鉴定，表达和功能分析GydF4y2BacleGydF4y2Ba萝卜的基因（GydF4y2Ba萝卜GydF4y2BaL.）存储根GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

萝卜(GydF4y2Ba萝卜GydF4y2BaL.）是一种普遍的农业植物，其由于广泛的二次生长而形成储存根，这涉及嵌入盲钩状的分化和二次导电组织的分化。与模型对象密切相关GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba，萝卜是研究二次生长和储存根系发展过程的合适模型。Cle Peptides是一组肽植物激素，其在初级商品的调节中起重要作用，例如Sam，Ram和Procabium以及二级公司。然而，迄今尚未研究Cle肽在储存根部形成期间根系的横向生长的作用。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在目前的工作中，我们研究了Cle Peptides在萝卜中储存根的发展中的作用。我们已经确定了18岁GydF4y2BacleGydF4y2Ba萝卜基因（GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba）并在各种植物器官中测量它们的表达，也以不同的根本发展阶段GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba和GydF4y2Ba获得raphanistrumGydF4y2Ba-它的近亲，不形成存储根。我们观察到基因表达水平显著下降GydF4y2BaRSCLE1.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba，以及基因表达水平的多变增加GydF4y2BaRSCLE19.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba在次生根生长期间GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba但不是在GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba．表达式GydF4y2BaRSCLE 2.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba在GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba根本被限制在某些类型的组织中GydF4y2BaRSCLE1.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba在整个根本中表达。过表达的实验GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba或用合成CLE肽处理萝卜植物揭示了CLE19和CLE2增加了木质元件的数量，并且CLE41诱导次级木耳中的额外夹焦灶的形成。表达水平GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba响应外源性细胞蛋白的反应强烈降低，而植物素会导致戏剧性增加GydF4y2BaRSCLE19.GydF4y2Ba表达水平和减少GydF4y2BaRSCLE41GydF4y2Ba表达。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的数据允许我们假设GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba基因在贮藏根的发育中GydF4y2Ba萝卜GydF4y2Ba，例如，GydF4y2BaRSCLE19.GydF4y2Ba可能在Xylem差异化的过程中的过程中发挥作用GydF4y2BaRSCLE41GydF4y2Ba刺激挂钩活动。GydF4y2Ba

CLE (CLAVATA3/胚乳周围区)多肽植物激素家族包括小的(小于15 kD)可移动多肽。成熟的CLE肽被翻译为约100个氨基酸残基的前体，包括唯一保守的12-14 aa c端CLE结构域[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］．CLE肽与CLV1样受体蛋白激酶结合并触发信号转导的途径差，最终改变表达水平GydF4y2BaWOX.GydF4y2Ba基因，在不同的分页中的干细胞库中央调节因子[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］．在各种植物物种中发现Cle肽[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba还在植物王国之外，在一些寄生线虫中[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba基因组含有32.GydF4y2BacleGydF4y2Ba具有不同空间和时间表达模式的基因[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．大多数CLE多肽在分生组织中的功能是负调控干细胞增殖，从而维持分生组织的大小。一个例外是一小组类似TDIF(管状细胞分化抑制因子)的CLE多肽，它们不抑制分生组织中的细胞增殖，甚至不刺激原形成层和形成层中的细胞增殖[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．根据 [GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba，不抑制分生组织细胞增殖的CLE多肽结合在B组，而其他CLE多肽形成a组。B-type CLE多肽与其他CLE多肽的不同之处在于其CLE结构域的特定氨基酸组成和翻译后修饰的某些特征[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．在32个Cle percides中GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，密切相关的CLE41，CLE44和CLE42属于B组[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．一些GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaCLE peptide CLE peptide CLE peptide CLE peptide CLE peptide CLE peptide CLE peptide CLE peptide CLE peptide CLE peptideGydF4y2Ba9.GydF4y2Ba];CLE40在RAM中具有类似的功能[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba];CLE41/CLE44控制原形成层和形成层的发育[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］．此外，几种Cle肽调节其他类型的商品，例如，A型CLES MTCLE13和PSCLE13调节结核商品的开发GydF4y2BaMedicago Truncatula.GydF4y2Ba和GydF4y2BaPisum sativum.GydF4y2Ba分别 [GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．此外，应该调节Cle肽，如早期胚胎发生，如早期胚胎发生[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba或船只发展[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．考虑到所有这一切，我们可以假设CLES可以作为萝卜储存根部开发的监管机构。GydF4y2Ba

萝卜(GydF4y2Ba萝卜GydF4y2BaL.，2GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 2XGydF4y2Ba = 18) is an important vegetable crop because of its edible storage root. Several variations of cultivated radish are known, e.g. cherry radish (R. SativusGydF4y2BaL. var。GydF4y2Ba雷达加拉GydF4y2BaPERS），油萝卜（GydF4y2BaR. SativusGydF4y2BaL. var。GydF4y2Ba识别鉴定GydF4y2Ba），饲料萝卜（GydF4y2BaR. SativusGydF4y2BaL. var。GydF4y2Bacaudatus.GydF4y2Ba)、黑萝卜(GydF4y2BaR. SativusGydF4y2BaL. var。GydF4y2Ba尼日尔GydF4y2Ba)、大根萝卜或白萝卜(GydF4y2BaR. SativusGydF4y2BaL. var。GydF4y2BaLongipinnatusGydF4y2BaBailey）。根据大多数意见，GydF4y2BaR. SativusGydF4y2BaL.原产于野萝卜GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2BaL.或通过杂交之间来源的GydF4y2BaR. Maritimus.GydF4y2Ba和GydF4y2BaR. Landra.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］．近年来，radishbase [GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba[萝卜基因组数据库是开发的[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba]，并对栽培萝卜和野生萝卜表达序列标签进行综合分析[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．遗传集合GydF4y2BaR. SativusGydF4y2BaL. var。GydF4y2Ba雷达加拉GydF4y2Ba自1970年以来，PERS维持在圣彼得堡州立大学（俄罗斯）。该收集来自于40多代的近亲繁殖的近亲繁殖的三种萝卜品种（Saxa，Virovskyi Belyi，Ledianaya Sosulka）的单一植物。目前，该系列包括33个自相互得的高度自交系;其中一些表明了不同的形态异常（例如，侏儒症，农业疏透生长，肿瘤形成等）[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

与其紧密相对不同GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba那GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba具有特殊的发展特征，即形成存储根（所谓的裁剪根）。因此，萝卜是研究储存根系发展机制的透视模型。众所周知，萝卜作物根起源于根的胚源和上部[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]由于嵌合活动的次级增厚[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］．二次增厚涉及血管挂钩的增殖和次级木质和韧皮型向外的分化，并向外向外。在萝卜萝卜的情况下，韧皮肌和木耳分化的比例朝向木质（所谓的木质型储存根）。结果，成熟的萝卜储存根由由狭窄的爪区，继发阶段，次级絮凝带和源自周围的次级皮层的外层的大区域组成。GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］．萝卜储存根中的次级XYLEM区域非常清晰地分离成中央和周边部件。次级木耳区的周边部分包括由小型细胞厚壁薄壁细胞排包围的血管，其主要是机械功能（机械实质）;血管和机械实质形成带，由填充有淀粉颗粒的宽阔的薄壁薄壁细胞的宽径向射线分开[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba］．次级Xylem的中央部分GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba包括更多珍稀血管，位于薄壁储存实质的质量（图。GydF4y2Ba1B.GydF4y2Ba)．一些研究人员(GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]注意到萝卜储存根中的次级木质区（主要是次级Xylem的内部区域）还包括许多小焦点的嵌形型二级公司（所谓的“共同焦点”），其在有限的时间内保持并产生少量的三级导电元件。另一方面，GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba，可推荐的祖先GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]展示较少广泛的二级增厚，并且不形成储存根。解剖结构的主要差异GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba和GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba是少数Xylem的广泛区，在根系中储存实质的细胞明显更少GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

我们调查的主要目标是确定Cle Peptides在萝卜储存根系中的作用。在我们确定的本工作中GydF4y2BaRaphanus Sativus RSCLE.GydF4y2Ba基于对应的同源性的基因GydF4y2Ba拟南芥天气GydF4y2Ba基因。然后，我们分析了表达式GydF4y2Barscle.GydF4y2Ba幼苗不同部分的基因，以及在不同发展阶段的根部GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba它形成存储根和GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba不。此外，我们还研究了过度表达的影响GydF4y2Barscle.GydF4y2BaA-和B系列的基因以及外源应用Cle肽对萝卜储存根系发育的影响。我们的数据建议参与GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba萝卜储存根的发展中的基因。最后，我们研究了外源性细胞素素和养蛋对几种A-和B型表达的影响GydF4y2Barscle.GydF4y2Ba基因。结果表明，cle -多肽、细胞分裂素和生长素在萝卜贮藏根发育过程中可能存在相互作用。GydF4y2Ba

的识别GydF4y2BaRaphanus sativus cle.GydF4y2Ba（GydF4y2Barscle.GydF4y2Ba)基因GydF4y2Ba

基因组GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba包含32GydF4y2BacleGydF4y2Ba基因[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]，每个人都有自己独特的表达式模式[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．我们确定了大部分地区的萝卜同源物GydF4y2Ba拟南芥天气GydF4y2Ba表达的基因，根据[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]在根中观察到（除了GydF4y2Baatcle6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba)．总的来说我们已经确定了16GydF4y2Barscle.GydF4y2Ba对同源的基因GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba一种GydF4y2BacleGydF4y2Ba基因（GydF4y2BaRSCLE1.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba和40）和2GydF4y2Barscle.GydF4y2Ba是同源的GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaB型GydF4y2BacleGydF4y2Ba基因（GydF4y2BaRSCLE41GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaRSCLE42GydF4y2Ba)．CDS(编码序列)GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba鉴定证明了相应的身份72.9-90.7％GydF4y2BaAtCLEGydF4y2Ba基因（表格GydF4y2Ba1GydF4y2Ba还有）GydF4y2BacleGydF4y2Ba-like序列GydF4y2BaBrassica Rapa.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba］．但是，我们未能找到萝卜同源物GydF4y2Baatcle6.GydF4y2Ba那GydF4y2Baatcle7.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Baatcle44.GydF4y2Ba基因：基于相应基因设计的所有底漆集GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba没有给出任何PCR产物对萝卜DNA或退火其他密切相关GydF4y2Barscle.GydF4y2Bas。因此，我们认为没有同源物GydF4y2BaCLE6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba克莱7.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaCLE44GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba萝卜GydF4y2Ba基因组。与之同源的序列GydF4y2Baatcle6.GydF4y2Ba那GydF4y2Baatcle7.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Baatcle44.GydF4y2Ba基因也缺乏确定的GydF4y2BaBrassica Rapa.GydF4y2Ba序列[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

预测大多数弦域的序列GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba与那些相似GydF4y2Baatcles.GydF4y2Ba．例外是GydF4y2BaRSCLE11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba谁的巨大域可能与之不同GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba一种或两种氨基酸(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．像GydF4y2BaAtCLEGydF4y2Ba基因，GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba基因序列较短，编码序列长度为240 ~ 330 bp。大多数GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba， 像GydF4y2Baatcles.GydF4y2Ba，缺乏内含子，除了GydF4y2BaRSCLE40.GydF4y2Ba它有两个内含子，就像它的同源物一样GydF4y2Baatcle40.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

根据以往的数据，在区域内，取代第6位的甘氨酸残基对CLE多肽功能的影响最为显著GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］．第六位的甘氨酸在所有人的CLE-畴中受到高度保守GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Bacle peptides;唯一的例外是Atcle27，在Cle-域的第六位具有半胱氨酸。然而，所有鉴定的萝卜根部含有Cle-结构域的第六位的保守甘氨酸残基。GydF4y2Ba

QRT-PCR分析GydF4y2Barscle.GydF4y2Ba基因表达GydF4y2Ba

使用QRT-PCR方法，我们分析了GydF4y2Barscle.GydF4y2Ba不同器官的基因表达GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba和GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba幼苗。大多数GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba在植物的各个部位都有表达，但也有部分仅在某一植物器官中有表达。GydF4y2BaRSCLE1.GydF4y2Ba那GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaRSCLE13GydF4y2Ba展示了根特定的表达式（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1和附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S1)。根据文献资料[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba对应)GydF4y2BaAtCLEGydF4y2Ba基因在幼苗中具有类似的表达模式。在研究中GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba，表达GydF4y2BaRSCLE16.GydF4y2Ba根和下胚轴是最强的吗GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba幼苗，而GydF4y2BaRSCLE4.GydF4y2Ba和GydF4y2BaRSCLE17.GydF4y2Ba是表达最弱的基因(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S1)。一些表达模式GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba略不同GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba和GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Baseedlings-e.g。GydF4y2BaRSCLE19.GydF4y2Ba在根的高水平表达GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba但不是在根的根源GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

然后分析了表达式GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba在两条不同的线根中的根和下丘脑GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba而在GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba在不同的发育阶段：7日龄幼苗，15株和30天的旧植物（相应的阶段1,2,3）。在GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba四个叶子阶段为15天的植物，储存根部形成通过广泛的根增厚，在莲甜阶段根增厚的30天老植物中达到最大值[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］．与此相反GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba那GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba没有形成贮藏根，因此在相同的发育阶段，根的增厚不那么明显，这给了我们理由来检查是否GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba和GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba表达水平有所不同GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba

我们揭示了一些GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba在分析的15-和30天植物的根部和下胚轴中显着增加或减少GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba线，但不是在根和缺口中GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba2a，bGydF4y2Ba和附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：图S2）。基因，其表达增加了十倍和更多的增稠储存根GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba，包括一个型cle基因（GydF4y2BaRSCLE19.GydF4y2Ba)(韦尔奇的GydF4y2BaT.GydF4y2Ba-测试GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-Value <0.001;GydF4y2BaNGydF4y2Ba= 3)， 1个b型CLE基因- (GydF4y2BaRSCLE41GydF4y2Ba)(韦尔奇的GydF4y2BaT.GydF4y2Ba-测试GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-Value <0.001;GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 3). At the same time, expression levels of other five A-typecleGydF4y2Ba基因 -GydF4y2BaRSCLE1.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba(韦尔奇的明显减少GydF4y2BaT.GydF4y2Ba-测试GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-值分别为0.0153,0.0359,0.0045，<0.0001，<0.0001;GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 3) during root thickening inR. SativusGydF4y2Ba植物(图。GydF4y2Ba2a，bGydF4y2Ba和附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：图S2）。GydF4y2Ba

更详细的表达分析GydF4y2BaRSCLE1.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba我们解剖了几个区域GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba存储根（中央（1）和外围（2）次级Xylem，以及Phloem + Cambium（3）），然后分析GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba这些区域的表达。我们发现了GydF4y2BaRSCLE1.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba在萝卜根的所有组织中表达，而GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba具有特定于区域的表达式模式。GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba在次级Xylem中特别表达，GydF4y2BaRSCLE41GydF4y2Ba在Phloem和Clecbium区表达。有趣的是所有研究的表达GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba在次级公司焦点中揭示，该焦点在萝卜储存根的Xylem的中心部分开始（图。GydF4y2Ba2CGydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

根据我们的结果，三个GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba（GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba）特异性表达在某些组织中提供次级生长的组织（GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba在次级木耳中表达，GydF4y2BaRSCLE41GydF4y2Ba在韧皮和挂钩中表达。此外，它们的表达水平的显着变化与广泛的根增厚的开始相关GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba．因此，我们认为这些基因可能参与储存根系的调节。GydF4y2Ba

在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，23的23个GydF4y2BaAtCLEGydF4y2Ba编码型Cle肽的基因也以根表达，其中一些表明了组织特异性表达模式[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．所有GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba编码B型CLE肽的基因（例如GydF4y2Baatcle41.GydF4y2Ba）在包括根部的所有植物器官的血管组织中表达[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba];GydF4y2Baatcle19.GydF4y2Ba和GydF4y2BaBncle19.GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba和GydF4y2Ba芸苔GydF4y2Ba根在面向protoxylem杆的血管细胞中特别表达[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2Baatcle2.GydF4y2Ba- 在侧面根的原始原始中[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

改变表达水平的影响GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba和外源Cle肽治疗萝卜储存根系GydF4y2Ba

许多调查人员研究了由改变的表达水平引起的植物开发的不同方面的变化GydF4y2BacleGydF4y2Ba基因，或通过外源Cle肽治疗植物。这些研究中的大多数主要集中在SAM和RAM活动中[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]他们中的一些人还考虑Cambium活动和血管系统发展[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］．这些实验表明，B型Cle肽（CLE41,42和44 inGydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba）通过活化刺激嵌胞细胞的增殖GydF4y2BaWOX4.GydF4y2Ba基因表达，并抑制它们分化为木质。另一方面，很明显，一些型Cle肽也参与血管系统的发展;例如过度表达GydF4y2BaCLE19GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba和GydF4y2Ba芸苔GydF4y2Ba刺激Xylem的分化，导致Xylem“岛屿”在花器官中形成[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba];atcle10抑制血管形成GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba通过抑制两种类型的表达的根GydF4y2Ba拟南芥反应监管机构GydF4y2Ba（GydF4y2Baarr.GydF4y2Bas），GydF4y2BaARR5.GydF4y2Ba和GydF4y2BaARR6.GydF4y2Ba，其产品充当细胞分裂素信号传导的负调节剂[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

因此，A-和B型CLE肽可以控制嵌胞细胞增殖与木质的分化之间的平衡。然而，同时同时过表达A-和B型GydF4y2BacleGydF4y2Ba来自两组的Cle肽的基因或植物处理导致比仅B型的过度表达更明显的刺激刺激作用GydF4y2BacleGydF4y2Ba基因[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．因此，A-和b -型cle相互作用对维管系统发育和根次生生长的调控比单纯拮抗更为复杂。GydF4y2Ba

我们已经研究了几个过度表达的影响GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba，编码A型（GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba）和b型（GydF4y2BaRSCLE41GydF4y2Ba）萝卜中次级结构上的CLE肽。我们也对待GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba和GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba植物通过合成CLE多肽CLE2, CLE19和CLE41。这两个实验提供了非常相似的结果:植物的根中有一定数量的CLE肽GydF4y2BacleGydF4y2Ba外源CLE的过度表达或治疗）改变了储存根组织的发育（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

首先，根源GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba15和30天的老植株，过度表达GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba或经过CLE多肽处理后，某些次生木质部成分-机械木质部薄壁组织的数量发生了变化，这些次生木质部薄壁组织通常与导管相邻。出乎意料的是，次生木质部导管的数量保持不变(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

在萝卜植物的根源中GydF4y2BaRSCLE41GydF4y2Ba通过41通过41处理的过度表达或处理机械木质薄壁蛋白的细胞。我们在萝卜根中观察到的效果相同GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba或由CLE2肽治疗。反过来，GydF4y2BaRSCLE19.GydF4y2Ba过度表达或CLE19肽处理增加了机械木质薄壁细胞的数量（Welch'sGydF4y2BaT.GydF4y2Ba-测试GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-Value = 0.0092;GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 4). Therefore, A-type CLE peptides CLE2 and CLE19 presumably play different roles in the differentiation of secondary xylem elements, mainly of mechanical xylem parenchyma. Earlier, the negative effect of CLE41 on xylem differentiation was observed in拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba];Fiers等人。CLE19还揭示了CLE19对额外木耳岛屿的刺激作用GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba];但先前未观察到克莱2对木瓜分化的影响。GydF4y2Ba

其次，萝卜根带过表达GydF4y2BaRSCLE41GydF4y2Ba或CLE41肽处理增加了次生木质部中心部位的分生灶数量。根据文献资料[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba在萝卜贮藏根形成过程中，部分木质部薄壁组织细胞增殖，形成分生灶，即次生形成层中能够分裂并分化为韧皮部和木质部细胞的小区域。在根源上用过度的表达GydF4y2BaRSCLE41GydF4y2Ba或者用CLE41肽处理这些“共源性焦点”被扩大并且包括小薄壁电池，类似于CEMBIUM的细胞，围绕细胞厚壁的木质薄膜细胞和韧皮细胞的悬浮型细胞（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．因此，在萝卜的储存根中，CLE41可以刺激不仅常规晶虫的增殖，还可以刺激共同焦点中的挂钩细胞。GydF4y2Ba

我们也对待GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba具有外源cle -肽的根。与此相反GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba的作用GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba根结构不太明显，但是，变化的一般趋势是一样的。CLE19P略微增加了机械木质薄壁症的数量，但对照和CLE19处理植物之间的木质元素数量没有统计学意义。CLE41增加了CASBIUM细胞数，然而，在CLE41处理的次级XYLEM中没有观察到额外的CENBIUM焦点以及控制GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba植物。用CLE2P治疗没有造成木质元素数量的任何变化GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba根。我们推测Cle Peptides对根结构的不同影响GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba形成存储根部和GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba可能是由于这些萝卜物种中的继发性发展调节的差异。此外，这两种物种初始不同水平的其他植物激素与Cle-肽相互作用，这也可能导致对外源性肽处理的不同反应。GydF4y2Ba

外源性细胞素素和生长素对杂志表达的影响GydF4y2Barscle.GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba

众所周知，植物素和细胞蛋白是一种调节血管系统和根系二次增厚的发育的两种主要的植物激素组。在主要根源中GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba这些激素表明了分布的互补模式：植物素浓缩在分化的木形中，而CENBIUM和PHLOEM存在细胞蛋白。据信互补的生长素和细胞蛋白分布被认为是适当的血管系统的发展，并且是由细胞蛋白依赖性控制极性养蛋白转运和依然抑制细胞素信号传导的抑制[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba］．Cytokinins对于诱导冠心蛋白酶和晶胞细胞增殖是必要的GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba，生长素对形成层的增殖也是必需的，这可能是由于生长素依赖的控制GydF4y2BaWOX4.GydF4y2Ba基因表达 [GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba］．生长素运输和信号转导成分也在维管细胞规范中起关键作用[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

因此，有两组调节因子控制血管系统和根次级增稠 - 毒素和细胞蛋白的发展以及CLE-肽。它们可能有一些常见的目标-e.g。GydF4y2BaWOX4.GydF4y2Ba基因，从而，它们可以相互作用。GydF4y2Ba

以前，已经报道了一些关于细胞素和Cle-肽或植物蛋白和肽和Cle肽之间的相互作用的数据。在GydF4y2BaM. Truncatula.GydF4y2Ba，发现合成细胞素蛋白BAP对表达的刺激作用GydF4y2Bamtcle12.GydF4y2Ba和GydF4y2Bamtcle13.GydF4y2Ba作为共生结节形成的中央调节剂的基因[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba］．反过来，GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaA型CLE肽10可以通过对ARR基因表达的负调节刺激细胞蛋白信号传导[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］．在米饭中，一种型GydF4y2BacleGydF4y2Ba基因GydF4y2BaOsCLE48GydF4y2Ba由IAA的外源应用诱导表达[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba侧根形成一些GydF4y2Baatcles.GydF4y2Ba由不同的激素 - 氧管，ABA，芸苔类固醇，水杨酸和茉莉酸以及营养和胁迫进行上调，以及营养和胁迫[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba］．然而，关于cle -多肽与其他激素相互作用的机制几乎一无所知。GydF4y2Ba

我们测定了外源生长素(NAA)和细胞分裂素(BAP)处理对其表达的影响GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba在缺苗的根和下半部分的上部GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba幼苗。我们观察了分析的A型表达动态（GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba）和b型（GydF4y2BaRSCLE41GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba）GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba响应细胞素治疗。aGydF4y2Barscles.GydF4y2BaBAP处理后10倍以上显著降低，甚至早于处理后0.5 h，而B组则明显降低GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba响应于BAP没有显着改变（图。GydF4y2Ba4AGydF4y2Ba)．我们还观察到相同的A型和b型的不同表达动态GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba对生长素处理的响应:a型表达水平GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba增加（十倍和更多GydF4y2BaRSCLE19.GydF4y2Ba，小于十倍GydF4y2BaRSCLE2.GydF4y2Ba和GydF4y2BaRSCLE5.GydF4y2Ba），而B型基因的表达（GydF4y2BaRSCLE41GydF4y2Ba和GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba)显著减少(图。GydF4y2Ba4B.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

因此，相同的A-和B型GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba分析证明了响应于蟾蜍蛋白和细胞蛋白的表达动态（Cytokinin似乎抑制了A型表达的表达GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba但对b型没有影响GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba;相反，植物蛋白似乎刺激了型基因的表达GydF4y2BaRSCLE19.GydF4y2Ba并对B型负面调节GydF4y2Barscles.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

我们的结果与血管系统发育中的细胞素素和B型CLES的作用重合，以及养蛋白和A型CLES。众所周知，养羊酸[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]和诸如Atcle19的型cles [GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]刺激木质部分化，而细胞分裂素[GydF4y2Ba37.GydF4y2BaB型cles [GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]是CAMBIUM开发所必需的。考虑到这一点，我们可以假设这三组植物激素可以在植物血管系统的形成和萝卜储存根系的形成期间进行相互作用。GydF4y2Ba

贮藏根的形成机制尚不清楚。在本研究中，我们研究了CLE肽在萝卜贮藏根发育中的作用。我们的数据表明一些CLE肽如CLE19, 41和2可能在这一过程中发挥作用。因此，现有的关于这些多肽在植物发育中的功能的观点可以得到扩展。我们对细胞分裂素和生长素对编码A-和b型CLE多肽基因表达的影响的研究结果，为萝卜贮藏根发育过程中不同植物激素之间的相互作用提供了依据。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

获得raphanistrumGydF4y2Ba以及来自遗传收集的两个相关的近交系数GydF4y2Ba萝卜GydF4y2Ba[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba在本研究中使用了19和27。GydF4y2Ba

植物生长条件GydF4y2Ba

用于qRT-PCR和镜检研究GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba和GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba植物在地上生长。转型为GydF4y2Ba根出杆菌根草杆菌GydF4y2Ba7天老GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba使用在无菌培养条件下生长的幼苗。用于通过外源CLE肽在水培条件下进行处理。所有植物均在21℃和16小时的光周期中生长。GydF4y2Ba

隔离GydF4y2Barscle.GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba

总DNAGydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba使用西甲基三甲基溴化铵（CTAB）方法从萝卜幼苗中分离出[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba］．放大萝卜的碎片GydF4y2BacleGydF4y2Ba基因，设计引物对相应基因的保存区进行PCRGydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba和GydF4y2BaBrassica Rapa.GydF4y2Ba使用Vectornti Advance_10（Invitrogen，美国）计划（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba：表S2）。通过含溴化乙锭（0.1％）的1％琼脂糖凝胶中的电泳分离PCR-产物。根据制造商的说明，使用清理迷你试剂盒（Evrogen，Russia）从凝胶中分离出靶碎片并克隆到Pal-TA Vectory（Evrogen，俄罗斯）。化学富集细胞的转化GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba将菌株DH5α判断为[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba］．在含有100mg / L氨苄青霉素和X-GAL的固化的LB培养基上选择转化体。由质粒细胞克隆（eVerogen，俄罗斯）分离出选定的转化体克隆的质粒DNA，并在SPBU研究园区测序，分子和细胞技术中心。序列对齐GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba使用Vectornti Advance_10（Invitrogen）软件的AlignX程序进行萝卜基因。GydF4y2Ba

存在分析GydF4y2Ba

用Purezol试剂(Bio-Rad, USA)提取总RNA，用氯仿纯化，异丙醇沉淀。RNA颗粒用80%乙醇洗涤三次，在空气流动下在层流箱中干燥，溶解在无菌去离子水中。RNA用DNase (Syntol，俄罗斯)处理，随后用氯仿纯化，0.3 M乙酸钠在乙醇存在下再沉淀，溶解在无菌去离子水中。使用NanoDrop 2000c紫外分光光度计(Thermo Scientific, USA)在260 nm处测量RNA浓度。反转录时，所有样品中使用0.5 μg RNA。RNA逆转录使用“Synthesis of cDNA first chain kit, version with oligo-dT”(Silex-M, Russia)，按照所附方案进行。GydF4y2Ba

QRT-PCR实验在C1000热循环仪（Bio-rad，USA）的CFX-96实时PCR检测系统上进行，EVA绿色嵌入染料用于检测（Syntol，俄罗斯）。设计QRT-PCR的引物被设计成扩增150-220bp片段。所有反应一式三份进行并进行平均。使用伴随软件获得循环阈值，并通过2分析数据GydF4y2Ba^{-ΔΔctGydF4y2Ba}方法 [GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba］．相对表达对组成表达的泛素进行归一化(GydF4y2BaRSUBQ.GydF4y2Ba）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GydF4y2BaRSGAPDH.GydF4y2Ba)基因GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba］．用独立的生物样品重复三次实验。GydF4y2Ba

媒体建设GydF4y2Ba

PCR-碎片放大GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba全长CDS的DNA引物GydF4y2BaRsCLER2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba被克隆到Pentr / D-Topo载体（Invitrogen，USA）和之后，使用LR克隆酶（Invitrogen，USA）转移到过表达的PB7WG2D载体（Ghent，Belgium）。这个矢量包含GydF4y2BaGFP.GydF4y2Ba构建启动子下的基因用于转基因器官选择。GydF4y2Ba

构建体被引入GydF4y2Ba根出杆菌根草杆菌GydF4y2BaMSU440菌株通过电穿孔使用Eppendorf Eporator®(Eppendorf，德国)。GydF4y2Ba

根出杆菌根草杆菌GydF4y2Ba- 介导的植物改造GydF4y2Ba

答:rhizogenesGydF4y2Ba-介导的植物转化如前所述进行[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba］．获得无菌GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba幼苗，种子灭菌7分钟，混合物的30％过氧化氢和95％乙醇（1：1），然后用无菌蒸馏水洗涤，并在Murashige-skoog培养基上进行萌发[GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba］．采用荧光立体显微镜Leica M205FA(德国)筛选转基因gfp阳性根，剪断所有gfp阴性(非转基因)根，置于蛭石盆栽中，21℃，16 h光周期培养。大约7天后，将植株移栽到有土的花盆中。30天后(莲座期)采收根系并进行分析。GydF4y2Ba

用合成cle peptides植物处理GydF4y2Ba

用于用合成CLE肽治疗，GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba植物在水培系统中生长，如[GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba］．CLE2P，CLE19P和CLE41P用于治疗植物，用CLE41DEF肽用替代保守的G6残基和非羟基化的脯氨酸残基使用作为对照（附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba：表S3）。从ATG服务基因（俄罗斯）获得了合成肽CLE2P，CLE19P，CLE41P和CLE41DEF 95％纯度。将所用的所有肽稀释至10mm的储备溶液并储存在-20℃。对于植物处理，将股票溶液加入到水培培养基中以加工浓度10μm，并在培养基中培养植物7天。GydF4y2Ba

用生长素和细胞分裂素处理幼苗GydF4y2Ba

用于用植物素或细胞蛋白治疗，无菌GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba将7天旧的幼苗种植在用10mm的合成型助素1-萘酰胺酸（NAA）或合成细胞蛋白6-苄基氨基嘌呤（BAP）上提供的固体MS培养基上，生长为0.5,2,24和48小时。在没有激素的培养基上种植的幼苗用作对照。GydF4y2Ba

组织学分析GydF4y2Ba

土壤种植的根源GydF4y2BaR. SativusGydF4y2Ba和GydF4y2BaR. RaphanistrumGydF4y2Ba植物7GydF4y2Ba^TH.GydF4y2Ba，15GydF4y2Ba^{钍，GydF4y2Ba}30.GydF4y2Ba^TH.GydF4y2Ba3 %多聚甲醛、0.25 %戊二醛、0.1% Tween-20、0.1% Triton X-100在1/3 MTSB中真空浸渗10 min, 4°C孵育过夜。样品经乙醇脱水后包埋在3%琼脂糖中，用徕卡振动仪VT-1200S(德国徕卡)制备50 μm切片。样品用0.05 % wt/vol甲苯胺蓝染色5 s，在徕卡DM4000显微镜下分析(徕卡，德国)。GydF4y2Ba

统计方法GydF4y2Ba

韦尔奇的孤GydF4y2BaT.GydF4y2Ba- 如在R统计环境中实现（v.3.0.2）所实施的，用于比较木耳元素的数量。使用韦尔奇比较样品的基因表达GydF4y2BaT.GydF4y2Ba-test实现的是R(3.0.2)。数据分布正态性采用R(3.0.2)的Shapiro-Wilk检验。GydF4y2Ba

该工作得到了俄罗斯基础研究基础的补助金，15-04-00591,15-29-02737和15-34-20071，以及圣彼得堡州立大学1.38.676.2013。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 圣彼得堡州大学遗传学与生物技术系，圣彼得堡，199034，俄罗斯GydF4y2Ba

   Maria S.Gancheva，Irina E. Dodueva，Maria A. Lebedeva，Varvara E.Virogova，Alexandr A.Tkachenko＆Ludmila A. LutovaGydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba伊琳娜·德杜瓦GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

MG构造的载体GydF4y2Barscle.GydF4y2Ba过表达的基因，进行GydF4y2Ba答:rhizogenesGydF4y2Ba介导的植物转化和组织学研究，ID进行了克隆和QRT-PCRGydF4y2Barscle.GydF4y2Ba基因，ML处理的萝卜植物与Cle peptides，VT和ID分析了数据并起草了手稿，在进行了统计分析并修订了稿件，LL计划实验，监督研究并修订了稿件。所有作者均阅读并批准了手稿。GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。GydF4y2Ba

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