中丝裂原活化蛋白激酶基因家族的全基因组鉴定Gossypium raimondii就及其同源系在四倍体栽培棉花中的功能

背景

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联在植物生长发育及生物和非生物胁迫反应中起着至关重要的作用。对棉花中MAPK基因家族的了解有限，对MAPK家族蛋白的系统研究尚未见报道。

结果

通过生物信息学同源性搜索，我们鉴定了28个MAPK基因Gossypium raimondii就基因组。这些MAPK成员锚定在11条染色体上G. Raimondii.，分布不均。系统发育分析表明，MAPK候选基因可分为4个已知的A、B、C和D组，含有TEY磷酸化位点（18个成员）的MAPK多于TDY基序（10个成员）。此外，本研究还鉴定了21个具有完全开放阅读框（ORFs）的MAPKs的cDNA序列g .分子在四倍体棉花中发现了13个新的MAPKs和8个同源的MAPKs。23个MAPK基因的表达模式揭示了它们在棉花营养和生殖生长的不同发育阶段以及在胁迫响应中的重要作用。利用烟草摇铃病毒诱导基因沉默(TRV-VIGS)的反向遗传学方法，进一步验证了该方法的有效性MPK9，MPK13和MPK25赋予对落叶分离物的抗性大丽叶黄萎病在棉花。沉默MPK9，MPK13和MPK25能显著增强棉花对该病菌的敏感性。

结论

本研究对28个丝裂原活化蛋白激酶基因进行了综合鉴定G. Raimondii.．验证了它们的系统发育关系，转录物表达模式和对各种压力源的反应。本研究提供了棉花中Mapks的第一次系统分析，一般地改善了我们对防御反应的理解，并使用Mapks奠定了未来作物改善的基础。

包括盐碱度、水分供应受限、极端温度和真菌病原体在内的胁迫因素严重限制了作物产量[1］．棉花是世界上最重要的天然纺织纤维和重要的油料作物。包括四倍体在内的四种棉花已被独立驯化g .分子l .(广告)₁和g .取得l .(广告)₂,二倍体G草本l . (₁),g . arboreuml . (₂）.其中异源四倍体陆地棉具有高产潜力和对不同环境的适应性等显著优势，占全球棉花产量的95%(全国棉花理事会，2012年)。http://www.cotton.org.econ/cropinfo/index.cfm）.维持受非生物和生物应力影响的世界的许多地区棉花生产增加之一涉及用于胁迫耐受性的挖掘关键基因。蛋白质磷酸化和去磷酸化是用于控制蜂窝功能响应外部信号的主要防御机制。丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）级联是对外部刺激的响应中涉及的通用信号通路之一[2] - [6］．MAPK级联由三个顺序激活的激酶组成，分别是MAP激酶激酶激酶(MAPKKK)、MAP激酶激酶(MAPKK)和MAP激酶(MAPK) [7］．MAPKs是一类特殊的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。作为MAPKKK-MAPKK-MAPK级联的最后一个组成部分，MAPK通过磷酸化各种下游靶点在真核生物细胞外刺激信号转导中起着至关重要的作用[8] - [10］．

根据氨基酸测序，MAPK包含丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化功能所必需的11个结构域(I-XI)，其中MAPK的第VII和第VIII个结构域保守性较好[11］．MAPKs在活性位点携带thrl - glu - tyr (TEY)或thrl - asp - tyr (TDY)磷酸化基序，根据TDY和TEY基序的存在可分为四大类(a、B、C和D) [12］．

近年来，许多利用分子和生化方法的研究表明，植物MAPKs在各种生物和非生物胁迫(包括伤害、病原体感染、温度、干旱和盐胁迫以及植物激素)的响应中发挥着重要作用[5]，[13]，[14］．利用全基因组扫描，MAPK基因家族已被系统地研究拟南芥［12,番茄15]，烟草[16)、小麦(17)、大米(18]和大豆[19］．在拟南芥，MPK3，MPK4和MPK6都与应激反应有关吗MPK3和MPK6依赖于水杨酸信号[7］．此外,MPK4和MPK6在拟南芥也与冷应激反应有关[20.］．关于MAPKs的研究在棉花中已有报道。GHMPK2和GbMPK3被不同的非生物胁迫上调，并可能在干旱和氧化应激耐受中发挥作用[21]，[22］．GHMPK6.在脱落酸诱导的过氧化氢酶e1和H₂O₂生产(23),而GhMPK6a负调节渗透胁迫和细菌感染[24］．两个额外的MAPKs,GHMPK7.和GhMPK16，参与植物防御反应和调节多种胁迫信号通路的某些成分[25]，[26］．尽管如此，我们对棉花Mapk基因家族的了解是有限的。

基因组测序项目的完成G. Raimondii.第一次发现MAPK家族成员在Gossypium.全基因组范围内的物种。在本研究中，我们鉴定了28个推测的MAPK基因G. Raimondii.分析了它们的序列系统发育、基因组结构、染色体定位和适应性进化。我们的数据，结合序列数据G. Raimondii.（http://www.phytozome.net)和NCBI数据库中不同棉花物种的est (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/），结果共鉴定出21个具有完整orf的MAPKs cDNA序列g .分子在四倍体棉花中发现了13个新的MAPKs和8个同源的MAPKs。研究了四倍体栽培棉花不同组织中MAPK基因的时空表达谱，以及对不同激素、温度和胁迫的响应。此外，我们还验证了三种MAPKs的功能作用Verticillium Dahlia.对棉花的反应诉dahliae抵抗。本研究为探索利用MAPKs提高棉花抗逆性提供了可能。

MAPK基因的全基因组鉴定及其染色体分布

鉴定MAPK基因G. Raimondii.， HMMER软件版本3.0 [27]和带有MAPK域的Pfam蛋白家族数据库(PF00069) [28]被用来屏蔽G. Raimondii.基因组数据库(http://www.phytozome.net)[29］．此外，我们使用了20拟南芥作为MAPK蛋白序列的直接查询，筛选出潜在的MAPK。这些预测的GrMAPK序列被FGENESH证实(http://www.softberry.com/berry.phtml)，并用ExPASy proteomics Server (http://www.expasy.ch/prosite/)[30.］．经过广泛的生物信息学分析G. Raimondii.在基因组数据库中，共鉴定了28个MAPK基因。此外，我们锚定了4种棉花的表达序列标签(EST)序列，陆地棉（GH），g .取得(Gb),g . arboreum（GA）和G. Raimondii.(Gr)，我们从GenBank EST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/）.共发现611条ESTs，其中68条来自G. Raimondii.422年,从g .分子, 51g .取得和70年从g . arboreum将这些Mapk成员匹配至少一个EST命中（e≤-10）。预计这些MAPK基因将蛋白质366至628个氨基酸编码，其分子量范围为42.35至71.5kDa和PIS的范围为5.13至9.32。

为了阐明这些MAPK基因的染色体分布，我们整合了13个支架G. Raimondii.基因组(命名为Chr01到Chr13)等。［31]利用先前报道的高密度异源四倍体栽培棉种间遗传图谱[32］．遗传图和棉花之间的共同性₅基因组分析表明，四倍体棉花的13条Dt染色体与棉花的13个支架存在同源性G. Raimondii.．我们重新排列了13个支架G. Raimondii.根据四倍体棉种相应的D1～D13染色体[32］．结果，28个候选MAPK基因与D的11个支架匹配₅基因组，除了相应的染色体D6和D13。我们指定的MPK1来MPK28根据染色体上同源物的顺序(图1）.这些MAPK基因的染色体分布模式是非随机的。例如，D2上有5个MAPKs，而D5和D12上各有4个MAPKs。其余成员也定位于不同的染色体:3个MAPKs分别出现在D3和D11上;D1、D7和D10上各有两个MAPKs;只有一个MAPK分别存在于D4、D8和D9。关于MAPK基因的信息，包括他们的基因名称，起源，染色体位置，等电点(pi)，分子量(MWs)和亚细胞定位，显示在附加文件1：表S1。

MAPK基因的分类、结构和变异Gossypium raimondii就

GrMAPK氨基酸序列比对显示，所有GrMAPK蛋白均包含11个结构域(I-XI;数字2）.GRMAPKS的TEY或TDY主题位于激酶子域VII和VIII之间的激活环中。所有GRMAPK蛋白序列含有四种类型的特殊子域，包括活性位点，ATP结合位点，底物结合位点和激活环（A圈）。系统发育分析表明，GRMAPK可以分为四个主要群（A，B，C和D），其中A群A，B组，六组，六组中的六个成员，D. D.S亚组A，B中的六组Grmapks。，C具有Thy-glu-tyr（Tey）和含有常见的对接（CD）域的短c末端，而序列D的序列D组成，而亚组D的那些具有THR-ASP-TYR（TDY）激活域，没有CD域，但具有相对长的C末端区域。

外显子/内含子结构分析进一步揭示了GrMAPK家族的分类(图3.）.GrMAPKsA组和B组表现出高度保守的外显子和内含子分布，包括6个保守长度的外显子和5个大小不同的内含子。C组的每个MAPK只包含两个大小相似的外显子，除了GrMPK25内含子更短。与这三个高度保守的组相比，D组的MAPKs表现出复杂的外显子和内含子分布;GrMPK2和GrMPK7有10个外显子,GrMPK22和GrMPK28有11个外显子，而其他外显子由九个外显子组成。

对MAPK基因的系统发育关系进行了系统的研究拟南芥［12,番茄15]，烟草[16)、小麦(17)、大米(18]和大豆[19］．在此，研究MAPK成员的进化关系G. Raimondii.和其他物种，20个MAPK基因拟南芥38岁的g·马克斯，17英寸o . sative和28G. Raimondii.，通过MEGA5.1对全部MAPK氨基酸序列进行最大似然法比对，构建一棵无根树[33］．不同物种的MAPK基因信息显示在附加文件中2：表S2。

系统发育分析表明，所有的MAPKs可分为A、B、C、D和E组(图)4）.有趣的是，更多Mapk成员来自拟南芥，g·马克斯和G. Raimondii.含有Tyy基序的Tey磷酸化位点。有12个大气，18 Gmmapks和18个包含Tey Motif的GRMAPKS，而八个大atapks，14 Gmmapks和10个Grmapks属于TDY组，但六个Gmmapks包含TQY MOTIF。相比之下，水稻基因组含有比Tyy磷酸化位点更多的Mapks;11 OsMapks具有TDY主题，但只有七个包含Tey图案。这些结果表明，包含Tey主题的Mapks可能在Dicot植物中发挥更重要的角色，而不是包含含有TDY主题的Mapks。MAPK基因之间的矫形关系G. Raimondii.，拟南芥，o .漂白亚麻纤维卷和g·马克斯是否显示在附加文件中3.:表S3。

最近的研究表明G. Raimondii.基因组至少经历了两轮全基因组复制[29]. 了解膨胀机制G. Raimondii.MAPK基因家族，通过基因组共时分析，研究了MAPK基因家族成员在11条染色体上的串联重复和片段重复事件。如图所示1， 28章19节G. Raimondii.MAPKs包括18个染色体间的片段重复事件和一个染色体内的串联重复事件(GrMPK16和GrMPK17）.此外，这些同源基因聚集在系统发育树中，具有相似的外显子-内含子结构。这些结果表明，片段复制事件在MAPK基因扩增中发挥了重要作用G. Raimondii.基因组。

中MAPK基因的克隆及表达分析g .分子acc。TM-1

基于预测的序列信息，我们通过设计基因特异性引物对MAPK基因进行PCR克隆(附加文件4:表S4)，并扩增特定组织的转录本g .分子我们最终获得了21个具有完整ORF（GenBank登录号：KM190106-KM190126）的MAPK cDNA序列，包括13个新的MAPK和8个先前报道的同源物，其中7个在陆地棉中，1个在海岛棉中（附加文件）1:表S1)。其他7个基因也有部分cDNA序列。

为了探索MAPKs可能的生理功能，我们设计了基因特异性的qRT-PCR引物(附加文件4:表S4)，阐明MAPK基因在四倍体棉花中的表达水平。总之，我们检测了23个MAPK基因在不同组织和器官中的表达模式g .分子acc。TM-1发育于3个不同时期(花后0天[dpa]、10天[dpa]和21天)，包括根、茎、叶、花瓣、花药、胚珠和纤维。如图所示5，不同组的MAPKs在不同组织和器官中表现出不同的表达模式，在一系列生理过程中观察到部分重叠。详细地，每个组织/器官的单个基因的表达模式显示在附加文件5：图S1。

第一，五个基因，包括MPK3，MPK6，MPK9和MPK13在A组MPK8在C组中，主要在营养器官和生殖器官中表达，以C组表达最高MPK8在所有的组织和器官中。第二,MPK16和MPK27(B组)在营养器官中优先表达;MPK16在所有器官中均有表达，并优先在根中表达，而MPK27结果表明，在叶组织中表达量最高，叶片中表达量是其他器官的10倍。第三，9个基因主要在生殖器官中表达。其中有四种基因，包括MPK10和MPK12在B组和MPK22和MPK24在纤维组织中表达量最高的5个基因，包括MPK14C组和MPK2，MPK7，MPK15和MPK28D组中，在花药、花瓣或两者中均有表达。另外两个基因，MPK5和MPK25C组在生殖器官中中度表达，在不同发育阶段纤维中优先表达。第四，五个基因，即。，MPK18在B组，MPK20和MPK23在C组，和MPK11和MPK19在D组中，在所有受测组织和器官中均表现出非常低的表达水平。这些结果表明，来自同一组或不同组的MAPK基因在不同组织中表现出差异但重叠的表达模式，说明同一组的基因可能具有不同的功能，而不同组的MAPK基因可能具有相同的功能。

不同应激相关信号下MAPKs的表达谱

为了研究MAPK基因在不同胁迫相关刺激下的作用，我们采用qRT-PCR方法检测了3种胁迫相关信号化合物(脱落酸[ABA]、水杨酸[SA]、茉莉酸[JA])或氧化应激诱导物[H]对MAPK基因表达丰度的影响₂O₂])。其中23个MAPKs被至少四种诱导剂中的一种诱导，表明MAPKs在信号通路中起重要作用。其中，10株在4种处理后均同时诱导并积累较高水平;其中10例由3种诱导剂诱导;一个基因由两个诱导剂和两个基因仅由四个诱导剂之一(图6）.进一步的细节，每个处理下的个体基因的表达模式显示在附加文件6：图S2。

在JA条件下，23个MAPKs显著诱导。然而，四组的MAPKs表现出不同的表达模式改变。A、B组和C组大部分基因的转录水平显著升高，在处理后8 h达到峰值，而MPK14和MPK20(C组)显著升高，并在2h和4h分别达到两个峰值。D组其他MAPK基因的表达水平显著升高，在不同时间点迅速达到峰值。

在h后显着上调二十一个MAPK基因₂O₂治疗。此外,MPK6诱导后，其表达量分别在8 h和12 h达到两个峰值。其他基因明显调节,达到10 h的最高水平的治疗,包括三个基因在A组,五在B组,五在C组,和7在D组,15 MAPK基因,包括三个组,两个在B组,四个在C组,和六个在D组,有显著调节ABA处理后,使用不同的表达模式。最后，有15个MAPK基因在SA治疗后显著上调。共诱导6个MAPKs，其中A组4个，C组和D组各1个，在6或8 h出现峰值，而B、C和D组各3个基因在其他时间点均达到峰值。

迈克克斯响应非生物应激的表达谱

为了探讨MAPK基因在不同非生物胁迫条件下的作用，我们采用qRT-PCR方法检测了盐度、干旱、寒冷、炎热和伤害5种胁迫处理后MAPK基因的表达差异。如图所示7， 22个MAPK基因的转录水平在NaCl处理后显著升高。除了MPK5，MPK9和MPK14A、B、C组MAPK基因均在4 h诱导积累，D组所有成员均有诱导，但表达模式不同。每个处理下个体基因表达模式的详细信息显示在附加文件中7:图S3。

干旱处理下有11个MAPK基因被显著诱导，其中B组2个，C组4个，D组5个。另外，低温处理（4℃）后，有23个MAPK基因被诱导并高表达，表达模式多样。除了MPK3所有MAPK基因均被诱导并高水平表达。此外，高温条件下诱导并高表达了21个MAPK基因。其中B组和C组各有2个基因表达上调，D组有5个基因表达上调，在治疗后10h达高峰，其余12个基因表达上调，在其他时间点达高峰。最后，剪叶诱导并上调了21个MAPK基因。其中A组3例，B、C组各5例，D组8例，均在不同时间点出现明显的诱导和峰值。

总而言之，检测到的23个MAPK基因被所有类型的非生物胁迫广泛诱导(表)1）.其中8个基因在5种非生物胁迫处理下均有较高水平的表达。13个和2个MAPK基因分别被4个和3个非生物胁迫诱导。这些表达模式表明MAPK基因具有多种生理功能，以帮助植物适应各种复杂的环境挑战。

MAPKs的Paralogs显示了不同的表达模式

为了调查这些重复的Paralog对是否具有相同的表达模式，我们将其表达谱系在不同的器官和不同的压力处理下进行了比较（表2）.在器官间，只有相关系数之间MPK8和MPK14大于0.5，表明这两个基因之间呈正相关且表达模式相似。然而，其他配对没有明显的正相关或负相关。值得注意的是，相关系数之间MPK20和MPK25低于−0.5，表明这两种基因的表达模式明显不同。比较分析表明，来自同一祖先的MAPKs同源基因在不同组织和器官中表达差异，表明这些基因是通过基因重复和表达差异进化而来的。

相关分析表明，胁迫相关信号有8个，非生物胁迫相关信号有7个，均大于0.5，表明胁迫下相关信号的表达呈正相关。不像MPK2-MPK7，MPK14-MPK25和MPK22-MPK28，四个并列句，即:MPK8-MPK20，MPK8-MPK23，MPK9-MPK13和MPK16-MPK27，在胁迫相关信号处理和非生物胁迫处理下均表现出明显的正相关关系，其他7个平行关系在一种或两种胁迫条件下均表现出正相关关系。综上所述，MAPKs可能在基因复制后保持了功能保护，以帮助植物应对不同的逆境，在棉花进化过程中发挥了广泛适应的主要作用。

三种MAPK基因在大丽叶黄萎病抗性，由TRV-VIGS决定

三个MAPKs,包括MPK9，MPK13和MPK25，被显着诱导后大丽叶黄萎病接种(图8a).成绩单水平MPK9和MPK13显著增加，在处理24 h时达到峰值。MPK25在接种24 h和48 h后表达量显著下降，96 h后表达量恢复到较高水平。

病毒诱导基因沉默(VIGS)已在棉花上成功应用[34] - [36］．为了进一步研究MPK9，MPK13和MPK25在诉dahliae我们构建了表达棉花内源基因的重组病毒，构建了TRV2:MPK9，TRV2：MPK13和TRV2：MPK25，以TRV1-TRV2作模拟处理。为了验证VIGS在棉花中的可靠性，我们沉默了一个指示基因，CLA1(CLOROPLASTOS ALTERADOS 1，编码1-脱氧-d -木酮糖-5-磷酸合酶)，产生具有光漂白表型的植物。出苗后8天，每个植株至少渗透15株，未处理的植株在相同的环境中生长，没有注射处理。两周后，所有接受治疗的患者均出现TRV2-浸润CLA1新出叶的漂白高度均匀(图8b). Real-time quantitative PCR证实，未经处理和模拟处理的植株表现出相同的高表达水平MPK9，MPK13和MPK25．然而，这三种基因的转录物在渗透的TRV2中表现出强烈的沉默：MPK9，TRV2：MPK13和TRV2：MPK25植物（P < 0.01）（图8c） 是的。

使用含有1×10的液体接种棉花幼苗⁷诉dahliae孢子。两周后，在靶基因沉默的植物中发现了茎和叶脉的自发损伤。4周后，患病植株的真叶出现了萎蔫(图9a).一般情况下，对照植株很少出现叶片萎蔫，病叶与健康叶的平均比例约为30%。然而，69.3%的MPK9-沉默植物严重感染诉大丽花，这与在易感对照植物中观察到的结果相似(g .分子简历。均棉1号，病株率为76.8%)。此外，63.75%的MPK13-silenced植物显示出严重的衰弱表型，54％MPK25-沉默植株在感染后表现出叶片萎蔫症状诉大丽花(图9b).这些结果表明沉默MPK9，MPK13和MPK25与病媒对照植株相比，基因沉默植株叶片萎蔫、黄化程度显著提高(P < 0.01)。总之,MPK9，MPK13和MPK25阻力的重要组成部分是什么诉大丽花棉花感染。

麦克马克人的特征G. Raimondii.MAPK基因的进化

通过对几种植物基因组的扫描，对MAPK家族基因进行了系统的研究拟南芥［12,番茄15]，烟草[16)、小麦(17)、大米(18]和大豆[19］．在目前的研究中，共有28个MAPKs来自G. Raimondii.已确认。这些MAPKs按其系统发育分支可分为A、B、C和D四类，与文献报道的相似拟南芥和o .漂白亚麻纤维卷［18]，[37］．我们还发现所有的MAPK蛋白都包含11个结构域(I-XI;数字1)，如前所述，MAPKs的TEY或TDY基序位于激酶VII和VIII亚结构域之间的激活环[12]，[38］．a，b和c的亚组具有Thr-glu-tyr（Tey）结构域，并且含有常见的对接（CD）结构域，其由序列[LHY] DXX [DE] EPXC组成，而那些子组D具有Thr-ASP-TYR（TDY）激活域，而没有CD域，但具有相对长的C末端区域，这也与先前的报告一致[39]，[40］．之前的研究，比如在拟南芥、烟草、番茄和大米，重点关注TEY MAPKs [2］．有趣的是,拟南芥，g·马克斯和G. Raimondii.含有更多的TEY磷酸化位点的MAPKs比TDY基元。相比之下,o .漂白亚麻纤维卷基因组含有比Tyy磷酸化位点更多的Mapks。我们建议在Dicot Plants中，带有Tyy主题的麦地拍比目剧比Mapks更重要的角色。

棉花与其他植物的系统发育分析表明，A、B和C中的GrMAPKs基因可能来自同一祖先，而D MPAK基因可能是同源产物。grmppaks的分布是非随机的，这与之前的研究结果相似[41］．通过系统发育树分析，我们发现大量的MAPKs属于D亚组，这与文献中报道的相似拟南芥，米和杨树[12]，[18]，[41]，[42］．这些结果支持了之前的观点，即D亚群在单子叶/双子叶分裂前后有所扩大[41］．外显子系统结构的比较表明A，B和C组共享类似数量的外显子，外显子的长度比内含子更加保守。然而，D组中的成员具有更多的外显子，这些外显子和内含子的长度是多种多样的。同步分析G. Raimondii.基因组分析表明，MAPK家族主要是由片段复制引起的。

MAPKs的表达模式暗示了它们在植物生长发育过程中的功能差异

以前的研究表明，一些MAPK基因在各种植物中表现出组织特异性拟南芥、烟草、杨树、Brachypodium distachyon、小麦和芸苔属植物［17]，[37]，[43] - [46］．RsMPK2在营养器官和生殖器官中均有表达，表达模式不同[47］．TaMAPK13在所有组织中都有表达，但是Tampk15.只在花中低水平表达[17］．

在本研究中，我们观察了不同发育阶段营养器官(根、茎和叶)和生殖器官(花药、花瓣和纤维组织)中MAPKs的差异表达模式。5个基因在营养器官和生殖器官中均有高水平的组成性表达。其中2个基因在营养器官中表达量较高，其余基因在生殖器官中表达量较高。最近的一项研究证明了这一点AtMPK4在花粉发育的减数分裂中起重要作用[48］．PsMPK3参与果座，由赤霉素和细胞分裂素激活[49］．SlMPK3在雄蕊中显著高水平表达[15］．本研究中观察到的组织或器官特异性MAPK表达模式表明了它们在植物发育和生长过程中的功能差异。有趣的是，四个MAPK基因，MPK3，MPK6，MPK9,MPK13A组和MPK8在C组几乎所有检测组织中均有较高的表达，其实际功能值得进一步研究。

不同的MAPKs表达对应激相关信号和非生物应激的响应

寒冷、干旱和病原体等非生物和生物胁迫严重影响棉花的生长和产量，棉花对这些胁迫响应的分子机制一直是研究的重点。目前，越来越多的研究表明MAPKs可以调控植物的生长发育和对非生物/生物胁迫的响应。在棉花,GHMPK2和GbMPK3被不同的非生物胁迫上调，并可能在干旱和氧化应激耐受中发挥作用[21]，[22］．GHMPK6.在aba诱导的CAT1表达和H₂O₂生产(23),而GhMPK6a负调控对渗透胁迫和细菌感染的反应[24］．GHMPK7.和GhMPK16参与植物防御反应和调节多种胁迫信号通路的某些成分[25]，[26]. 大量研究表明，MAPKs不仅参与非生物胁迫和生物反应，而且参与植物发育和激素信号转导。Vlot及其同事（2009）认为SA可以调节对生物营养性病原体和系统获得性抗性的反应，而JA则介导对坏死滋养细胞的反应[50］．最近的研究表明ABA与盐度和干旱反应有关[51］．H₂O₂可诱导植物细胞内氧化爆发或活性氧(ROS)的积累。ROS可能通过直接杀死入侵的病原体或激活细胞壁交联和木质化，进而增强细胞壁以帮助限制病原体感染来促进抗性[52］．

系统分析了MAPK基因在逆境信号处理下的表达模式，结果表明，23个MAPK基因中有10个（43.5%）是由4种诱导剂诱导的。其中10个（43.5%）和1个（4.3%）分别由3种和2种诱导剂诱导。四种诱导剂中只有一种诱导了两个基因（8.7%）。越来越多的证据表明，植物的系统防御反应是由相互拮抗的激素JA和SA控制的。结果表明，所有MAPK基因均在JA处理下诱导表达，其中15个基因同时被SA诱导表达。这一发现表明这些基因由JA和SA共同调控，并强调了MAPK基因可能在植物防御反应中起关键作用的观点。此外，非生物胁迫下的基因表达模式显示，23个MAPK基因中有8个（34.8%）被5种非生物胁迫上调。有13个（56.5%）和2个（8.7%）分别被4个或3个应激源上调。本研究结果进一步证明MAPKs参与了棉花对环境胁迫的响应。

以前的报告显示，每种激素信号通路都有助于形成一个互动网络，协调对不同压力的反应[53］．此外，非生物胁迫调节基因以aba依赖或独立的方式发挥作用，SA可以调节对生物营养病原体的反应和系统获得抗性。在15个aba调控的MAPK基因中，有10个也受SA调控。此外，我们的数据表明，8个MAPK基因被5种应激源上调，也被JA和H诱导₂O₂．其中5个基因被4个胁迫相关信号同时诱导。MAPK基因对不同应激源和激素的广泛诱导表明，MAPK基因在应激耐受过程中激素信号通路中发挥重要作用。

基因复制之后是功能多样化。对同源基因表达模式的比较表明，大多数(但不是全部)这些基因对各种激素和非生物处理表现出相似的反应。例如,MPK9-MPK13，MPK16-MPK27，MPK8-MPK20和MPK8-MPK23Paralogs对激素和非生物处理均表现出相似的反应。的假字MPK5至MPK14，MPK8-MPK14，MPK10-MPK16和MPK10-MPK27响应荷尔蒙和伞病呈现类似的表达模式MPK8-MPK25, MPK20-MPK23和MPK20-MPK25在非生物胁迫下表现出相似的表达模式。我们的结果表明，这些MAPKs对在非生物处理和/或激素处理下分别具有相似的功能。对整个转录模式的检查表明，基因复制导致部分重叠功能;冗余功能的MAPK基因可能有利于保护细胞免受各种应激条件。另一方面，MAPK基因在不同器官和组织中也表现出了有趣的功能分化模式，这意味着MAPK基因可能在推动进化新颖性和适应新环境方面发挥了关键作用。

MPK9，MPK13和MPK25是需要抵抗的吗大丽叶黄萎病在棉花

基因表达模式通常是基因功能的一个指标。在本研究中，我们发现MAPK基因对生物和非生物胁迫均有响应，这表明它们在环境胁迫和病原体的响应中发挥着重要作用。verticillium Wilt.是严重影响棉花产量和品质的病害。

越来越多的证据表明，MAPK级联在病原体诱导的防御调节中起着重要作用。AtMPK3 / AtMPK6通过病原体激活并调节病原体防御响应途径，以及AtMPK3 / AtMPK6参与非生物应激反应(盐、干旱、寒冷、伤害)和激素信号通路[54]，[55］．OsMPK5也可由非生物胁迫、病原菌感染和ABA处理引起[56］．在棉花,GhMPK6a，GHMPK7.和GhMPK16参与了对病原体的抗性反应[24] - [26］．在这里，我们发现了MPK9，MPK13和MPK25在棉花根中的表达显著上调v大丽花，这三个基因在茉莉酸、茉莉酸和H₂O₂， ABA和SA。我们推测,MPK9，MPK13和MPK25参与调节病原体的反应。使用VIGS技术[34] - [36]我们进一步研究了MPK9，MPK13和MPK25在诉dahliae抵抗。统计分析表明，沉默MPK9，MPK13或MPK25提高了棉花的敏感性v大丽花。与其他两种基因相比，植物含有沉默的MPK9基因感染更严重诉大丽花,这意味着MPK9在…中起重要作用诉大丽花电阻在棉花。

基因序列共鉴定出28个GrMAPKsG. Raimondii.，和21个具有完全ORF的MAPK cDNA序列克隆g .分子．系统发育树分析和基序分析表明，GrMAPKs可分为4类，可与中国的GrMAPKs媲美拟南芥，o .漂白亚麻纤维卷和g . max。大多数MAPKs在营养器官和生殖器官中表现出不同的时空表达模式，在生物/非生物胁迫和胁迫相关信号处理下出现串扰。VIGS分析表明MPK9，MPK13和MPK25重要成分对棉花的抗性是什么诉dahliae感染。该研究为系统阐明MAPKs在棉花生长发育和对非生物胁迫响应中的重要作用，以及在棉花抗逆性育种中有效利用MAPKs提供了参考。

MAPK基因家族的预测、定位和分析

基因和蛋白质注释G. Raimondii.被下载http://www.phytozome.net．HMMER软件版本3.0 [27]和带有MAPK域的Pfam蛋白家族数据库(PF00069) [28)作为查询来筛选G. Raimondii.基因组数据库。表达四种棉花种类的序列标签（EST）序列，陆地棉（GH），g .取得(Gb),g . arboreum（GA）和G. Raimondii.（gr）从Genbank Est数据库下载（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/）.

MAPK基因的定位使用MapInspect (http://www.plantbreeding.wur.nl/UK/software_mapinspect.html）.通过将cDNA序列与相应的基因组DNA序列比对，确定GrMAPK基因的外显子/内含子结构。

保守域检测和亚细胞位置预测

利用INTERPROSCAN、SMART、MOTIF和PLANTSP程序检测保守结构域。如果给定的蛋白序列包含MAP激酶签名、PK结构域和atp结合结构域，则认为该蛋白是棉花MAPK家族的候选成员。各GrMAPK的亚细胞定位采用大提琴v2.5服务器(http://cello.life.nctu.edu.tw/)[57］．

序列比对和系统发育构建

使用ClustalX (ver.1.83)对MAPK结构域与28个氨基酸进行多序列比对[58]，利用MEGA 5.1 (MEGA 5.1)中的最大似然(ML)方法构建系统发育树。www.megasoftware.net)[33];用1,000份复制进行系统发育的自举试验。此外，来自四株植物的MAPK的氨基酸序列（拟南芥，o .漂白亚麻纤维卷，g·马克斯和G. Raimondii.）最初对齐并用于构建系统发育树。

植物材料和处理

g .分子采用陆地棉标准遗传品系L. acc TM-1进行组织/器官表达分析。这些植物是在正常的田间条件下种植的。在开花当天采集花瓣和花药，在选定的开花期后(dpa)从发育中的花蕾或铃中摘除胚珠和纤维。从两周大的幼苗上采集根、茎和叶。材料在液氮中快速冷冻，使用前储存在−70°C。

g .分子l .简历。采用耐非生物胁迫的金棉19进行非生物胁迫处理。棉花幼苗(g .分子l .简历。金棉19)在温室生长室内28°C条件下，16 h光/8 h暗循环生长。三周大的棉花幼苗进行以下处理。在信号物质处理方面，分别喷施100 μM JA、100 μM ABA、100 mM SA或10 mM H₂O₂(ddH₂o作为溶剂控制）。对于盐和干旱处理，分别用200mM NaCl和20％PEG灌溉棉幼苗的根（DDH₂O作为模拟控件）。对于温度胁迫处理，将幼苗置于高温（37℃）或低温（4℃）的生长室中；28°C（模拟）。用剪刀剪去幼苗叶片进行伤口处理。在所示的适当时间点采集叶片（在每个时间点采集三份样品[n = 3株），液氮冷冻，低温保存−70°C进行进一步分析。

g .取得l .简历。Hai7124,展品轮枝菌属抗性，用于真菌病原体（诉dahliae)接种。对海7124幼苗进行病原菌处理诉dahliae菌株V991分生孢子悬液含10⁷孢子ml.⁻¹．在适当的时间点采集根系，用液氮快速冷冻，使用前储存在−70°C。g .分子L简历。君棉1号，易受轮枝菌属，作为易感植物对照。

RNA分离和实时PCR分析

采用CTAB-酸性苯酚法从棉花幼苗叶片中提取总RNA[59］．然后用DNase I (Invitrogen，http://www.invitrogen.com/)，提取基因组DNA，取2 μg总RNA合成cDNA第一链。根据棉花MAPK基因序列，采用Beacon Designer 7.0设计实时荧光定量PCR引物。扩增片段长度为75 bp ~ 200 bp，退火温度为58°C ~ 60°C。棉花组蛋白3.（AF024716）基因作为参考基因[60］．

实时PCR的扩增反应在abi7500实时PCR系统（Applied Biosystems，USA）上进行，使用SYBR-Green（Bio-Rad，USA）和三个重复。扩增参数为：95℃变性10min，95℃变性40次15s，58～60℃退火15s，72℃延伸15s。对于熔化曲线阶段，选择默认设置。根据Livak和Schmittgen计算MAPK基因的表达水平[61］．

MAPK基因的克隆g .分子acc。TM-1

根据预测序列设计基因特异性引物，获得完整的编码序列。所有基因的引物对和最佳熔点列于附加文件中4:表S4;来自各种组织的转录本g .分子acc。采用TM-1进行扩增。采用高保真的ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa生物技术[大连]有限公司，中国)进行标准PCR反应。PCR产物按照生产商的说明书克隆到pMD18-T载体(TaKaRa)中，并从质粒DNA模板进行测序。每个基因至少随机挑选6个克隆并测序。将MAPK基因的cDNA序列与生物信息学分析得到的相应序列进行比对分析。

VIGS载体的构建与农业渗透

pTRV1和pTRV2 VIGS载体由美国德克萨斯A&M大学(College Station, TX, USA)的李波博士提供。构造包含以下片段:MPK9，一个501-bp的片段MPK9与47-538bp碱基相对应的cDNA片段；TRV2型：MPK13， 391 bp的dna片段MPK13与碱基位置43-434 bp和TRV2对应的cDNA片段:MPK25，一个392-bp片段MPK25与基位58-440 bp相对应的cDNA片段。这些片段通过PCR从TM-1 cDNA中扩增，引物包含TRV2的XbaI/XhoI酶位点:MPK9和TRV2的XBai / SACI站点：MPK13和TRV2：MPK25，分别插入TRV2。用于构建包含三个MAPK基因的VIGS载体的引物列于附加文件中4:表S4。控制载体pTRV2-GhCLA1是南京农业大学王新宇博士的善意礼物。

含有TRV1、TRV2、TRV2的质粒:MPK9，TRV2：MPK13和TRV2：MPK25分别被引入根癌土壤杆菌应变GV3101。携带重组TRV载体的农杆菌培养物在含50 μg/mL卡那霉素和25 μg/mL利福平的LB培养基中28°C培养过夜。将培养物接种于50 mL LB培养基(50 μg/mL卡那霉素，25 μg/mL利福平)中，浓度为1:100，摇匀培养至28℃，OD值为0.5。1180 × g室温离心5 min，在10 mM MgCl浸润介质中重悬₂，10 mM MES和200μM乙酰丁香酮）。

细胞悬浮液在室温下培养3小时，然后农杆菌GV3101携带TRV1和TRV2：MPK9/13/25用1 mL无针注射器按1:1的比例渗透到8日龄棉花幼苗(Hai7124)的两个完全展开的子叶中，以均棉1号为敏感对照。在模拟处理和技术对照中，用1:1的含TRV1和TRV2的农杆菌或TRV1和TRV2的农杆菌混合物浸润同一株植物:CLA1,分别。在23/22℃(白天/晚上)的生长室内，16小时光照/8小时黑暗周期生长4周，然后用于检测。未经处理的植物在相同的条件下生长，但没有受伤。VIGS实验至少重复3次，每次重复超过16株植物。

病原体接种

V991的落叶分离诉dahliae在室温(25°C)下马铃薯葡萄糖琼脂上培养4 d，然后在25°C Czapek培养基中培养5 d⁷分生孢子毫升⁻¹用于棉花苗浸染接种。

本课题由国家自然科学基金(31171590)、国家转基因计划(2011ZX08005-004)、江苏省农业科技创新基金(CX(14)2065)、PAPD-JHEI和jic - mcp资助。

支持数据

GrMAPKs从基因组中鉴定出来G. Raimondii.下载http://www.phytozome.net(附加文件1：表S1）。MAPK基因（来自拟南芥，o .漂白亚麻纤维卷，g·马克斯用于在系统发育分析中使用的基因ID和蛋白质序列在附加文件中使用2：表S2。多序列对准和系统发育树可从TreeBase获得（http://www.cotton.org/econ/cropinfo/index.cfm）.

隶属关系

1. 南京农业大学，作物遗传与种质创新国家重点实验室，杂交棉花研发工程研究中心，江苏南京，210095

   张雪英，王利满，徐晓阳，蔡彩平，郭王珍

相应的作者

通信Wangzhen郭．

利益争夺

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

实验采用WZG设计。实验采用XYZ、LMW、XYX和CPC进行。XYZ和WZG起草了手稿，WZG修改了手稿。所有作者阅读并批准最终稿件。

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