豌豆微卫星的大规模开发(Lathyrus巨大成功L.)，一种生长在干旱地区的孤儿豆科植物

背景

Grasspea (Lathyrus巨大成功L. (2n = 14)是豆科植物(Leguminosae)的一员，因其对干旱、洪涝、盐碱等非生物胁迫具有极强的抗逆性，在干旱地区作为粮食和饲料豆科作物具有巨大的农艺潜力。过去，通过传统的育种方法无法取得很大进展，而且由于缺乏能够代表整个基因组的可靠分子标记，几乎没有详细的分子生物学研究。

结果

利用454 FLX钛高通量测序技术，共鉴定出651,827个SSR位点，成功设计了50,144对非冗余引物，随机抽取288对进行验证l .巨大成功和一个l . cicera来源多样的作品。多态性74例，单态70例，无PCR产物144例。观察到的等位基因数为2 ~ 5个，杂合度为0 ~ 0.9545,Shannon信息指数为0.1013 ~ 1.0980。基于Nei遗传距离的非加权对群算法(UPGMA)构建的树状图显示24份材料之间存在明显的差异和清晰的关系。

结论

本研究开发的大量SSR引物对豌豆基因组学的改良具有重要意义。

Grasspea (Lathyrus巨大成功L.)是干旱地区为人类饲料和动物饲料提供蛋白质和淀粉的优良候选作物[1］．它是最能适应气候变化的作物之一，因为它能在干旱、洪水和盐碱化中生存[2］．它在许多低投入农业系统中也起着至关重要的作用[3.］．然而，一些不良的特征，如匍匐茎、不确定生长、结荚、成熟较晚、存在神经毒素、β- n -草酸- l -α、β-二氨基丙酸(β-ODAP)等，限制了其在各种农业生态条件下的种植[4- - - - - -6］．

迄今为止，发表的草类微卫星(microsatellite, SSR)标记不足205个，其中只有61个具有大小多态性特征[7- - - - - -9］．Lioi等人，[7]通过欧洲分子生物学实验室(EMBL)核苷酸序列数据库寻找SSRs的存在。20条引物中有10条成功扩增，其中只有6条表现出大小多态性。此外，Ponnaiah等人，[8]在国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中寻找EST-SSRs。19个中的7个LathyrusEST-SSRs和24个中的4个MedicagoEST-SSRs在筛选时显示多态性l .巨大成功登记入册(8］．孙等人，[9]共分析了8880份Lathyrus利用NCBI数据库(截止到2011年3月)对24份禾草种质进行EST-SSR鉴定，并设计引物进行大小多态性分析。其中多态性标记44个，单态标记117个，无条带标记139个[9］．Lioi对400个随机选择的克隆进行测序，得到119个含有SSR的序列。在随机选取的10个SSR引物中，7对引物产生了清晰的条带，SSR标记在3个近缘种之间的可转移性较高Lathyrus,即叶蝉，Lathyrus ochrus和Lathyrus tingitanus，豆类作物，Pisum一［10］．

新一代测序(NGS)技术以前所未有的速度成功测序DNA，从而取得了令人印象深刻的科学成就和新颖的生物应用，因而广受欢迎[11，12］．下一代RNA测序(RNA- seq)正在迅速取代微阵列技术，成为全转录组研究的首选技术[13］．RNA-Seq还提供了比其他方法更精确的转录本水平及其亚型的测量[14］．然而，很少有研究仅仅关注通过下一代测序发现孤儿作物的高通量新微卫星标记[15- - - - - -19］．

近年来，我们利用下一代测序技术，廉价高效地获得了高质量的SSR位点和侧翼引物序列。通过随机选择引物对23份豌豆种质及其直系祖先红豆的一份种质进行扩增，对新的SSR序列进行了表征和验证(叶蝉)作为外群体。

植物材料

八粒豌豆(l .巨大成功)的454份测序材料由2份中国、2份亚洲、1份非洲和3份欧洲材料组成。

一套二十三只草(l .巨大成功)和一颗红豌豆(l . cicera)在SSR标记检测和遗传多样性分析中使用。这些遗传资源中有6份来自中国，各7份来自亚洲(包括1份在内)l . cicera4个来自非洲。

种子样本来源于中国农业科学院作物科学研究所中国国家基因库。详细信息在附加文件中给出1S1:表。

DNA分离、文库制备和454测序

收集8个基因型的芽，用CTAB法从18°C黑暗条件下生长的7天幼苗中分离总基因组DNA。采用链霉亲和素包膜珠法进行选择性杂交，构建富ssr基因文库。使用了以下8种探针:p(AC)₁₀p (GA)₁₀p (AAC)₈p(亚美大陆煤层气有限公司)₈，p（AAT）₈p (ATGT)₆p(叫)₆和p (AAAT)₆．随机选择186个克隆并测序，进行文库质量控制。将DNA片段插入pGEM-T EASY载体，通过Sanger测序验证插入片段。如果库中插入片段的比例较高，且大部分片段长度在500 ~ 800之间，则认为是高质量的库。

利用北京欧特拉生物技术有限公司的454基因组测序FLX钛系统，将8个富含ssr的DNA文库平等地汇集起来进行焦磷酸测序。最后，454系统收集数据并生成包含所有读取原始数据的标准流程图文件(.sff)。然后,grasspea。sff文件提交至国家生物技术信息中心(NCBI)的序列读取档案(SRA)，注册号为SRX272771。

阅读描述

使用EMBOSS软件包中的Vectorstrip程序对所有高质量reads进行处理，以去除适配器连接的区域[20］．此外，我们利用内部开发的SeqTools.pl、ACGT.pl、ave_length.pl、max.pl等程序分析了所有reads中核苷酸A、T、C、G的总数量，所有reads序列的平均长度，以及我们研究中的最大reads长度。

SSRs的搜索

在SSRs搜索之前，使用CD-HIT程序(http://weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit/）.利用MISA (Microsatellite identification)工具(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/). 参数如下：最小SSR基序长度为10bp，重复长度为mono-10、di-6、tri-5、tetra-5、penta-5和hexa-5，一个复合序列中两个不同的SSR之间允许的最大中断大小为100bp。

SSR特征

对剧中文件被用来分析包含SSRs的组合数,发现SSRs的数量,SSRs的数量在200年开始读序列的英国石油公司,在mono - SSR图案的主要类型,di,三,四,五,六,重复和单一的比率,完美复合,打断了复合SSRs的。这些特征是通过对MISA文件的统计分析获得的[21]由一个小Perl程序，并绘制由R语言[22]和OpenOffice.org Calc。

设计引物对

引物对由包含p3_in.pl的Primer 3.0接口模块设计23]和p3_out.pl文件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/primer3.html）.这些Perl脚本用于规范格式，以设计引物侧翼的微卫星位点。扩增产物大小从100到300 bp不等。然后，使用内部开发的脚本primer_random_pick.pl来获得非冗余引物。

聚合酶链反应（PCR）扩增

对每对引物进行两次pcr，每次使用不同的Taq酶和反应缓冲液。所有引物均在第一轮实验中扩增，反应体积为20 μl，含0.5 U TaKaRa Taq聚合酶(编码:No. 5)。: R001A, TaKaRa，大连，中国)，2 μl 10 × PCR缓冲液(Mg²⁺0.2 μl dNTP(每个2.5 mM)， 0.4 μM引物，50 ng基因组DNA。采用TAKaRa LA Taq聚合酶和GC buffer (Code no .)进行第二轮PCR反应。: RR02AG, TaKaRa，大连，中国)根据制造商说明。用黑金港热循环仪(Eastwin，中国北京)扩增SSRs。在以下条件下:95℃初始变性5分钟;35个循环，在95℃下30s，在优化退火温度下30s1)用6%变性聚丙烯酰胺凝胶检测PCR产物的多态性，并用硝酸银染色观察。

不同材料多态性引物的评价

随机选取288个SSR标记对23个草种(l .巨大成功)和一颗红豌豆(l . cicera)基因型。POPGEN1.32 [24]软件计算观察到的等位基因数(Na)，观察杂合度水平(何)和香农信息索引(我）.

遗传多样性分析

聚类分析基于Nei’s [25]利用POPGEN1.32 [24软件采用了算术平均(UPGMA)算法上的非加权对组法。所得到的簇以MEGA4绘制的树状图表示[26］．

图书馆建设中的质量控制

对186个随机选择的草种克隆进行测序，检测草种SSR文库的质量。结果表明，重组率为95%，29条序列包含89个SSR基序。

454条测序和鉴定reads

罗氏454 GS FLX Titanium平台共生成493364条reads。移除适配器后，370,079个reads序列用于进一步分析。最常见的核苷酸是胸腺嘧啶，占总核苷酸的27.7%，其次是腺苷(27.2%)、鸟嘌呤(22.2%)和胞嘧啶(22.1%)。平均GC含量为44.3%。读取序列的平均长度为453 bp，最大长度为1162 bp(图)1）.

SSRs(简单序列重复)挖掘

首先，我们采用了CD-HIT (http://weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit/)生成一组280,791个非冗余代表性序列。然后，微卫星识别工具(MISA) (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)用于微卫星采矿。结果在129,886条reads序列中鉴定出651,827条ssr。其中115,172条reads中含有1个以上SSR。以化合物形式出现的SSRs的数量为464,271(表1)2)，表明有较高比例的SSR位点(71.2%)位于复合重复中。大多数SSRs(65.4%)位于5’端200 bp以内，少数SSRs位于3’端(图1)2）.

SSR主题描述

鉴定的SSRs包括995(0.2%)单核苷酸重复基序、385,385(59.1%)二核苷酸重复基序、238,752(36.6%)三核苷酸重复基序、21,200(3.3%)四核苷酸重复基序、2,911(0.4%)五核苷酸重复基序和2,584(0.4%)六核苷酸重复基序(图)3.）.因此，95%以上的基序是二核苷酸和三核苷酸。重复motif类型最多的是(AC/GT)n次，其次是(AAC/GTT)n次，(AG/CT)n次，(ACG/CTG)n次，(ACGT/ATGC)n次2:图S1，附加文件3.:图S2附加文件4:图S3附加文件5:图S4，附加文件6：图S5，附加文件7: FigureS6)。

复合SSR分析

在我们的研究中，完美的SSRs(即CA)₈被命名为P2型)的频率相对较低(29.4%)，而复合SSRs的频率为70.6%。此外，还有两种复合ssr:两母题之间有中断的ssr(即(CT))。₈cacacg (CA)₉命名为C型);以及两个主题之间没有中断的(即(GT))₆(GTC)₆被命名为C* type)。共检测到123,444C型(93.2%)和8,989C*型(6.8%)复合SSRs，提示该草基因组具有复杂性。

设计引物对

使用公共共享软件primer 3.0 (http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html)，根据熔化温度、气相色谱含量和缺乏二次结构的标准。此外，50144个非冗余引物由内部开发的程序实现(附加文件8:表S2)。

SSR标记的验证

为验证SSR序列，随机选取288对SSR引物对23株草(l .巨大成功)和一颗红豌豆(l . cicera)基因型。经过两轮PCR扩增，74对引物能够扩增24种基因型的多态性(表1)1)， 70对引物确认只扩增出单态片段，144对引物未扩增出产物。观察到的等位基因数目(Na)从2到5不等，观察到的杂合度(何)，从0到0.9545,Shannon信息索引(我)范围为0.1013至1.0980(见表3.）.这些结果表明，从下一代测序中获得的SSR标记在今后的草类遗传学研究中具有广泛的应用价值。

遗传多样性研究

目的:评价微卫星在细胞分化中的作用l .巨大成功从其他Lathyrus物种，我们选择了一个l . cicera在遗传多样性研究中作为外群加入(ELS 0246，叙利亚)基于Nei’s的聚类分析[25]遗传距离表明之间分离良好l .巨大成功和l . cicera．此外，UPGMA程序将大多数中国品种归为一类;由于来自原产地中心，除中国聚类外，地中海地区的栽培草种的遗传多样性主要分布在各地(图1)4）.这些结果完全验证了利用NGS技术开发草地SSR标记的准确性和有效性。

草是干旱地区潜在的重要作物

频繁的干旱和缺水是世界性的问题，特别是对农业生产。旱地农业在国民经济和粮食安全中发挥着重要作用。例如，在中国，55%的可耕地和43%的粮食供应与旱地农业有关。草皮在边际地区的资源贫乏的农民中很受欢迎，因为它可以在不需要太多生产投入的不利农业气候条件下成功种植。目前在全球范围内，它的种植面积为150万公顷，产量为120万吨[2]. 近年来，包括中国、澳大利亚、西班牙、意大利和加拿大在内的许多国家都在努力扩大种植，将其作为谷类作物之间的中间作物和休耕地的额外作物，因为这种作物能够固定大量的大气氮，并与其他作物相结合根瘤菌细菌(7］．然而，存在一种神经毒素，β- n -草酰- l -α，β-二氨基丙酸(β-ODAP)，使这种作物被忽视和未充分利用。草虽然具有高神经毒素等不良特征，但在我国西部和世界其他干旱地区具有重要的发展潜力。

利用454焦磷酸测序技术挖掘基因组SSR位点

传统的微卫星开发方法采用基于库的定向SSR重复基元方法，费时、昂贵、低通量。狩猎在网上基于公共数据库的est - ssr检索方法是一种经济有效、易于获取的替代方法。然而，由于对草类的分子研究较少，草类及其相关物种ESTs的总数非常有限。

利用454焦磷酸测序技术从基因组DNA中鉴定SSRs是一项相对较新的技术，已有两种策略发表。这些是散弹枪测序[16- - - - - -18]和富ssr测序[15，19］．本研究采用ssr富集测序技术，获得370,079个优质草基因组reads，平均长度为453 bp。从理论上讲，较长的reads将增加我们成功设计引物对的机会，同时使我们能够识别与传统基于库的方法获得的长度相当的长SSR重复序列[18，27］．根据MISA分析，从129886条reads中鉴定出651827条ssr。这是一个非常积极的结果，因为含有ssr的reads的高比率和我们获得的大量假定的ssr。其中，二核苷酸重复基序和三核苷酸重复基序占据了草的基因组序列，这与其他作物的研究结果相似[28]. (AC/GT）n不仅是主要的双核苷酸重复基序，而且是整个基因组中最常见的基序，占ssr总数的55.2%，其次是（AAC/GT）n、（AG/CT）n、（ACG/CTG）n，而（AT/TA）n、（CG/GC）n、（CCG/CGG）n在本研究中很少被检测到。这种模式与先前在蚕豆中观察到的模式相当相似[15］．此外，分离鉴定(AT/TA)n、(CG/GC)n、(CCG/CGG)n等不需要重复的基序比例较低，可以提高引物设计的成功率。

SSR新资源在“孤儿作物”草研究中的应用

近年来，传统育种和表型研究在农作物改良方面取得了很大进展。然而，由于缺乏可用的遗传和基因组资源，草被留下来作为“孤儿作物”[29］．利用SSR标记作为常规工具，在遗传多样性、遗传连锁图、QTL作图和关联作图等研究中发挥了重要作用，为基因组学在作物育种中的整合奠定了基础。

由于在草木等植物中缺乏易于使用、高度多态性的分子标记Lathyrus没有高密度的遗传图谱。本研究共检测288对非冗余SSR引物，144对(50.0%)SSR引物扩增出条带，其中多态条带74对，单态条带70对。这一庞大的基因组- ssr标记将有助于构建高分辨率定位克隆和QTL定位图谱。

属LathyrusL. (Fabaceae)由约160种组成[30分布在北半球的温带地区，并延伸到热带东非和南美洲[31，32]. 在本研究中，我们使用74对新的SSR引物对23对进行了清晰的分离 l .巨大成功登记入册从一个l . cicera这与文献报道的系统发育研究是一致的LathyrusL. (Fabaceae)的形态学和分子标记[7，31］．

本研究提供了广泛的表征SSRs在草基因组。首次获得了大量丰富的SSR序列数据，为SSR的鉴定和SSR标记的开发提供了基础和应用基因组学研究的基础。

我们感谢中国农业部在中国农业研究体系（CARS-09）项目、国际合作项目（2010DFR30620和2010DFB33340）下提供的资金支持，国家科技部国家研究计划（2013BAD01B03），并得到中国农业科学院农业科技创新计划（ASTIP）的支持。我们感谢王大海博士、孙丽萍博士和刘琦博士（北京奥拓生物技术有限公司）对这项工作的特殊贡献。我们还感谢咸付银博士（健康科学研究所，上海生物科学院，中国科学院和上海交通大学医学院）的SEQTooS.PL脚本。

作者指出

从属关系

1. 2 .中国农业科学院作物科学研究所/国家作物基因资源与遗传改良重点设施，北京100081

   杨涛，蒋俊业，孙雪莲，王芳，关建平，宗旭晓

2. 豆科作物遗传资源系，n.i.a Vavilov植物工业研究所，圣彼得堡，190,000，俄罗斯

   玛丽娜Burlyaeva

3. 美国农业部西部区域工厂介绍站(WRPIS)，美国WA普尔曼，99164

   胡金国和克拉丽斯J科因

4. 国际干旱地区农业研究中心(ICARDA)，阿勒颇，5466，叙利亚

   Shiv库马尔

5. 澳大利亚温带农田作物收集，粮食创新园，第一产业部，私人袋260，霍舍姆，维多利亚，3401，澳大利亚

   罗伯特脸红

6. 山西省农业科学院作物种质资源研究所/农业部黄土高原作物基因资源与种质创新重点实验室，山西太原030031

   张建武、郝晓鹏

相应的作者

对应到Xuxiao宗庆后．

相互竞争的利益

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

TY进行生物信息学分析，引物设计，并起草稿件。JYJ建立了SSR富集文库，并对SSR标记进行了检测。MB提供l .巨大成功登记入册。JGH, CJC, SKA和RR协助设计实验和编写稿件。XLS和FW参与了454例测序。JWC和XPH参与了DNA库的质量检验工作。JPG准备了所有的种子l .巨大成功．XXZ设计并协调研究，协助撰写稿件。所有作者阅读并批准最终稿件。

杨涛、蒋俊业对这项工作也做出了同样的贡献。

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