哈萨克斯春季大麦线茎锈抗性的基因组

背景

茎锈病（SR）是哈萨克斯坦最具经济破坏性的大麦病害之一，在某些年份，它造成高达50%的产量损失。哈萨克斯坦所有育种站几乎都在进行常规的抗茎锈病育种。然而，哈萨克斯坦尚未采用基于分子标记的方法鉴定新的SR抗性基因和相关标记辅助选择。在本研究中，作为一个初步步骤，GWAS（全基因组关联研究）作图被应用于试图识别可靠的SNP标记和与SR抗性相关的数量性状位点（QTL）。

结果

大麦收集92个商业品种和有前途的线条使用高通量单核苷酸多态性（9,000 snP）Illumina Iselect阵列进行基因分型。9,000总量的6,970个SNP是多态和可批量的。超过6,970的SNP，通过过滤阈值6,970个，用于关联映射（AM）。通过观察哈萨克斯坦的Dzhamb地区的生物安全问题研究所的人工感染的地块中的成人植物，所有92种患者对SR进行了表型。GLM分析允许鉴定与出头时间（HA）相的电阻相关的15个SNP，以及种子乳状蜡状成熟度（SM）相的2个SNP。然而，在施加5％Bonferroni多次测试校正之后，在HA阶段仅在染色体的相同位置的2个SNP可以将其索赔是可靠的Sr电阻标记。在Bonferroni校正后的MLM分析没有揭示本研究中的任何关联，尽管定量定位量（QQ）绘图中的分配线表示由于Q和K矩阵使用而导致的测试中的过度矫正。

结论

获得的数据表明，来自哈萨克斯坦的92春麦基大麦的基因组宽基因分型具有9 k Illumina SNP阵列的高效。连接不平衡的映射方法允许鉴定染色体染色体的生长的HA阶段的SR电阻高显着QTL。另一方面，在SM相时没有检测到显着的QTL，假设对于成功的Gwasmapping实验，应测试具有更多样化的遗传背景的更大尺寸的群体。获得的结果提供了更好地了解大麦的SR阻力的额外信息。

大麦是哈萨克斯坦谷物作物最重要的第二颗谷物产量超过2毫升的谷物[1]. 引起SR的原因Puccinia graminis.f . sp。Tritici那PGT，是影响哈萨克斯坦大麦生产的最强大因素之一。有时年产损失超过50％[2］．目前，已知有6种基因可以使大麦产生抗性Pgt在美国，包括很好的特征RPG1.[3.那4.]，RPG4.[5.]， 和RPG5.[6.那7.]，研究较少RPG2，RPG3，和RPG6.[8.］．这些基因研究大部分都是在北美进行的Pgt通过使用常规的双重父母遗传映射方法，病原体比赛MCCF和QCCJ。此外，为应对新的和高传染性种族的严重威胁Pgt（TTKSK）在非洲和近东附近，也称为UG99，Steffenson与合色师能够识别定性Pgt- 染色体长臂上的ttsk基因座5h [9.］．此外，莫斯科与合著者[10.]结果表明，双亲本群体研究中的高通量基因分型是鉴定与TTKSK抗性相关的新QTL的高效工具。还得出结论，染色体2H上的热点协调了最大的接种特异性反应，以增强对TTKSK小种的抗性[10.］．

针对谷物中已知和新型的其他方法的方法是基于AM和GWA扫描的高吞吐量平台[11.］．在大麦中，有几条报告展示了在定量形态特征的遗传研究中的高效率[12.]非生物胁迫耐受性[13.]，疾病抵抗[14.]和谷物质量[15.］．尽管有一些负面结果[16.那17.AM可以作为一种合适的方法来鉴定控制农艺重要性状的新基因，特别是在新的环境中。

在哈萨克斯坦，对茎秆锈病抗性的遗传方面的研究并不充分。春季两棱大麦占全国大麦总产量的90%以上。目前，尽管常规使用传统育种程序，但没有关于该地区病原体种类分类的数据[2]到目前为止，还没有人试图鉴定有价值的基因及其潜在的DNA标记，以便在抗SR地方育种计划中应用标记辅助选择。本研究的主要目的是在人工侵染的田间小区中，基于AM对本地二棱春大麦品系进行SR抗性相关QTL的遗传定位。

基于SNP标记的大麦收集遗传变异

来自哈萨克斯坦的92个春季大麦广场（附加文件1)，采用包含7842个SNP的9k SNP iSelect序列进行基因分型。基因分型显示6970个有评分的SNPs(88.9%)，其中72.85%为突变，27.15%为转位。经过SNP数据集的质量控制过滤后，筛选出5050个SNP(64.4%的成功率)进行进一步分析。每个标记的染色体位置可以从http://bioinf.hutton.ac.uk/iselect/app/index.pl.苏格兰詹姆斯胡顿学院的研究。该网站提供3,129个标记的染色体位置的信息，同时剩余1,921个SNP是具有未知（U）位置的标记。可以从Triticeae Toolbox网站检索每个标记的其他信息（https：//triticeAetoolbox.org.)．基于映射标记物之间的遗传距离的全基因组的总遗传长度为990.9cm。具有已知位置的每种染色体每种染色体的SNP的数量在染色体上的染色体1H和4H至608上范围为5H，并表明每个标记的平均覆盖率为0.33厘米。

使用结构包来研究集合的子组[18.]ΔK（ΔK）[19.，这表明92个选定的大麦品系由3个聚类组成，如图所示。1。用于平均总人口的遗传变异（Nei的指数）为0.26，单个簇在簇1中的簇2至0.41中的0.03（表1)．集群中的大部分换乘我是从所有六个繁殖站收集的加入的混合，而在群集II和III中，他们分别在哈萨克斯坦的南部和中心地区收集（附加档案1)．遗传变异的水平与我们小麦研究中报道的含量相当20.]. 分子方差分析显示，73%的变异发生在亚组内，27%的变异发生在亚组间，表明位置差异低于亚组内植物的差异。

与茎锈抗性相关的QTL的表型评估和GWAMAMED

表型评估Pgt在Ha和Sm阶段进行抗性。尽管有重大相关性（P.< 0.05)，这一结果对HA期和SM期的等位基因状态有很大的不满RPG1.基因（附加文件）1)．当等位基因时RPG1.转化为数值图，并与HA的抗性相关观察结果和SM相没有发现不相关。因此，在哈萨克斯坦，与美国相比，存在不同的病原体比赛。总的来说，大多数accessions（n = 85）表现出高抗性Pgt在HA，33次出现过的92个过程中，在生长的SM阶段显示出对病原体种群的完全抗性（附加文件1)．SM期的Shannon-Weiner遗传变异指数(4.01)显著高于HA期(1.91)。

GLM的数据分析允许在HA阶段检测十五个SNP，两台SNP明显与SM阶段的分数明显相关（表2，图。2)．然而，在应用Bonferroni多重测试校正5%后，只有两个位于6H染色体上的SNPs被鉴定为HA期。SM期群体的Shannon-Weiner遗传变异指数(4.01)显著高于HA期(1.91)，但SM期群体的Shannon-Weiner遗传变异指数与HA期无显著相关。将HA期经Bonferroni校正后鉴定的SNPs遗传放置在6H染色体的相同位置(表)2），表示存在一个重要的QTLPgtGLM实验中的抵抗力。使用MLM测试获得了甚至不那么令人愉快的结果。在HA阶段的MLM测试和不使用Q矩阵的结果显示出相同的结果并允许在染色体6h上鉴定相同的两个候选SNP（图。2)．但是，在SM阶段没有发现重大关联。此外，Bonferroni校正测试的应用（P. < 9.9036E-6) suggesting that there are no significant associations forPgtMLM实验中的抵抗力。另一方面，有趣的是，与MLM-QQ图相比，GLM测试中的QQ图显示了群体结构的较高校正效率（图。3.)．分布的PgtMLM-QQ图中的电阻分数从参考线偏斜到右侧，表明由于使用Q和K矩阵而在测试中的过度矫正。因此，GLM-QQ图中的分布评分为QTL对GLM测试显示的染色体6h的意义提供了合理的支持。

大麦植物以不同方式对茎锈病病原体侵犯作出反应，从而从产生有毒化学品和编程的细胞死亡[10,32]。依靠特定种族的病原体，防御机制也差异触发[5.-8.]. 因此，对不同环境中病原-宿主相互作用的研究有望为理解病原-宿主相互作用提供更好的证据Pgt大麦的电阻机制。

在哈萨克斯坦，春季大麦每年正在增长超过150万公顷，它是邻国最重要的出口商品之一。目前，哈萨克斯坦的春麦的平均粮食产量约为每公顷2.0吨[1]. 如此低的产量可以解释为来自非生物因素的强大压力，如干旱、高温和秋季暴雨，以及毁灭性大麦病原体的周期性入侵。在这个国家，茎锈病是大麦最有害和最普遍的真菌病害之一[2］．种植抗病大麦品种对减少茎锈病造成的产量损失的管理策略具有最充分和最积极的作用。传统的抗性育种是一个非常耗时和难以预料的挑战过程。因此，利用分子标记辅助茎秆锈病抗性的鉴定和选择是茎秆锈病抗性育种取得成功的关键。

大麦9K Illumina单核苷酸多态性阵列[21.]，它正积极用于各种GWAS映射项目[12.-15.]，是用于分子标记识别和发育的有前途的基因组工具之一。在这里，我们认为使用9 kIllumina SNP阵列的哈萨克斯坦的92春麦基大麦的基因组宽基因分型高效。成功率为88.9％与已发表报告的结果相当[22.］．遗传可变性水平与我们小麦基因分型研究中获得的相似[20.］．值得注意的是，研究人口的聚类使所有的加入分离成三个不同的亚组(表2)，其中簇II（n = 15） 显示出非常低的遗传变异水平，这很可能对我们在GWAS中的结果产生负面影响。

在这项研究中，Pgt在HA和SM阶段对成年植物进行抗性对成年植物进行表型。HA相的电阻分数对于检测早期活化的病原体相关分子图案可能是可能的重要性，这可以触发非特定的防御级联。另一方面，在生长的后期阶段的抗性，例如SM，对于鉴定关键抗性蛋白质来说是重要的[10.那23.那24.］．值得注意的是，尽管两种表型分数之间存在显着相关性（Pearson指数，P. < 0.05), the GWAS mapping scans showed different results (Fig.2)，支持了不同的基因可以在生长的不同阶段被激活的假设。然而，无论是GLM还是MLM的HA评分都可以在1H和6H染色体上鉴定QTL(表)2和3.），这些信号都不在SM阶段非常重要（表3.，图。2)．反之亦然，在染色体3h上SM阶段（GLM测试）的识别的次要QTL（表2）在HM阶段并不重要。因此，结果强调了在植物生长的不同阶段测试植物的抗性反应的重要性[23.那24.］．

总的来说，GWAS允许在两个生长阶段鉴定17个与抗SR相关的候选snp(见表)2). 使用5%的Bonferroni校正表明，6H内只有一个QTL适合本试验。然而，每个SNP标记的功能基因组学相关信息（表2）提供一些有趣的结果。例如，在Triticeae工具箱（https：//triticeAetoolbox.org.）显示SNP SCRI_RS_216088 ON 1H是Nb-arc结构域的一部分，其由植物中的许多R基因共享[21.］．因此，必须在更全面的研究中涉及更广泛的种质资源以及双重父母绘图群体来重新评估所有已识别的SNP的潜在意义。

在该研究中，随着MLM是一种统计学上更严格的方法，GLM和MLM测试可预测地显示出不同的结果，并且在施加Bonferroni校正后，在前模型中没有检测到明显的QTL。另一方面，由于使用K和Q矩阵，MLM-QQ图的结果清楚地显示了测试中的过度腐败。与此同时，GLM-QQ曲线显示几乎完美的分数分布，与0.75-1.50的区域中的参考线轻微偏差（图。3A)．这揭示了GLM扫描对诸如Sr抗性等复杂性状的候选基因的鉴定的重要性。因此，在该分析中，QQ图的评估表明，在GWAS中的一般和混合线性模型测试的重要性。使用MLM扫描未能识别任何重要的QTL是有必要利用更大的遗传背景的研究人群的较大尺寸的明确指示。

对SR的抵抗是哈萨克斯坦大麦籽粒产量增加的最严重问题。在这项研究中，我们使用9 k SNP Illumina阵列应用Gwasmapping方法，用于92个局部大麦的阵列和在不同生长阶段的SR阻力的表型分数。结果表明，使用9 k Illumina SNP阵列的哈萨克斯坦的春麦片的基因组宽基因分型高效。将进入与三个不同的亚组分开，总人口的遗传多样性水平与Alqudah与共同作者报告的结果相当[22.］．AM方法允许鉴定与相关的染色体染色体上的两个SNPPgt在HA阶段的抵抗力，但失败了检测SM阶段的任何关联。据推测，尽管有大量的SNP数据，所研究的92种附加是一种太多的样本，用于搜索特定环境中的SR电阻的强大QTL。QTL在HA阶段的鉴定的SNP的遗传位置与已知基因的染色体位置不一致，例如RPG1.那RPG4 / RPG5.那Pgt-ttksk，因此，它们可能是与SR阻力相关的新遗传因素。假设大麦的机制Pgt是由中亚常见的病原体种族触发的，特别是在哈萨克斯坦，结果为与耐药性相关的复杂问题提供了新的见解。

植物材料

92份二棱春大麦选自哈萨克斯坦六个不同的育种站，是更大的选集的一部分，此前在该国七个地区进行了田间试验研究[1］．该清单包括在哈萨克斯坦共和国的种子州立审判委员会（额外文件）1)．

茎锈病评价

在哈萨克斯坦的Dzhambul地区（43°31'n; 75°15e，海平面高743米的高度，平均降雨= 190 mm）进行了评价，进行了生物安全问题。植物在两个随机复制行中生长，行之间的距离30厘米。在分蘖期的春天中接种在春天的斑块，其中分离物的混合物代表中亚病原体最普遍的种族。为了分析感染的积累和高疾病压力，每五个实验地块都播种了普遍易感的品种。使用改性的Cobb规模进行了在航向时间和种子乳状 - 蜡成熟度阶段进行的茎生锈疾病的评估[25.，以及在附加文件中显示的两个重复的平均结果1. 抽穗期寄主对感染的反应用“R”或抗性（被黄化或坏死包围的小脲原体）评分MR“或中度耐药（中等大小的尿毒症，周围有黄化或坏死）MS“或中度易感（无黄化和坏死的中大型兼容尿毒症）；和“S”或易感（大的、相容的尿毒症，无黄化和坏死）。将平均SR电阻转换为0到4之间的数字，用作GWAS映射的响应系数。

DNA基因分型与遗传变异研究

用商业试剂盒（Qiagene，Ca，USA）从单个种子的单种子中提取和纯化DNA样品。将每个样品的DNA浓度调节至50ng / mL。所有样品都是基因分型RPG1.基因根据[3.那4.］．此外，使用大麦9,000 illumina Iselect SNP阵列进行基因分型进行基因分型[26.]在TritiaGenetics GmbH（Gatersleben，德国）。Illumina Infinium程序是根据制造商的协议进行的。使用Illumina Genome Studio软件（GS V2011.1）进行SNP基因型分析。使用Genalex 6.5进行人口遗传分析和主坐标分析[27.那28.］．

关联映射研究

SNP数据集使用10%截止值筛选缺失数据和具有次要等位基因频率的标记 ≥ GWAS考虑0.10。从k到k的假设组数 = 使用50000次磨合迭代和100000次记录的马尔可夫链迭代对1到10次进行评估。为了估计种群结构推断的抽样方差，对每个样本进行了五次独立运行K.。在结构收割机中分析来自结构的输出（ΔK）[19.]. 在决赛的基础上,K.值，开发了三个确定的聚类的q矩阵。利用5 050个信息性snp、GLM和MLM试验对92份供试材料茎秆锈病响应QTL进行GWASmapping [29.那30.]，并在Tassel 5包中实施[31.］．

问:

关联映射

GWAS：

基因组宽协会研究

Pgt：

Puccinia graminis.f . sp。Tritici

哈：

前往时间

SR:

茎锈病

SM:

种子成熟

SNP:

单核苷酸多态性

凯西:

血缘关系

r：

抵抗的

先生：

适度抵抗

多发性硬化症：

适度易感

S：

易受影响的

QTL：

数量性状位点

作者感谢哈萨克斯坦共和国教育和科学部提供的0518/GF3和0115RK02165赠款。

宣言

本文的出版由哈萨克斯坦共和国教育和科学部提供的0518/GF3和0115RK02165资助。

本文已作为一部分发布BMC植物生物学第16卷补充1,2015：来自Plantgen 2015年会议的所选文章：植物生物学。补充的完整内容可在线提供http://www.biomedcentral.com/bmcplantbiol./补编/16/S1。

从属关系

1. 植物生物技术研究所，阿拉木图，哈萨克斯坦

   Yerlan Turuspekov，Danara奥曼贝卡瓦夫＆萨勒阿比尔翁

2. 哈萨克斯坦的生物安全问题研究所，哈哈姆尔地区，Dzhambul Region

   Aralbek Rsaliev.

相应的作者

对应于Yerlan Turuspekov。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

YT和SA进行了实验设计。进行现场实验和表型分数。YT并确实进行了基因组宽关联分析。所有作者审查并促成了起草稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

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