2Bavrn-A1b.3gydF4y2Ba)， km047651 (gydF4y2Bavrn-A1b.4gydF4y2Ba)， km047652 (gydF4y2BaVrn-A1b.5gydF4y2Ba)， kt692944-kt692945 (gydF4y2BaVrn-A1b.6gydF4y2Ba)， kr782252 (gydF4y2BaVRN-B1.sgydF4y2Ba)， kt361212 (gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba)， kr782253-kr782254 (gydF4y2BaVRN-B1.fgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

数据分析gydF4y2Ba

为了估计固有曲率和局部弯曲角度，生成了描述轮廓路径、中心轴和磷酸盐轨迹的三维DNA模型。重建DNA轨迹的计算和DNA曲率的评估是根据先前发表的方法进行的gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba部分[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba])。通过PyMOL分子图形系统，Version 1.7.2 Schrödinger, LLC对结构进行可视化。根据先前发表的二核苷酸和四核苷酸步骤的相关参数评估DNA分子的柔韧性分布[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]。使用cluster W [gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]。的gydF4y2Bat . aestivumgydF4y2BaESTs数据库(UniGene Build #63)包含1551792个序列，178464个簇，从NCBI (gydF4y2Baftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/UniGene/Triticum_aestivum/Ta.seq.all.gzgydF4y2Ba）.使用BLAST+软件进行序列相似性搜索[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]。利用RNA结构web服务预测RNA二级结构[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

我们非常感谢Carly Schramm对手稿的评论和英文润色。分析gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba小麦六倍体和四倍体的启动子区及其序列分析gydF4y2BaVrn-A1b.6gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba改型由俄罗斯科学基金会(项目号14-14-00161)支持。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 俄罗斯联邦细胞学和遗传学研究中心植物分子遗传学和细胞遗传学实验室，俄罗斯新西伯利亚Lavrentyeva大道10号，630090gydF4y2Ba

   alexander Muterko和Elena SalinagydF4y2Ba

2. 植物育种和遗传研究所-国家种子和品种调查中心，共同和分子遗传学系，Ovidiopolskaya路3号，敖德萨，65036，乌克兰gydF4y2Ba

   Alexandr MuterkogydF4y2Ba

3. RSE“国家生物技术中心”植物基因组学与生物信息学实验室，Sh. Valikhanov 13/1，哈萨克斯坦阿斯塔纳010000gydF4y2Ba

   Ruslan时间表gydF4y2Ba

4. 赫尔辛基大学生物技术研究所，MTT植物基因组学实验室，3号生物中心，Viikinkaari 1号65号信箱，芬兰赫尔辛基，00014gydF4y2Ba

   Ruslan时间表gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaAlexandr MuterkogydF4y2Ba。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

AM进行了实验，开发了新的检测方法gydF4y2BaVRNgydF4y2Ba等位基因，序列gydF4y2BaVrn-A1b.6gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1.mgydF4y2Ba等位基因，并写了手稿。克隆RK并测序gydF4y2BaVRN-A1gydF4y2Ba和gydF4y2BaVRN-B1gydF4y2Ba对手稿的修改和准备做出了贡献。EA修改了稿件，参与讨论并参与了稿件的准备。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

声明gydF4y2Ba

本文由俄罗斯科学基金会资助发表(项目号14-14-00161)。gydF4y2Ba

这篇文章已经作为gydF4y2BaBMC植物生物学gydF4y2Ba2015年第16卷增刊1:PlantGen 2015会议论文选集:植物生物学。该补充的全部内容可在网上获得gydF4y2Bahttp://www.biomedcentral.com/bmcplantbiol/supplements/16/S1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

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